nad法检测血乳酸论文

xuè qīng rǔ suān tuō qīng méi

Lactic Dehydrogenase

乳酸脱氢酶（LDH或LD）是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，可催化丙酮酸与L乳酸之间的还原与氧化反应，也可催化相关的α酮酸。LDH广泛存在于人体组织中，以心、肾、骨骼肌含量最高，肝、脾、胰和肺组织次之，各组织的细胞浆内该酶活力为血清的500～1000倍，红细胞内酶活性为血清的100倍。LDH测定方法主要有比色法和连续监测法。

血液生化检查 > 酶类测定

血液

（1）比色法：LDH以NAD＋作氢的受体，催化乳酸脱氢，生成丙酮酸，后者与2，4二硝基苯肼作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液呈红色，根据颜色深浅求出酶活性。

（2）连续监测法：LDH可催化L乳酸生成丙酮酸，同时NAD＋还原成NADH，在340nm处吸光度的增高速率与酶活力成正比。

（1）比色法：

①底物缓冲液（含0.3mol/L乳酸锂，pH8.8）：取乳酸锂2.88g，二乙醇胺2.1g，加蒸馏水约80ml溶解，以1mol/L HCl调pH8.8，加水至100ml。

②11.3mmol/L辅酶Ⅰ（NAD）溶液：称氧化型辅酶Ⅰ 15mg，溶于20ml蒸馏水中，冰箱保存可用2周。

③1mmol/L 2，4二硝基苯肼（DNPH）溶液：称取DNPH 200mg，加10mol/L HCl 100ml，溶后加水至1000ml，置棕色瓶内室温保存。

④0.4mol/L NaOH溶液。

⑤1mmol/L丙酮酸标准液：称取丙酮酸钠（AR级）11.0mg，以底物缓冲液溶解并稀释至100ml，临用前配制。

（2）连续监测法：

①55mmol/L乳酸锂Tris缓冲液：称取乳酸锂5.28g，Tris 6.68g，溶于800ml蒸馏水中，在37℃水浴箱中用1mol/L HCl调pH至8.9（约需46ml），加水至1000ml，冰箱保存。

②12mmol/L NAD溶液：称取NAD 79.6mg，溶于10ml蒸馏水中，冰箱保存可用2周。

③基质应用液（含NAD 6mmol/L）：根据当天用量将上述NAD溶液和乳酸钾Tris缓冲液等量混合即可。商品试剂盒按其说明溶解，恢复至室温25℃使用。

（1）比色法：按表1操作。

混匀，室温放置5min后，在440nm波长，比色杯光径1.0cm，蒸馏水调零点，读取各管吸光度，以AUAC之差值查标准曲线，求出LDH活力单位。

附注：

①乳酸钾、乳酸钠也可作为LDH底物，但因其为水溶液，含量不够准确，且保存不当易产生酮酸类物质，抑制酶促反应。而乳酸锂为固体，稳定，易于称量。

②除二乙醇胺缓冲液外，也可用Tris或焦磷酸缓冲液，避免了原金氏法中甘氨酸缓冲液对LDH的抑制作用，提高了阳性检出率。

③比色应在5～15min内完成，否则吸光度降低。

④结果＞2500U时，可用生理盐水稀释标本后再测，其结果乘以稀释倍数。

（2）连续监测法：各实验室可根据本室生化自动仪型号及说明书操作。主要参数为340nm波长，37℃，吸样量500μl，连续监测时间60s，标本与试剂体积之比为1∶50。

附注：

①标本勿溶血，当溶血达Hb 0.8g/L时，LDH活性可升高58%。

②标本于室温（25℃）保存，2天内酶活性稳定，冰箱保存酶活性降低，－20℃过夜LDH3、LDH4则全部失活。

③用血清或肝素抗凝血浆测定结果满意，草酸盐可抑制LDH活性。

④复溶后溶液变浊或初始吸光度＞0.5应弃去。

⑤利用正逆双向反应均可测定乳酸脱氢酶活性，但因反应温度、底物和缓冲液浓度不同，其参考区间也有差异。以乳酸和NAD为底物，在340nm监测吸光度增高速率为正向反应，以LDL表示；以丙酮酸和NADH为底物，监测340nm吸光度下降速率为逆向反应，以LDP表示。正逆反应两法相比，LDL法的主要优点是：A.正向反应底物液的稳定性比逆向反应的稳定性大，前者冰箱可保存6个月以上，而后者仅几天；B.速率反应的线性范围（吸光度对监测时间t作图）较宽；C.重复性比LDP好。由于逆向反应速度比正向反应速度快，其参考值约为LDL的2倍。

（1）比色法：150～450U/L。

（2）连续监测法：男80～280U/L

女100～230U/L

LDH测定常用诊断心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤。

（1）心肌梗死：发病10～12h升高，24～48h达高峰，8～9天后恢复正常。与CK相比，虽然酶活性出现较迟，阳性率较低，但持续时间长，且活性增高的程度与心肌梗死的病情密切相关，梗死范围越大，其酶活性越高。若LDH增高后恢复迟缓，或在病程中再次增高，提示梗死范围扩大，预后不良。

（2）肝脏疾病：急性肝炎或慢性活动性肝炎LDH常显著或中度升高。其敏感度略低于ALT。肝癌时LDH活性明显升高，尤其是转移性肝癌增高更显著。可达1000U/L。

（3）血液病：白血病、巨幼红细胞贫血、恶性淋巴瘤等LDH活性升高。

（4）其他：营养不良、横纹肌损伤、胰腺炎、肺梗塞等LDH活性也升高。

临床上可根据酶浓度的变化用以辅助诊断。若酶浓度变化由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起，表示脏器或组织损伤；若为细胞内酶合成增加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌，或提示有恶性肿瘤的可能；若为酶排泄障碍引起者说明有梗阻存在。同工酶的分析与鉴定则能反应疾病的部位、性质和程度。一、转氨酶及其同工酶（一）生物化学特性转氨酶或称氨基转移酶是一组催化氨基在氨基酸与a-酮酸间转移的酶类，丙氨酸氨基转移酶（ALT）和（天）门冬氨酸氨基转移酶（AST）是其中最重要的两种，前者俗称为谷丙转氨酶（GPT），后者为谷草转氨酶（GOT）。（二）体内分布AST广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序为心、肝、骨骼肌和肾等，肝中70%存在于肝细胞线粒体中。AST有两种同工酶ASTs 和ASTm，分别存在于可溶性的细胞质和线粒体。细胞轻度损伤时ASTs 升高显著，而严重损伤时，则ASTm大量出现于血清中。正常血清所含AST的同工酶主要为ASTs，但在病理状态下，如细胞坏死，则血清中以ASTm为主。ALT大量存在于肝脏组织中，其次为肾、心、骨骼肌等。血清ALT活性升高，通常表示肝脏损伤。ALT有两种不同活性的同工酶a（ALTs）、b（ALTm），分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。肝细胞坏死血清中以ALTm为主。（三）测定方法转氨酶的测定方法有许多种，其中以赖氏法最常用，由于此法操作简便、经济，一些小型实验室仍在使用。目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。ALT速率法测定中酶偶联反应式为： ALTL-丙氨酸 + a-酮戊二酸 L-谷氨酸 + L-丙酮酸 LD 丙酮酸 + NADH + H+ L-乳酸 + NAD+ AST速率法测定中酶偶联反应式为： AST L-门冬氨酸 + a-酮戊二酸 草酰乙酸 + L-谷氨酸 MD 草酰乙酸 +NADH + H+ L-苹果酸 + NAD+ 上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比，可在340nm检测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-DA/min)，计算出ALT、AST的活力单位。（四）临床意义ALT是反映肝损伤的一个很灵敏的指标，临床上主要用于肝脏疾病的诊断。各种急性病毒性肝炎、药物或酒精中毒引起的急性肝损害时，血清ALT 水平可在临床症状（如黄疸）出现之前就急剧升高，且ALT＞AST。一般而言，急性肝炎时血清ALT高低与临床病情轻重相平行，且往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶，是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。假如能同时测定AST，并计算DeRitis比值，即AST/ALT之比，则对于急、慢性肝炎的诊断和鉴别诊断以及判断肝炎的转归也特别有价值。急性肝炎是时DeRitis比值＜1，肝硬化时DeRitis比值≥2，肝癌时DeRitis比值≥3。重症肝炎时由于大量肝细胞坏死，血中ALT逐渐下降，而胆红素却进行性升高，出现所谓“酶胆分离”现象，常是肝坏死的前兆。AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的诊断。AMI发病6～8h即升高，48～60h达到高峰，4d～5d恢复正常。但由于AST在AMI 时升高迟于CK，恢复早于LD，故诊断AMI价值不大。在急性肝炎时，AST虽亦显著升高，但升高程度不及ALT，而在慢性肝炎，特别是肝硬化时，AST升高程度超过ALT。胆道疾患时AST亦可升高。二、g-谷氨酰转移酶及其同工酶（一）生物化学特征g-谷氨酰转移酶（g-GT或GGT）又称g-谷氨酰转肽酶（g-GTP或GGTP），是一种含巯基的线粒体酶。组织分布以肾脏含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的g-GT则主要来自肝胆，红细胞中几乎无g-GT，因此溶血对其测定影响不大。（二）测定方法目前国内外多采用连续监测法测定血清g-GT活性。IFCC参考方法采用L-g-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺作为底物，以甘氨酰甘氨酸（双甘肽）作为g-谷氨酰基的受体。在pH7.7的条件下，g-GT催化底物生成g-谷氨酰双甘肽和黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，在410nm波长处直接连续监测，吸光度的增高速率与g-GT活性成正比关系。（三）临床意义g-GT是肝胆疾病检出阳性率最高的酶。g-GT 还可用于判断恶性肿瘤有无肝转移，肿瘤患者如有g-GT 的升高，常说明有肝转移。g-GT与乙醇的摄取量有关，对乙醇性中毒的判定有相当的价值。长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者常有g-GT升高。用醋纤膜电泳可将g-GT同工酶分为g-GT1、g-GT2、g-GT3和g-GT4四种，正常人只见g-GT2和g-GT3。重症肝胆疾病和肝癌时常有g-GT1出现，乙醇性肝坏死和胆总管结石时常有g-GT2增加，胆总管结石及胰腺炎时g-GT2也增加。g-GT4与胆红素增高密切相关。