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PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
2.1 实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
2.2 多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
2.3 单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
3.1 PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
3.2 PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
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你可以到生物帮啊，包含技术文档、视频、生物问答、在线交流核心版块都不不错的。资讯也挺丰富的。 标准的PCR过程分为三步 1.DNA变性(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2.退火(复性)(40℃-65℃)：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链。 3.延伸(68℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右最佳的活 性)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延 伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。. 循环参数 1、预变性(Initial denaturation). 模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。 2、引物退火(Primer annealing) 退火温度一般需要凭实验(经验)决定。 退火温度对PCR的特异性有较大影响。 3、引物延伸 引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。 延伸时间随扩增片段长短及所使用Taq酶的扩增效率而定。 4、循环中的变性步骤 循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性： 变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 5、循环数 大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。 6、最后延伸 在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 有空的话你可以自己去了解一下，应该会有帮助的。
团体标准T/CVMA 5—2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus中国兽医协会发布前言本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。1、范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。2、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3、试剂3.1 DNA提取试剂DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。3.2 2 × PCR缓冲液2 × PCR缓冲液的配制见附录A。3.3 引物探针3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'荧光探针ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。3.4 阴性及阳性对照阴性及阳性对照的制备方法见附录C。3.5 其他试剂消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。4、仪器和耗材分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。5、操作步骤5.1 样品采集及运输样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。5.2 样品处理检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。5.3 样品保存采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。5.4 病毒DNA提取5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。5.5 实时荧光PCR操作5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。5.5.2 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。6、结果判定6.1 结果分析条件设定实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。6.2 结果描述及判定当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。7、实验室生物安全要求7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。一附录 A (规范性附录) 试剂的配制A.1 DNA提取液1PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。A.2 DNA提取液21mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。A.3 2×PCR缓冲液灭菌去离子水 70 mL三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g氯化钾 1.865 g曲拉通X-100 0.5 mLdATP (100mmol/L) 2.5 mLdTTP (100mmol/L) 2.5 mLdGTP (100mmol/L) 2.5 mLdCTP (100mmol/L) 2.5 mL六水氯化镁 0.61 g盐酸 调pH至9.0灭菌去离子水 加至100 mLA.4 消毒液8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方A.5.1 A液0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。A.5.2 B液0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。A.6 无DNA酶的灭菌去离子水无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。二附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT三附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照C.1阳性对照阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。C.2 阴性对照阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。四附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方实时荧光PCR反应液配方见表D.1。表D.1 实时荧光PCR反应液配方组 分1个检测体系的加入量2×PCR 缓冲液a12.5μLdNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL上游引物（10 μmol/L）1.0 μL下游引物（10 μmol/L）1.0μL探针（10 μmol/L）1.0 μLTaq 酶b（5U/μL）0.5μL去离子水3μL总体积20μL2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。五附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图(资料来源：中国兽医协会）
黄芪 1 斤连翘 2 斤大青叶2斤板蓝根 1斤金银花0.5 斤黄芩 1斤鱼腥草 1斤玄参 1 斤甘草0.3斤石榴皮1斤黄柏1斤熬药，连渣滓喂猪 （也可以打粉拌料喂食（未实验，理论上效果会更好））可以喂30-50头猪 一顿，一天两顿 ，连喂三天（一头猪一顿总药量100克-150克）本猪场发现疑似飞猪，解剖下来确诊，未报，用此方熬药喂一窝有发病的猪，九头猪已经发病的两头未控制住，已经死亡，同窝其他猪全部控制住，年前因为快递中断，临近一窝猪发现病情未用此方治疗，现全部陆续死亡。此药方的药物都可以到淘宝上批发，比实体店划算，效果也不错，价格300元左右即可买到（店家不同价格左右相差50-80左右），我买的是260看到转发出去， 希望大家减少亏损猪到了200斤左右的时候，一定要再喂一次（理论，未实践），这个时候很多疫苗的免疫期过去了，容易抵抗力下降，应该容易感染大家试试吧，现在全国到处飞猪，周围都是这个，很少有人上报，多转发点群，老百姓养猪不容易！
荧光定量 PCR 方法，该方法是将光谱技术引入到PCR 反应中，通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量，解决了常规 PCR 方法敏感性低和电泳检测中溴化乙锭对环境的污染问题。
等温扩增法，该方法是一种新兴的分子生物学检测方法，等温扩增方法不需要 PCR 中的变性、退火步骤，即可完成对靶序列的循环扩增，大幅缩短了时间，整个扩增反应时间一般少于 60 min，而常规PCR 方法的反应时间一般需要 2 h 以上。等温扩增试剂盒适合现场检测，灵敏度高，能够大幅提高猪瘟防控的可行性。
要减少场外人员和车辆进入猪场，要对人员和车辆入场前彻底消毒，要对猪群实施全进全出饲养管理，要对新引进生猪实施隔离，要按规定申报检疫。
非洲猪瘟防控注意事项
养殖场应该坚持全进全出，自繁自育的养殖模式，构建完善的封锁隔离措施，避免猪和野猪直接接触。养殖场在生猪调运过程中，尽量不要跨省引进种猪，必须引种时，一定要进行严格的产地检疫、疫情检测，严格执行落地报告制度和隔离观察制度。
殖场内部如果发现非洲猪瘟可疑疫情，严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》进行处置，迅速采取应急措施，预防疫情传播和蔓延。
团体标准T/CVMA 5—2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus中国兽医协会发布前言本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。1、范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。2、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3、试剂3.1 DNA提取试剂DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。3.2 2 × PCR缓冲液2 × PCR缓冲液的配制见附录A。3.3 引物探针3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'荧光探针ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。3.4 阴性及阳性对照阴性及阳性对照的制备方法见附录C。3.5 其他试剂消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。4、仪器和耗材分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。5、操作步骤5.1 样品采集及运输样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。5.2 样品处理检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。5.3 样品保存采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。5.4 病毒DNA提取5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。5.5 实时荧光PCR操作5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。5.5.2 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。6、结果判定6.1 结果分析条件设定实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。6.2 结果描述及判定当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。7、实验室生物安全要求7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。一附录 A (规范性附录) 试剂的配制A.1 DNA提取液1PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。A.2 DNA提取液21mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。A.3 2×PCR缓冲液灭菌去离子水 70 mL三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g氯化钾 1.865 g曲拉通X-100 0.5 mLdATP (100mmol/L) 2.5 mLdTTP (100mmol/L) 2.5 mLdGTP (100mmol/L) 2.5 mLdCTP (100mmol/L) 2.5 mL六水氯化镁 0.61 g盐酸 调pH至9.0灭菌去离子水 加至100 mLA.4 消毒液8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方A.5.1 A液0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。A.5.2 B液0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。A.6 无DNA酶的灭菌去离子水无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。二附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT三附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照C.1阳性对照阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。C.2 阴性对照阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。四附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方实时荧光PCR反应液配方见表D.1。表D.1 实时荧光PCR反应液配方组 分1个检测体系的加入量2×PCR 缓冲液a12.5μLdNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL上游引物（10 μmol/L）1.0 μL下游引物（10 μmol/L）1.0μL探针（10 μmol/L）1.0 μLTaq 酶b（5U/μL）0.5μL去离子水3μL总体积20μL2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。五附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图(资料来源：中国兽医协会
【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.netpolyA( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 19761〔2〕 ven den Hoogen BG, de Jong JC , Groen J , et al , A newly discoveredhuman pneumovirus isolated from young children with respiratory tractdisease1 Nat Med , 2001 , 7 : 719 - 7241〔3〕 Fouchier RA , Hartwig NG, Bestebroer TM, et al1 A previously unde2scribed coronavirus associated with respiratory disease in human1 ProcNatl Acad Sci U S A , 2004 , 101 : 6212 - 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All rights reserved.
PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
2.1 实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
2.2 多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
2.3 单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
3.1 PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
3.2 PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
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Dorrance孙俐。(2004)报道,腐霉病痊愈了从感染的种子或幼苗的玉米和大豆,或直接从土壤有一系列的致病性和侵略性当进行病原学检测。那么,这些病原体和生物的代理商进行了测试,找出影响种子在萌发土呢皮氏培养皿中测试霉真菌病原体和转移分别占1%(w / v)水琼脂(WA)及孵化室温(25e30 _C)为7天前接种。大豆种子surface-sterilized,并放在真菌菌落(WA)。种子也被放置在未接种佤族板为对照。盘子10点被孵化_C在黑暗的地方,数6天后来搬到房间吗25e30 _C)温度(另外2天前疾病r我是在疾病评定的x 0e4?牢记复制(我)和N是总吗数量的幼苗检查。真菌土壤inoculums制备所有的真菌菌落马铃薯葡萄糖琼脂应该种植在和在25e30 _C孵化为3天。六1厘米的3-day-old 2插头种植马铃薯葡萄糖琼脂的文化被安置在每个真菌500毫升烧瓶含有200毫升的沙子,11.2毫升的玉米,和deionised 80毫升的水(蒸压两次,然后为40分钟再为24小时)。真菌寄生于sandecorn被允许餐中10天。这是shak烧瓶
在医学领域中，药学专业学生需要学习基础医学相关知识，成为社会需要的创新型药学人才。下文是我为大家整理的药学的论文 范文 的内容，欢迎大家阅读参考! 药学的论文范文篇1 试谈生物制药新技术发展分析 [摘 要]生物技术药物(biotech drugs)是集生物学、医学、药学的先进技术为一体，以组合化学、药学基因(功能抗原学、生物信息学等高技术为依托，以分子遗传学、分子生物、生物物理等基础学科的突破为后盾形成的产业。 文章 分析了通过生物制药新技术的创立，可以大大拓宽发明新药的空间，增加发明新药的机遇与速度。 [关键词]生物 制药 新技术 探析 生物技术药物(biotechdrugs)或称生物药物(biopharmaceutics)是集生物学、医学、药学的先进技术为一体，以组合化学、药学基因(功能抗原学、生物信息学等高技术为依托，以分子遗传学、分子生物、生物物理等基础学科的突破为后盾形成的产业。 一 生物制药技术 目前生物制药主要集中在以下几个方向： 1、肿瘤。 在全世界肿瘤死亡率居首位，美国每年诊断为肿瘤的患者为100万，死于肿瘤者达54.7万。用于肿瘤的治疗费用1020亿美元。肿瘤是多机制的复杂疾病，目前仍用早期诊断、放疗、化疗等综合手段治疗。今后10年抗肿瘤生物药物会急剧增加。如应用基因工程抗体抑制肿瘤，应用导向IL-2受体的融合毒素治疗CTCL肿瘤，应用基因治疗法治疗肿瘤(如应用γ-干扰素基因治疗骨髓瘤)。基质金属蛋白酶抑制剂(TNMPs)可抑制肿瘤血管生长，阻止肿瘤生长与转移。这类抑制剂有可能成为广谱抗肿瘤治疗剂，已有3种化合物进入临床试验。 2、神经退化性疾病。 老年痴呆症、帕金森氏病、脑中风及脊椎外伤的生物技术药物治疗，胰岛素生长因子rhIGF-1已进入Ⅲ期临床。神经生长因子(NGF)和BDNF(脑源神经营养因子)用于治疗末稍神经炎，肌萎缩硬化症，均已进入Ⅲ期临床。美国每年有中风患者60万，死于中风的人数达15万。中风症的有效防治药物不多，尤其是可治疗不可逆脑损伤的药物更少，Cerestal已证明对中风患者的脑力能有明显改善和稳定作用，现已进入Ⅲ期临床。Genentech的溶栓活性酶(Activase重组tPA)用于中风患者治疗，可以消除症状30%。 3、自身免疫性疾病。 许多炎症由自身免疫缺陷引起，如哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化症、红斑狼疮等。风湿性关节炎患者多于4000万，每年医疗费达上千亿美元，一些制药公司正在积极攻克这类疾病。 4、冠心病。 美国有100万人死于冠心病，每年治疗费用高于1170亿美元。今后10年，防治冠心病的药物将是制药工业的重要增长点。Centocor′sReopro公司应用单克隆抗体治疗冠心病的心绞痛和恢复心脏功能取得成功，这标志着一种新型冠心病治疗药物的延生。 基因组科学的建立与基因操作技术的日益成熟，使基因治疗与基因测序技术的商业化成为可能，正在达到未来治疗学的新高度。转基因技术用于构造转基因植物和转基因动物，已逐渐进入产业阶段，用转基因绵羊生产蛋白酶抑制剂ATT，用于治疗肺气肿和囊性纤维变性，已进入Ⅱ，Ⅲ期临床。大量的研究成果表明转基因动、植物将成为未来制药工业的另一个重要发展领域。 二 生物制药发展分析 未来生物技术将对当代重大疾病治疗剂创造更多的有效药物，并在所有前沿性的医学领域形成新领域。 生物学的革命不仅依赖于生物科学和生物技术的自身发展，而且依赖于很多相关领域的技术走向，例如微机电系统、材料科学、图像处理、传感器和信息技术等。尽管生物技术的高速发展使人们难以作出准确的预测，但是基因组图谱、克隆技术、遗传修改技术、生物医学工程、疾病疗法和药物开发方面的进展正在加快。 除了遗传学之外，生物技术还可以继续改进预防和治疗疾病的疗法。这些新疗法可以封锁病原体进入人体并进行传播的能力，使病原体变得更加脆弱并且使人的免疫功能对新的病原体作出反应。这些 方法 可以克服病原体对抗生素的耐受性越来越强的不良趋势，对感染形成新的攻势。 除了解决传统的细菌和病毒问题之外，人们正在开发解决化学不平衡和化学成分积累的新疗法。例如，正在开发之中的抗体可以攻击体内的可卡因，将来可以用于治疗成瘾问题。这种方法不仅有助于改善瘾君子的状况，而且对于解决全球性非法毒品贸易问题具有重大影响。 各种新技术的出现有助于新药物的开发。计算机模拟和分子图像处理技术(例如原子力显微镜、质量分光仪和扫描探测显微镜)相结合可以继续提高设计具有特定功能特性的分子的能力，成为药物研究和药物设计的得力工具。药物与使用该药物的生物系统相互作用的模拟在理解药效和药物安全方面会成为越来越有用的工具。例如，美国食品药物管理局(FDA)在药物审批的过程中利用DennisNoble的虚拟心脏模拟系统了解心脏药物的机理和临床试验观测结果的意义。这种方法到2015年可能会成为心脏等系统临床药物试验的主流方法，而复杂系统(例如大脑)的药物临床试验需要对这些系统的功能和生物学进行更为深入的研究。 药物的研究开发成本目前已经高到难以为继的程度，每种药物投放市场前的平均成本大约为6亿美元。这样高的成本会迫使医药工业对技术的进步进行巨大的投资，以增强医药工业的长期生存能力。综合利用遗传图谱、基于表现型的定制药物开发、化学模拟程序和工程程序以及药物试验模拟等技术已经使药物开发从尝试型方法转变为定制型开发，即根据服药群体对药物反应的深入了解会设计、试验和使用新的药物。这种方法还可以挽救过去在临床试验中被少数患者排斥但有可能被多数患者接受的药物。这种方法可以改善成功率、降低试验成本、为适用范围较窄的药物开辟新的市场、使药物更加适合适用对症群体的需要。如果这种技术趋于成熟，可以对制药工业和健康 保险 业产生重大影响。 三 结语 总之，综合多学科的努力，通过新技术的创立可以大大拓宽发明新药的空间，增加发明新药的机遇与速度。因为这些手段可以寻找快速鉴定药物作用的靶，更有效地发现更多新的先导物化学实体，从而为发明新药提供更加广阔的前景。 参考文献 [1] 邱芳菊，谈对制药新技术的探析，论文网，2009，08. 药学的论文范文篇2 浅谈我国生物制药产业现状分析及发展战略 【摘要】 本文对我国生物制药产业现状及发展战略进行了研究。指出了我国生物制药产业突出的问题，比如创新研发不足，融资的 渠道 不畅，混乱的产业格局。针对出现的问题，提出了相应的解决方法，有仿制、创新并举，拓宽融资的渠道，进行标准化的管理。全文结构紧凑，希望可以促进相关问题的研究。 【关键词】 生物制药;发展;创新 近20年来，以酶工程、细胞工程、发酵工程、基因工程为代表现代的生物技术得到了迅猛的发展，并日益改变和影响着人们的生活和生产方式。自上世纪的90年代以来，随着基因组等重大技术突破使生物技术产业化的进程明显的加快。当前，有三分之二的生物技术成果被应用于医药行业，用以对传统医药学进行改良或开发特色新药，由此引起医药工业重大的变革。 1 我国的生物制药业现状 1.1 总体概述 我国的生物制药业起步比较晚，经过20多年的发展，基因工程药物作为核心研制、开发与产业化己具备了一定的规模。当前我国注册生物技术类公司有400多家，已经取得基因工程类药物试产或者生产批文企业占到四分之一，主要分布于一些经济发达省、市及地区，比如北京、上海、浙江、广东、山东、江苏等地。近十几年来，我国开发了一大批新特效类药物，大大解决过去使用常规方法不能够生产或生产成本非常昂贵药品生产技术的问题，这些药品可分别用来防治诸如遗传性、心脑肺血竹、免疫性、肿瘤、内分泌之类严重威胁到人类健康疑难病症，并且在避免毒副等作用明显要优于传统类药品。 1.2 突出的问题 1.2.1 创新研发不足 在加入世界贸易组织以后，中国必须要遵守《同贸易有关知识产权协议》，于专利期内如果仿制某类新药，开发一方有权索要4- 10亿美金赔款。国际的大型生物制药类企业，研发的费用可占到销售收入20%以上，在这个方面我国的生物制药行业长期处在弱势的情况。 引发国内生物的制药业缺乏创新原因就在生物制药类企业于研发思想意识上比较落后，新药的研发过程沿用了学术工作方式，先从文献索引开始，在实际上仍然是走一条模仿的道路，缺少原创性。在一方面，科技研究所研究成果，多数还沉淀于实验室或保险柜;另一方面，比较于产品的创新，企业更加注重于现有产品改革及提高。这样的结果就是，创新的成果市场的转化率很低，离产业化、规模化的需求仍有非常大的距离。 1.2.2 融资的渠道不畅 作为高新技术类行业，生物制药的产业特点决定它需要前期资本的投入很大，因此除了企业的自身盈利积累及政府的资助以外，资本融通问题就变得至关重要。风险投资机构在生物制药投资方面发挥着重要的作用，但是因为投资的收益不理想，最近几年来投资大幅减少，由全面投资转变为重点投资。因为风险投资的明显导向作用，引起其他方面投资纷纷的缩水，这都严重阻碍我国的生物制药业发展。 1.2.3 混乱的产业格局 我国的生物制药业未形成一定的格局，产品生产进入了壁垒期。国内企业于市场风险的估计不足，对于一些国外畅销类产品，生产能力严重过剩，引发整个市场低水平的恶性竞争。除最初几个产品先上市企业得到盈利以外，大多企业难以获得大的毛利率，在些甚至处在亏损的边缘。 2 我国生物制药产业发展战略 2.1 仿制、创新并举 制药行业里能销售真正有价值产品只有一种:就是患者使用药物。创新不仅仅是个学术过程，更是个商业过程，企业创新首先应当从需求开始，进而寻找满足此种需求功能，由功能来确认技术构思，由技术构思来考虑技术方案，这样就可降低产品研发技术上的风险。在制药业方面，产业链分成上游创新的阶段、中游物质的分离阶段、产品的加工阶段、下游的 营销策划 阶段及渠道分销等。而生物药品研究开发的方式应该趋向一体化，从研究试验到生产到市场整个的过程要实行一体化，创建企业、研究机构一体化联合体，于技术、资金、市场、人才与管理互动式发展，相互渗透。 2.2 拓宽融资的渠道 公开的资本市场里融资可为产品处于成熟的阶段生物制药类企业提供资本的渠道，但对大部分处于初创期或种子期的企业由于缺少稳定的现金、现实商品化的产品、可靠偿债的能力，难以从间接的资本市场来获得支持(比如银行类金融机构提供债权性的资本)，并且高额的负债所产生沉重利息负担会极大制约企业后继的发展。 国外风险基金在逐渐地进入中国，包含大型生物制药公司和技术公司在内跨国企业使用联盟等方式对我国的生物制药类企业进行投资，及我国自身的私募基金、风险基金等发展，还有呼之欲出创业板，于我国生物制药类产业发展将会起到强大推动作用。我国的生物制药类企业只有增强项目的运作能力，才会有效地融合金融和生物制药技术，形成围绕企业成长的全面的发展链，进而构成项目运作良好的循环。 2.3 进行标准化的管理 国际贸易中，欧美发达国家凭借自身的经济、技术优势，制定苛刻的技术法规、技术标准和技术认证的制度，于发展中国家出口交易产生极大限制作用。医药的贸易也成为欧美国家使用技术壁垒里最频繁领域之一。国内的制药企业环境安全上的意识还很薄弱，实行国际认证企业的数目也极少，这都会在以后的我国医药产品出口上形成“技术壁垒”。为此，国内的生物制药类企业需清醒地认识到: 进行标准化的管理是国内生物制药类企业突破技术的壁垒，提高商品出口根本的途径。积极引进、培养熟悉国际规则又有制药的实践 经验 专家型的人才，进而使企业达到国际的先进水平。 参考文献 [1]董文政，张仕：生物制药业何时是艳阳天.中证网.2010(7).10―14 [2]中国统计年鉴.北京:中国统计出版社.2009(4).20―40。 [3]朱少杰，蔡茂森：论技术贸易壁垒的抑制效应和我国出口行业的对策.国际贸易问题.2008(7).8―11。 [4]令狐谱，黄速建：并购后整合:企业并购成败的关键因素.经济管理.2009(3).3―5 药学的论文范文篇3 浅谈药品不良反应与安全用药 摘要：近年来关于药物不良反应的报道和讨论比较多，已引起了各方面的注意。临床上对药品的要求不仅仅局限于对疾 病的治疗作用，同时也要求在治疗疾病的同时，所使用的药品应当尽可能少地出现药物不良反应(ADR)。根据WHO 报告 ，全球死亡人数中有近1/7的患者是 死于不合理用药。在我国，据有关部门统计，药物不良反应在住院患者中的发生率约为20%，1/4是抗生素所致。 每年由于滥用抗生素引起的耐药菌感染造成的 经济损失就达百亿元以上。药品不良反应[1]，是指合格药品在正常用法、规定剂量下出现的有害的和与用药目的无关的反应。随着医药科学的发展，临床上对药 品的要求不仅仅局限于防治作用，更注重使用过程中可能出现的不良反应，如何做好安全、有效的用药，已成为当务之急。合理用药始终与合理治疗伴行，是一个既 古老又新颖的课题，也是医院药学工作者永恒的话题。医院药学工作的宗旨是以服务患者为中心、临床药学为基础，促进临床科学用药，其核心是保障临床治疗中的 安全用药。目前公认的合理用药的基本要素：以当代药物和疾病的系统知识和理论为基础，安全、有效、经济及适当的使用药物。 【关键词】 合理的用药 引言： 随着社会的发展，如何安全、有效、合理的用药已成为社会关注的 热点 。近年来关于药物不良反应(adverse drug reaction，adr)的报道和讨论比较多，已引起了各方面的注意。临床上对药品的要求不仅仅局限于对疾病的治疗作用，同时也要求在治疗疾病的同时，所使用的药品应当尽可能少地出现adr。根据who报告，全球死亡人数中有近1/7的患者是死于不合理用药[1]。在我国，据有关部门统计，药物不良反应在住院患者中的发生率约为20%，1/4是抗生素所致。每年由于滥用抗生素引起的耐药菌感染造成的经济损失就达百亿元以上[2]。 合理用药始终与合理治疗伴行，是一个既古老又新颖的课题，也是医院药学工作者永恒的话题。医院药学工作的宗旨是以服务患者为中心、临床药学为基础，促进临床科学用药，其核心是保障临床治疗中的安全用药。目前公认的合理用药的基本要素：以当代药物和疾病的系统知识和理论为基础，安全、有效、经济及适当的使用药物[2]。 下面结合临床工作实践，并结合文献，浅谈一下临床常见的药品不良反应与安全用药问题。 一、抗生素滥用，导致药物的不合理应用 现如今医疗纠纷频发、医源性或药源性事件居高不下、医疗以及用药成本过高等，已成为多数国家、地区面临的问题，我国在这些方面也有许多相似之处。合理用药的实践步履艰难，进展迟缓，远未引起人们的足够重视。实际上，药物不良反应已成为危及人类健康的主要杀手，而抗生素的滥用现象在我国临床中已非常普遍。有资料表明，我国三级医院住院患者抗生素使用率约为70%，二级医院为80%，一级医院为90%[3]。抗生素的滥用，不仅使药物使用率过高、导致医药费用的急剧上涨，同时也给临床治疗上带来了严重的后果。现在，很少有医生对抗生素进行过系统、全面的了解，使用的盲目性很大，在选择抗生素时不加思考，不重视病原学检查，迷恋于“洋、新、贵”，盲目的大剂量使用广谱抗生素，或几种抗菌药同时应用，致使大量耐药菌产生，使难治性感染越来越多，医疗费用也越来越高。临床上很多严重感染者死亡，多是因为耐药感染使用抗生素无效引起的。adr以抗生素位居首位。 比如说上呼吸道感染,有90%以上是由病毒引起的，但临床上使用抗生素的却不在少数。滥用的后果是在宏观上造成细菌的抗药性增强，抗生素的效力降低 甚至丧失，最终导致人类无药可用;在微观上会对患者的身体造成药源性损害。由于人体内部有许多菌群，正常情况下他们相互制约，形成一种平衡，抗生素的滥用就可能对某些有益菌群造成破坏，使一些有害菌或病毒乘虚而入导致二重感染甚至死亡。另外，临床分科过细，医师缺乏正确的抗菌药物知识;正确的药品信息获取困难;医师缺乏全面的药学知识等，也是导致用药错误的重要原因。长时期以来，人们已经习惯把抗生素当作家庭的常备药，稍微有些头痛脑热就服用;而有一些患者主动要求用好药、贵药，就更造成了资源浪费和细菌耐药的发生。 由此看出，合理用药不仅仅是医学问题，也不仅仅是临床医师需要注意的问题。要真正做到合理用药，医生、患者、药师、药品管理部门需要互相协作才能得以实现。 二、提高自我保护意识，防止药品不良反应的发生 导致adr的原因十分复杂，而且难以预测。主要包括药品因素、患者自身的因素和其他方面的因素。 2.1 药品因素 (1)药物本身的作用：如果一种药有两种以上作用时，其中一种作用可能成为副作用。如：麻黄碱兼有平喘和兴奋作用，当用于防治支气管哮喘时可引起失眠。(2)不良药理作用：有些药物本身对人体某些组织器官有伤害，如长期大量使用糖皮质激素能使毛细血管变性出血，以致皮肤、黏膜出现瘀点、瘀斑。(3)药物的质量：生产过程中混入杂质或保管不当使药物污染，均可引起药物的不良反应。(4)药物的剂量：用药量过大，可发生中毒反应，甚至死亡。(5)剂型的影响：同一药物的剂型不同，其在体内的吸收也不同，即生物利用度不同，如不掌握剂量也会引起不良反应。 2.2 患者自身的原因 (1)性别：药物性皮炎男性比女性多，其比率约为3∶2;粒细胞减少症则女性比男性多。 (2)年龄：老年人、 儿童 对药物反应与成年人不同，因老年人和儿童对药物的代谢、排泄较慢，易发生不良反应;婴幼儿的机体尚未成熟，对某些药较敏感也易发生不良反应。调查发现，现60岁以下的人，不良反应的发生率为5.9%(52/887)，而60岁以上的老年人则为15.85%(113/713)[4]。 (3)个体差异：不同人种对同一药物的敏感性不同，而同一人种的不同个体对同一药物的反应也不同。(4)疾病因素：肝、肾功能减退时，可增强和延长药物作用，易引起不良反应。 2.3 其他因素 (1)不合理用药：误用、滥用、处方配伍不当等，均可发生不良反应。 (2)长期用药：极易发生不良反应，甚至发生蓄积作用而中毒。 (3)合并用药：两种以上药物合用，不良反应的发生率为3.5%，6种以上药物合用，不良反应发生率为10%，15种以上药物合用，不良反应发生率为80%[5]。 (4)减药或停药：减药或停药也可引起不良反应。例如治疗严重皮疹，当停用糖皮质激素或减药过速时，会产生反跳现象。 各种药品都可能存在不良反应，中药也不例外，只是程度不同，或是在不同人身上发生的几率不同。出现药品不良反应时也不必过于惊慌，患者用药时，一定要仔细阅读 说明书 ，如果出现了较严重或说明书上没有标明的不良反应，要及时向医生报告。 三、怎样做到安全用药 (1)不能轻信药品 广告 。有些药品广告夸张药品的有效性，而对药品的不良反应却只字不提，容易造成误导。 (2)不要盲目迷信新药、贵药、进口药。有些患者认为，凡是新药、贵药、进口药一定是好药，到医院里点名开药或在不清楚自己病情的情况下就到药店里自己买药，都是不恰当的。 (3)严格按照规定的用法、用量服用药物。用药前应认真阅读说明书，不能自行增加剂量，特别对于传统药，许多人认为多吃少吃没关系，剂量越大越好，这是不合理用药普遍存在的一个重要原因。 (4)药品消费者应提高自我保护意识，用药后如出现异常的感觉或症状，应停药就诊，由临床医生诊断治疗。这里需要告诫药品消费者的是，有些人服用药品后出现可疑的不良反应，不要轻易地下结论，要由有经验的专业技术人员认真地进行因果关系的分析评价。 随着人们对健康和生活质量问题的日益关注，药品不良反应的危害已经越来越引起全社会的重视。国家正在建立、健全药品不良反应监测报告制度，尽量避免和减少药品不良反应给人们造成的各种危害。因此，人们应抱着无病不随便用药，有病要合理用药，正确对待药品的不良反应的态度，正确的服用药物和保管药物，不断提高用药水平，从而达到真正的安全、有效、经济、适当地合理用药。 参考文献 1 徐年卉，林国生，付洁，等.合理应用抗菌药物管理工作的经验探讨.中华医院感染学杂志，2014，12(2):143-144. 2 唐镜波.合理用药的评价与实践要点.全军临床合理用药研讨班论文摘要汇编，1990，64. 3 刘振声，金大鹏，陈增辉.医院感染管理学.北京：军事医学科学出版社，2014，314. 4 孙定人.药物不良反应，第2版.北京：人民卫生出版社，1998，103. 猜你喜欢： 1. 电大药学论文范文 2. 药学论文范文 3. 大专药学毕业论文范文 4. 药学毕业论文范文 5. 药学大专毕业论文范文
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文献信息：
文献： Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease 中文：分析和临床验证微生物游离DNA测序在检测传染病中的应用 杂志：Nature Microbiology 时间：2019年2月 单位：斯坦福大学急诊医学部
摘要：
已知有成千上万的病原体会感染人类，但只有一小部分可用现有的诊断方法容易识别。微生物无细胞DNA测序提供了非侵入性识别全身广泛感染的潜力，但必须解决临床级宏基因组测试的挑战。在此，我们描述了对新一代测序测试的分析和临床验证，该测试对 1250个临床相关细菌、DNA病毒、真菌和真核寄生虫血浆中的微生物细胞游离DNA进行了识别和量化 。通过对358个人造血浆样本、2625个在硅胶中模拟的感染和580个临床研究样本的13种微生物模拟性能的关键决定因素，确定了对多个宏基因组特定挑战的测试准确性、精确性、偏倚和鲁棒性。在350名有脓毒症预警的患者中，该 试验显示有93.7%的患者与血液培养结果一致 ，并且发现脓毒症预警的独立判断原因比所有的微生物试验组合更常见(169个病原学检测对132个病原学检测)。在166个被判定为无任何检测方法的脓毒症病因的样本中，测序发现62个样品中有微生物游离DNA，可能来自共生生物体和与脓毒症警报无关的偶然发现。对CLIA实验室检测的前2000例患者样本的分析表明， 85%以上的结果是在样本收到后的第二天提交的 ，其中53.7%的报告识别了一种或多种微生物。
评论文献
文献： A powerful, non-invasive test to rule out infection 中文：一个强大的、非侵入性的感染检测方法 杂志：Nature Microbiology 时间：2019年3月 单位：英国东安格利亚大学
摘要：
Karius公司开发的这一方法可以识别和量化 1250种临床相关的病原菌，包括细菌、真菌和寄生虫 等；测序针对的是 血浆中的游离DNA（cfDNA） ，cfDNA的另一项广为人知的应用是无创产前诊断；测序结果解析依赖于21000个微生物参考基因组，cfDNA序列会被映射到参考基因组进而识别出1250种微生物是否存在；这一方法的 灵敏度较传统方法高28% ，已经适合临床使用，不过在成本、周转时间、特异性等方面仍有一定局限性。
参考下： 进入21世纪后，特别在我国加入WTO后，国内产品面临巨大挑战。各行业特别是传统产业都急切需要应用电子技术、自动控制技术进行改造和提升。例如纺织行业，温湿度是影响纺织品质量的重要因素，但纺织企业对温湿度的测控手段仍很粗糙，十分落后，绝大多数仍在使用干湿球湿度计，采用人工观测，人工调节阀门、风机的方法，其控制效果可想而知。制药行业里也基本如此。而在食品行业里，则基本上凭经验，很少有人使用湿度传感器。值得一提的是，随着农业向产业化发展，许多农民意识到必需摆脱落后的传统耕作、养殖方式，采用现代科学技术来应付进口农产品的挑战，并打进国外市场。各地建立了越来越多的新型温室大棚，种植反季节蔬菜，花卉；养殖业对环境的测控也日感迫切；调温冷库的大量兴建都给温湿度测控技术提供了广阔的市场。我国已引进荷兰、以色列等国家较先进的大型温室四十多座，自动化程度较高，成本也高。国内正在逐步消化吸收有关技术，一般先搞调温、调光照，控通风；第二步搞温湿度自动控制及CO2测控。此外，国家粮食储备工程的大量兴建，对温湿度测控技术提也提出了要求。 但目前，在湿度测试领域大部分湿敏元件性能还只能使用在通常温度环境下。在需要特殊环境下测湿的应用场合大部分国内包括许多国外湿度传感器都会“皱起眉头”！例如在上面提到纺织印染行业，食品行业，耐高温材料行业等，都需要在高温情况下测量湿度。一般情况下，印染行业在纱锭烘干中，温度能达到120摄氏度或更高温度；在食品行业中，食物的烘烤温度能达到80-200摄氏度左右；耐高温材料，如陶瓷过滤器的烘干等能达到200摄氏度以上。在这些情况下，普通的湿度传感器是很难测量的。 高分子电容式湿度传感器通常都是在绝缘的基片诸如玻璃、陶瓷、硅等材料上，用丝网漏印或真空镀膜工艺做出电极，再用浸渍或其它办法将感湿胶涂覆在电极上做成电容元件。湿敏元件在不同相对湿度的大气环境中，因感湿膜吸附水分子而使电容值呈现规律性变化，此即为湿度传感器的基本机理。影响高分子电容型元件的温度特性，除作为介质的高分子聚合物的介质常数ε及所吸附水分子的介电常数ε受温度影响产生变化外，还有元件的几何尺寸受热膨胀系数影响而产生变化等因素。根据德拜理论的观点，液体的介电常数ε是一个与温度和频率有关的无量纲常数。水分子的ε在T＝5℃时为78.36，在T＝20℃时为79.63。有机物ε与温度的关系因材料而异，且不完全遵从正比关系。在某些温区ε随T呈上升趋势，某些温区ε随T增加而下降。多数文献在对高分子湿敏电容元件感湿机理的分析中认为：高分子聚合物具有较小的介电常数，如聚酰亚胺在低湿时介电常数为3.0一3.8。而水分子介电常数是高分子ε的几十倍。因此高分子介质在吸湿后，由于水分子偶极距的存在，大大提高了吸水异质层的介电常数，这是多相介质的复合介电常数具有加和性决定的。由于ε的变 化，使湿敏电容元件的电容量C与相对湿度成正比。在设计和制作工艺中很难组到感湿特性全湿程线性。作为电容器，高分子介质膜的厚度d和平板电容的效面积S也和温度有关。温度变化所引起的介质几何尺寸的变化将影响C值。高分子聚合物的平均热线胀系数可达到 的量级。例如硝酸纤维素的平均热线胀系数为108x10-5/℃。随着温度上升，介质膜厚d增加，对C呈负贡献值；但感湿膜的膨胀又使介质对水的吸附量增加，即对C呈正值贡献。可见湿敏电容的温度特性受多种因素支配，在不同的湿度范围温漂不同；在不同的温区呈不同的温度系数；不同的感湿材料温度特性不同。总之，高分子湿度传感器的温度系数并非常数，而是个变量。所以通常传感器生产厂家能在-10-60摄氏度范围内是传感器线性化减小温度对湿敏元件的影响。 国外厂家比较优质的产品主要使用聚酰胺树脂，产品结构概要为在硼硅玻璃或蓝宝石衬底上真空蒸发制作金电极，再喷镀感湿介质材料（如前所述）形式平整的感湿膜，再在薄膜上蒸发上金电极.湿敏元件的电容值与相对湿度成正比关系，线性度约±2%。虽然，测湿性能还算可以但其耐温性、耐腐蚀性都不太理想，在工业领域使用，寿命、耐温性和稳定性、抗腐蚀能力都有待于进一步提高。 陶瓷湿敏传感器是近年来大力发展的一种新型传感器。优点在于能耐高温，湿度滞后，响应速度快，体积小，便于批量生产，但由于多孔型材质，对尘埃影响很大，日常维护频繁，时常需要电加热加以清洗易影响产品质量，易受湿度影响，在低湿高温环境下线性度差，特别是使用寿命短，长期可靠性差，是此类湿敏传感器迫切解决的问题。 当前在湿敏元件的开发和研究中，电阻式湿度传感器应当最适用于湿度控制领域，其代表产品氯化锂湿度传感器具有稳定性、耐温性和使用寿命长多项重要的优点，氯化锂湿敏传感器已有了五十年以上的生产和研究的历史，有着多种多样的产品型式和制作方法，都应用了氯化锂感湿液具备的各种优点尤其是稳定性最强。 氯化锂湿敏器件属于电解质感湿性材料，在众多的感湿材料之中，首先被人们所注意并应用于制造湿敏器件，氯化锂电解质感湿液依据当量电导随着溶液浓度的增加而下降。电解质溶解于水中降低水面上的水蒸气压的原理而实现感湿。 氯化锂湿敏器件的衬底结构分柱状和梳妆，以氯化锂聚乙烯醇涂覆为主要成份的感湿液和制作金质电极是氯化锂湿敏器件的三个组成部分。多年来产品制作不断改进提高，产品性能不断得到改善，氯化锂感湿传感器其特有的长期稳定性是其它感湿材料不可替代的，也是湿度传感器最重要的性能。在产品制作过程中，经过感湿混合液的配制和工艺上的严格控制是保持和发挥这一特性的关键。 在国内九纯健科技依托于国家计量科学研究院、中科院自动化研究所、化工研究院等大型科研单位从事温湿度传感器产品的研制、生产。选用氯化锂感湿材料作为主攻方向，生产氯化锂湿敏传感器及相关变送器，自动化仪表等产品，在吸取了国内外此项技术的成功经验的同时，努力克服传统产品存在的各项弱点，取得实质性进展。产品选用了Al2O3及SiO2陶瓷基片为衬底，基片面积大大缩小，采用特殊的工艺处理，耐湿性和粘覆性均大大提高。使用烧结工艺，在衬底集片上烧结5个9的工业纯金制成的梳妆电极，氯化锂感湿混合液使用新产品添加剂和固有成份混合经过特殊的老化和涂覆工艺后，湿敏基片的使用寿命和长期稳定性大大提高，特别是耐温性达到了-40℃-120℃，以多片湿敏元件组合的独特工艺，是传感器感湿范围为1%RH-98%RH，具备了15%RH范围以下的测量性能，漂移曲线和感湿曲线均实现了较好的线性化水平，使湿度补偿得以方便实施并较容易地保证了宽温区的测湿精度。采用循环降温装置封闭系统，先对对被测气体采样，然后降温检测并确保绝对湿度的恒定，使探头耐温范围提高到600℃左右，大大增强了高温下测湿的功能。成功解决了“高温湿度测量”这一湿度测量领域难题。现在，不采用任何装置直接测量150度以内环境中的湿度的分体式高温型温湿度传感器JCJ200W已成功应用在木材烘干，高低温试验箱等系统中。同时，JCJ200Y产品能耐温高达600度，也已成功应用在印染行业纱锭自动烘干系统、食品自动烘烤系统、特殊陶瓷材料的自动烘干系统、出口大型烘干机械等方面，并表现出良好的效果,为国内自动化控制域填补了高温湿度测量的空白，为我国工业化进程奠定了一定基础。传感器论文： 低温下压阻式压力传感器性能的实验研究 Experimental Study On Performance Of Pressure Transducer At Low Temperature .... 灌区水位测量记录设备及安装技术 摘要：水位测量施测简单直观，易于为广大用水户所接受而且便于自动观测，因而在灌区水量计量乃至在整个灌区信息化建设中都占有十分重要的地位。目前我国灌区中水位监测采用的传感器依据输出量的不同主要分为模拟传感.... 主成分分析在空调系统传感器故障检测与诊断中的应用研究 摘要 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按被检测的对象的性质可将它们的应用分为:直接应用和间接应用。前者是直接检测出受检测对象本身的磁场或磁特性，后者是检测受检对象上人为设置的磁场，用这个磁场来作被检测的信息的载体，通过它，将许多非电、非磁的物理量例如力、力矩、压力、应力、位置、位移、速度、加速度、角度、角速度、转数、转速以及工作状态发生变化的时间等，转变成电量来进行检测和控制。 一 霍尔器件的工作原理 在磁场作用下，通有电流的金属片上产生一横向电位差如图1所示： 这个电压和磁场及控制电流成正比： VH＝K╳｜H╳IC｜ 式中VH为霍尔电压，H为磁场，IC为控制电流，K为霍尔系数。 在半导体中霍尔效应比金属中显著，故一般霍尔器件是采用半导体材料制作的。 用霍尔器件，可以进行非接触式电流测量，众所周知，当电流通过一根长的直导线时，在导线周围产生磁场，磁场的大小与流过导线的电流成正比，这一磁场可以通过软磁材料来聚集，然后用霍尔器件进行检测，由于磁场与霍尔器件的输出有良好的线性关系，因此可利用霍尔器件测得的讯号大小，直接反应出电流的大小，即： I∞B∞VH 其中I为通过导线的电流，B为导线通电流后产生的磁场，VH为霍尔器件在磁场B中产生的霍尔电压、当选用适当比例系数时，可以表示为等式。霍尔传感器就是根据这种工作原理制成的。 二 霍尔传感器的应用 1 霍尔接近传感器和接近开关 在霍尔器件背后偏置一块永久磁体，并将它们和相应的处理电路装在一个壳体内，做成一个探头，将霍尔器件的输入引线和处理电路的输出引线用电缆连接起来，构成如图1所示的接近传感器。它们的功能框见图19。(a)为霍尔线性接近传感器，(b)为霍尔接近开关。 图1 霍尔接近传感器的外形图 a)霍尔线性接近传感器 (b)霍尔接近开关 图2 霍尔接近传感器的功能框图 霍尔线性接近传感器主要用于黑色金属的自控计数，黑色金属的厚度检测、距离检测、齿轮数齿、转速检测、测速调速、缺口传感、张力检测、棉条均匀检测、电磁量检测、角度检测等。 霍尔接近开关主要用于各种自动控制装置，完成所需的位置控制，加工尺寸控制、自动计数、各种计数、各种流程的自动衔接、液位控制、转速检测等等。3.2.7霍尔翼片开关 霍尔翼片开关就是利用遮断工作方式的一种产品，它的外形如图20所示，其内部结构及工作原理示于图21。 图3 霍尔翼片开关的外形图 2 霍尔齿轮传感器 如图4所示,新一代的霍尔齿轮转速传感器，广泛用于新一代的汽车智能发动机，作为点火定时用的速度传感器，用于ABS（汽车防抱死制动系统）作为车速传感器等。 在ABS中，速度传感器是十分重要的部件。ABS的工作原理示意图如图23所示。图中，1是车速齿轮传感器；2是压力调节器；3是控制器。在制动过程中，控制器3不断接收来自车速齿轮传感器1和车轮转速相对应的脉冲信号并进行处理，得到车辆的滑移率和减速信号，按其控制逻辑及时准确地向制动压力调节器2发出指令，调节器及时准确地作出响应，使制动气室执行充气、保持或放气指令，调节制动器的制动压力，以防止车轮抱死，达到抗侧滑、甩尾，提高制动安全及制动过程中的可驾驭性。在这个系统中，霍尔传感器作为车轮转速传感器，是制动过程中的实时速度采集器，是ABS中的关键部件之一。 在汽车的新一代智能发动机中，用霍尔齿轮传感器来检测曲轴位置和活塞在汽缸中的运动速度，以提供更准确的点火时间，其作用是别的速度传感器难以代替的，它具有如下许多新的优点。 （1）相位精度高，可满足0.4°曲轴角的要求，不需采用相位补偿。 （2）可满足0.05度曲轴角的熄火检测要求。 （3）输出为矩形波，幅度与车辆转速无关。在电子控制单元中作进一步的传感器信号调整时，会降低成本。 用齿轮传感器，除可检测转速外，还可测出角度、角速度、流量、流速、旋转方向等等。 图4 霍尔速度传感器的内部结构 1. 车轮速度传感器2.压力调节器3.电子控制器 2. 图4 ABS气制动系统的工作原理示意图 3 旋转传感器 按图5所示的各种方法设置磁体，将它们和霍尔开关电路组合起来可以构成各种旋转传感器。霍尔电路通电后，磁体每经过霍尔电路一次，便输出一个电压脉冲。 (a)径向磁极(b)轴向磁极(c)遮断式 图5 旋转传感器磁体设置 由此，可对转动物体实施转数、转速、角度、角速度等物理量的检测。在转轴上固定一个叶轮和磁体，用流体（气体、液体）去推动叶轮转动，便可构成流速、流量传感器。在车轮转轴上装上磁体，在靠近磁体的位置上装上霍尔开关电路，可制成车速表，里程表等等，这些应用的实例如图25所示。 图6的壳体内装有一个带磁体的叶轮，磁体旁装有霍尔开关电路，被测流体从管道一端通入，推动叶轮带动与之相连的磁体转动，经过霍尔器件时，电路输出脉冲电压，由脉冲的数目，可以得到流体的流速。若知管道的内径，可由流速和管径求得流量。霍尔电路由电缆35来供电和输出。 图6 霍尔流量计 由图7可见，经过简单的信号转换，便可得到数字显示的车速。 利用锁定型霍尔电路，不仅可检测转速，还可辨别旋转方向，如图27所示。 曲线1对应结构图（a）,曲线2对应结构图(b)，曲线3对应结构图(c)。 图7 霍尔车速表的框图 图8 利用霍尔开关锁定器进行方向和转速测定 4 在大电流检测中的应用 在冶金、化工、超导体的应用以及高能物理（例如可控核聚变）试验装置中都有许多超大型电流用电设备。用多霍尔探头制成的电流传感器来进行大电流的测量和控制，既可满足测量准确的要求，又不引入插入损耗，还免除了像使用罗果勘斯基线圈法中需用的昂贵的测试装置。图9示出一种用于DⅢ－D托卡马克中的霍尔电流传感器装置。采用这种霍尔电流传感器，可检测高达到300kA的电流。 图9（a）为G－10安装结构，中心为电流汇流排，(b)为电缆型多霍尔探头，(c)为霍尔电压放大电路。 (a)G�10安装结构(b)电缆型多霍尔探头(c)霍尔电压放大电路 图9 多霍尔探头大电流传感器 图10霍尔钳形数字电流表线路示意图 图11霍尔功率计原理图 (a)霍尔控制电路 (b)霍尔磁场电路 图12霍尔三相功率变送器中的霍尔乘法器 图13霍尔电度表功能框图 图14霍尔隔离放大器的功能框图 5 霍尔位移传感器 若令霍尔元件的工作电流保持不变，而使其在一个均匀梯度磁场中移动，它输出的霍尔电压VH值只由它在该磁场中的位移量Z来决定。图15示出3种产生梯度磁场的磁系统及其与霍尔器件组成的位移传感器的输出特性曲线，将它们固定在被测系统上，可构成霍尔微位移传感器。从曲线可见，结构（b）在Z<2mm时，VH与Z有良好的线性关系，且分辨力可达1μm，结构（C）的灵敏度高，但工作距离较小。 图15 几种产生梯度磁场的磁系统和几种霍尔位移传感器的静态特性 用霍尔元件测量位移的优点很多：惯性小、频响快、工作可靠、寿命长。 以微位移检测为基础，可以构成压力、应力、应变、机械振动、加速度、重量、称重等霍尔传感器。 6 霍尔压力传感器 霍尔压力传感器由弹性元件，磁系统和霍尔元件等部分组成，如图16所示。在图16中，（a）的弹性元件为膜盒，(b)为弹簧片，(c)为波纹管。磁系统最好用能构成均匀梯度磁场的复合系统，如图29中的(a)、(b)，也可采用单一磁体，如（c）。加上压力后，使磁系统和霍尔元件间产生相对位移，改变作用到霍尔元件上的磁场，从而改变它的输出电压VH。由事先校准的p～f(VH)曲线即可得到被测压力p的值。 图16 几种霍尔压力传感器的构成原理 7 霍尔加速度传感器 图17示出霍尔加速度传感器的结构原理和静态特性曲线。在盒体的O点上固定均质弹簧片S,片S的中部U处装一惯性块M，片S的末端b处固定测量位移的霍尔元件H，H的上下方装上一对永磁体，它们同极性相对安装。盒体固定在被测对象上，当它们与被测对象一起作垂直向上的加速运动时，惯性块在惯性力的作用下使霍尔元件H产生一个相对盒体的位移，产生霍尔电压VH的变化。可从VH与加速度的关系曲线上求得加速度。 图17 霍尔加速度传感器的结构及其静态特性 三 小结 目前霍尔传感器已从分立元件发展到了集成电路的阶段，正越来越受到人们的重视，应用日益广泛。
生物传感器的研究现状及应用摘要：简述了生物传感器尤其是微生物传感器近年来在发酵工业及环境监测领域中的研究与应用，对其发展前景及市场化作了预测及展望。生物电极是以固定化生物体组成作为分子识别元件的敏感材料，与氧电极、膜电极和燃料电极等构成生物传感器，在发酵工业、环境监测、食品监测、临床医学等方面得到广泛的应用。生物传感器专一性好、易操作、设备简单、测量快速准确、适用范围广。随着固定化技术的发展，生物传感器在市场上具有极强的竞争力。 关键词：生物传感器；发酵工业；环境监测。中图分类号：tp212.3 文献标识码：a 文章编号：1006-883x(2002)10-0001-06一、 引言 从1962年，clark和lyons最先提出生物传感器的设想距今已有40 年。生物传感器在发酵工艺、环境监测、食品工程、临床医学、军事及军事医学等方面得到了深度重视和广泛应用。在最初15年里，生物传感器主要是以研制酶电极制作的生物传感器为主，但是由于酶的价格昂贵并不够稳定，因此以酶作为敏感材料的传感器，其应用受到一定的限制。近些年来，微生物固定化技术的不断发展，产生了微生物电极。微生物电极以微生物活体作为分子识别元件，与酶电极相比有其独到之处。它可以克服价格昂贵、提取困难及不稳定等弱点。此外，还可以同时利用微生物体内的辅酶处理复杂反应。而目前，光纤生物传感器的应用也越来越广泛。而且随着聚合酶链式反应技术（pcr）的发展，应用pcr的dna生物传感器也越来越多。二、 研究现状及主要应用领域 1、 发酵工业各种生物传感器中，微生物传感器最适合发酵工业的测定。因为发酵过程中常存在对酶的干扰物质，并且发酵液往往不是清澈透明的，不适用于光谱等方法测定。而应用微生物传感器则极有可能消除干扰，并且不受发酵液混浊程度的限制。同时，由于发酵工业是大规模的生产，微生物传感器其成本低设备简单的特点使其具有极大的优势。(1). 原材料及代谢产物的测定微生物传感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的测定，代谢产物如头孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇类、青霉素、乳酸等的测定。测量的原理基本上都是用适合的微生物电极与氧电极组成，利用微生物的同化作用耗氧，通过测量氧电极电流的变化量来测量氧气的减少量，从而达到测量底物浓度的目的。在各种原材料中葡萄糖的测定对过程控制尤其重要，用荧光假单胞菌（psoudomonas fluorescens）代谢消耗葡萄糖的作用，通过氧电极进行检测，可以估计葡萄糖的浓度。这种微生物电极和葡萄糖酶电极型相比，测定结果是类似的，而微生物电极灵敏度高，重复实用性好，而且不必使用昂贵的葡萄糖酶。当乙酸用作碳源进行微生物培养时，乙酸含量高于某一浓度会抑制微生物的生长，因此需要在线测定。用固定化酵母（trichosporon brassicae），透气膜和氧电极组成的微生物传感器可以测定乙酸的浓度。此外，还有用大肠杆菌（e.coli）组合二氧化碳气敏电极，可以构成测定谷氨酸的微生物传感器，将柠檬酸杆菌完整细胞固定化在胶原蛋白膜内，由细菌―胶原蛋白膜反应器和组合式玻璃电极构成的微生物传感器可应用于发酵液中头孢酶素的测定等等。(2). 微生物细胞总数的测定在发酵控制方面，一直需要直接测定细胞数目的简单而连续的方法。人们发现在阳极表面，细菌可以直接被氧化并产生电流。这种电化学系统已应用于细胞数目的测定，其结果与传统的菌斑计数法测细胞数是相同的[1]。(3). 代谢试验的鉴定传统的微生物代谢类型的鉴定都是根据微生物在某种培养基上的生长情况进行的。这些实验方法需要较长的培养时间和专门的技术。微生物对底物的同化作用可以通过其呼吸活性进行测定。用氧电极可以直接测量微生物的呼吸活性。因此，可以用微生物传感器来测定微生物的代谢特征。这个系统已用于微生物的简单鉴定、微生物培养基的选择、微生物酶活性的测定、废水中可被生物降解的物质估计、用于废水处理的微生物选择、活性污泥的同化作用试验、生物降解物的确定、微生物的保存方法选择等[2]。2、 环境监测(1). 生化需氧量的测定生化需氧量（biochemical oxygen demand ?bod）的测定是监测水体被有机物污染状况的最常用指标。常规的bod测定需要5天的培养期，操作复杂、重复性差、耗时耗力、干扰性大，不宜现场监测，所以迫切需要一种操作简单、快速准确、自动化程度高、适用广的新方法来测定。目前，有研究人员分离了两种新的酵母菌种spt1和spt2，并将其固定在玻璃碳极上以构成微生物传感器用于测量bod，其重复性在±10%以内。将该传感器用于测量纸浆厂污水中bod的测定，其测量最小值可达2 mg/l，所用时间为5min[3]。还有一种新的微生物传感器，用耐高渗透压的酵母菌种作为敏感材料，在高渗透压下可以正常工作。并且其菌株可长期干燥保存，浸泡后即恢复活性，为海水中bod的测定提供了快捷简便的方法[4]。 除了微生物传感器，还有一种光纤生物传感器已经研制出来用于测定河水中较低的bod值。该传感器的反应时间是15min，最适工作条件为30°c，ph=7。这个传感器系统几乎不受氯离子的影响（在1000mg/l范围内），并且不被重金属（fe3+、cu2+、mn2+、cr3+、zn2+）所影响。该传感器已经应用于河水bod的测定，并且获得了较好的结果[4]。现在有一种将bod生物传感器经过光处理（即以tio2作为半导体，用6 w灯照射约4min）后，灵敏度大大提高，很适用于河水中较低bod的测量[5]。同时，一种紧凑的光学生物传感器已经发展出来用于同时测量多重样品的bod值。它使用三对发光二极管和硅光电二极管，假单胞细菌（pseudomonas fluorescens）用光致交联的树脂固定在反应器的底层，该测量方法既迅速又简便，在4℃下可使用六周，已经用于工厂废水处理的过程中[5]。(2). 各种污染物的测定常用的重要污染指标有氨、亚硝酸盐、硫化物、磷酸盐、致癌物质与致变物质、重金属离子、酚类化合物、表面活性剂等物质的浓度。目前已经研制出了多种测量各类污染物的生物传感器并已投入实际应用中了。测量氨和硝酸盐的微生物传感器，多是用从废水处理装置中分离出来的硝化细菌和氧电极组合构成。目前有一种微生物传感器可以在黑暗和有光的条件下测量硝酸盐和亚硝酸盐(nox-)，它在盐环境下的测量使得它可以不受其他种类的氮的氧化物的影响。用它对河口的nox-进行了测量，其效果较好[6]。硫化物的测定是用从硫铁矿附近酸性土壤中分离筛选得到的专性、自养、好氧性氧化硫硫杆菌制成的微生物传感器。在ph=2.5、31℃时一周测量200余次，活性保持不变，两周后活性降低20%。传感器寿命为7天，其设备简单，成本低，操作方便。目前还有用一种光微生物电极测硫化物含量，所用细菌是chromatium.sp，与氢电极连接构成[7]。最近科学家们在污染区分离出一种能够发荧光的细菌，此种细菌含有荧光基因，在污染源的刺激下能够产生荧光蛋白，从而发出荧光。可以通过遗传工程的方法将这种基因导入合适的细菌内，制成微生物传感器，用于环境监测。现在已经将荧光素酶导入大肠杆菌（e.coli）中，用来检测砷的有毒化合物[8]。水体中酚类和表面活性剂的浓度测定已经有了很大的发展。目前，有9种革兰氏阴性细菌从西西伯利亚石油盆地的土壤中分离出来，以酚作为唯一的碳源和能源。这些菌种可以提高生物传感器的感受器部分的灵敏度。它对酚的监测极限为5 ´10-9mol。该传感器工作的最适条件为：ph=7.4、35℃，连续工作时间为30h[9]。还有一种假单胞菌属（pseudomonas rathonis）制成的测量表面活性剂浓度的电流型生物传感器，将微生物细胞固定在凝胶（琼脂、琼脂糖和海藻酸钙盐）和聚乙醇膜上，可以用层析试纸gf/a，或者是谷氨酸醛引起的微生物细胞在凝胶中的交联，长距离的保持它们在高浓度表面活性剂检测中的活性和生长力。该传感器能在测量结束后很快的恢复敏感元件的活性[10]。还有一种电流式生物传感器，用于测定有机磷杀虫剂，使用的是人造酶。利用有机磷杀虫剂水解酶，对硝基酚和二乙基酚的测量极限为100´10-9mol，在40℃只要4min[11]。还有一种新发展起来的磷酸盐生物传感器，使用丙酮酸氧化酶g，与自动系统cl-fia台式电脑结合，可以检测(32~96)´10-9mol的磷酸盐，在25°c下可以使用两周以上，重复性高[12]。最近，有一种新型的微生物传感器，用细菌细胞作为生物组成部分，测定地表水中壬基酚（nonyl-phenol etoxylate --np-80e）的含量。用一个电流型氧电极作传感器，微生物细胞固定在氧电极上的透析膜上，其测量原理是测量毛孢子菌属（trichosporum grablata）细胞的呼吸活性。该生物传感器的反应时间为15~20min，寿命为7~10天（用于连续测定时）。在浓度范围0.5~6.0mg/l内，电信号与np-80e浓度呈线性关系，很适合于污染的地表水中分子表面活性剂的检测[13]。除此之外，污水中重金属离子浓度的测定也是不容忽视的。目前已经成功设计了一个完整的，基于固定化微生物和生物体发光测量技术上的重金属离子生物有效性测定的监测和分析系统。将弧菌属细菌（vibrio fischeri）体内的一个操纵子在一个铜诱导启动子的控制下导入产碱杆菌属细菌（alcaligenes eutrophus (ae1239)）中，细菌在铜离子的诱导下发光，发光程度与离子浓度成正比。将微生物和光纤一起包埋在聚合物基质中，可以获得灵敏度高、选择性好、测量范围广、储藏稳定性强的生物传感器。目前，这种微生物传感器可以达到最低测量浓度1´10-9mol[14]。还有一种专门测量铜离子的电流型微生物传感器。它用酒酿酵母（saccharomyces cerevisiae）重组菌株作为生物元件，这些菌株带有酒酿酵母cup1基因上的铜离子诱导启动子与大肠杆菌lacz基因的融合体。其工作原理，首先是cup1启动子被cu2+诱导，随后乳糖被用作底物进行测量。如果cu2+存在于溶液中，这些重组体细菌就可以利用乳糖作为碳源，这将导致这些好氧细胞需氧量的改变。该生物传感器可以在浓度范围(0.5~2)´10-3mol范围内测定cuso4溶液。目前已经将各类金属离子诱导启动子转入大肠杆菌中，使得大肠杆菌会在含有各种金属离子的的溶液中出现发光反应。根据它发光的强度可以测定重金属离子的浓度，其测量范围可以从纳摩尔到微摩尔，所需时间为60~100min[15][16]。用于测量污水中锌浓度的生物传感器也已经研制成功，使用嗜碱性细菌alcaligenes cutrophus，并用于对污水中锌的浓度和生物有效性进行测量，其结果令人满意[17]。估测河口出水流污染情况的海藻传感器是由一种螺旋藻属蓝细菌（ cyanobacterium spirlina subsalsa）和一个气敏电极构成的。通过监测光合作用被抑制的程度来估测由于环境污染物的存在而引起水的毒性变化。以标准天然水为介质，对三种主要污染物（重金属、除草剂、氨基甲酸盐杀虫剂）的不同浓度进行了测定，均可监测到它们的有毒反应，重复性和再生性都很高[18]。近来由于聚合酶链式反应技术（pcr）的迅猛发展及其在环境监测方面的广泛应用，不少科学家开始着手于将它与生物传感器技术结合应用。有一种应用pcr技术的dna压电生物传感器，可以测定一种特殊的细菌毒素。将生物素酰化的探针固定在装有链酶抗生素铂金表面的石英晶体上，用1´10-6mol的盐酸可以使循环式测量在同一晶体表面进行。用细菌中提取的dna样品进行同样的杂交反应并由pcr放大，产物为气单胞菌属（aeromonas hydrophila）的一种特殊基因片断。这种压电生物传感器可以鉴别样品中是否含有这种基因，这为从水样中检测是否含带有这种病原的各种气单胞菌提供了可能[19]。还有一种通道生物传感器可以检测浮游植物和水母等生物体产生的腰鞭毛虫神经毒素等毒性物质，目前已经能够测量在一个浮游生物细胞内含有的极微量的psp毒素[20]。dna传感器也在迅速的得到应用，目前有一种小型化dna生物传感器，能将dna识别信号转换为电信号，用于测量水样中隐孢子和其他水源传染体。该传感器着重于改进核酸的识别作用和加强该传感器的特异性和灵敏性，并寻求将杂交信号转化为有用信号的新方法，目前研究工作为识别装置和转换装置的一体化[21]。微藻素是一种从蓝藻细菌引起的水华中产生的细菌肝毒素，一种固定有表面细胞质粒基因组的生物传感器已经制得，用于测量水中微藻素的含量，它直接的测量范围是50~1000 ´10-6g/l[22]。 一种基于酶的抑制性分析的多重生物传感器用于测量毒性物质的设想也已经提出。在这种多重生物传感器中，应用了两种传导器―对ph敏感的电子晶体管和热敏性的薄膜电极，以及三种酶―尿素酶、乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。该生物传感器的性能已经得到测试，效果较好[23]。除了发酵工业和环境监测，生物传感器还深入的应用于食品工程、临床医学、军事及军事医学等领域，主要用于测量葡萄糖、乙酸、乳酸、乳糖、尿酸、尿素、抗生素、谷氨酸等各种氨基酸，以及各种致癌和致变物质。三、 讨论与展望 美国的harold h.weetal指出，生物传感器商品化要具备以下几个条件：足够的敏感性和准确性、易操作、价格便宜、易于批量生产、生产过程中进行质量监测。其中，价格便宜决定了传感器在市场上有无竞争力。而在各种生物传感器中，微生物传感器最大的优点就是成本低、操作简便、设备简单，因此其在市场上的前景是十分巨大和诱人的。相比起来，酶生物传感器等的价格就比较昂贵。但微生物传感器也有其自身的缺点，主要的缺点就是选择性不够好，这是由于在微生物细胞中含有多种酶引起的。现已有报道加专门抑制剂以解决微生物电极的选择性问题。除此之外，微生物固定化方法也需要进一步完善，首先要尽可能保证细胞的活性，其次细胞与基础膜结合要牢固，以避免细胞的流失。另外，微生物膜的长期保存问题也待进一步的改进，否则难于实现大规模的商品化。 总之，常用的微生物电极和酶电极在各种应用中各有其优越之处。若容易获得稳定、高活性、低成本的游离酶，则酶电极对使用者来说是最理想的。相反的，若生物催化需经过复杂途径，需要辅酶，或所需酶不宜分离或不稳定时，微生物电极则是更理想的选择。而其他各种形式的生物传感器也在蓬勃发展中，其应用也越来越广泛。随着固定化技术的进一步完善，随着人们对生物体认识的不断深入，生物传感器必将在市场上开辟出一片新的天地。--------------------------------------------------------------------------------参考文献[1]韩树波，郭光美，李新等.伏安型细菌总数生物传感器的研究与应用[j].华夏医学，2000，63（2）：49-52 [2]蔡豪斌.微生物活细胞检测生物传感器的研究[j]. 华夏医学，2000，13（3）：252-256[3] trosok sp, driscoll bt, luong jht mediated microbial biosensor using a novel yeast strain for wastewater bod measurement[j]. applied micreobiology and biotechnology，2001， 56 (3-4): 550-554 [4] 张悦,王建龙，李花子等.生物传感器快速测定bod在海洋监测中的应用[j].海洋环境科学，2001，20(1)：50-54[5] yoshida n, mcniven sj, yoshida a,etc.a compact optical system for multi-determination of biochemical oxygen demand using disposable strips[j]. field analytical chemistry and technology，2001，5 (5): 222-227[6] meyer rl, kjaer t, revsbech np. use of nox- microsensors to estimate the activity of sediment nitrification and nox- consumption along an 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PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
2.1 实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
2.2 多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
2.3 单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
3.1 PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
3.2 PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
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