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因为随着时间的变化会发生化学变化首先，我们要了解流体分为牛顿流体和非牛顿流体。牛顿流体是指粘度值不随剪切率（转速）的变化，而保持恒定的流体 。比如我们作为校验校准用的标准油即为牛顿流体。而实际上，我们生产和生活中多接触的样品绝大多数都是非牛顿流体（粘度会随剪切率或转速的改变而变化）。非牛顿流体样品的流变特性非常复杂，但基本都会随剪切率（转速）、温度而改变，有些流体样品还和剪切时间相关。
为什么随着转速的增加酸奶黏度降低酸奶的生产过程中对原料乳进行均质是一个十分重要的步骤(尤其是脂肪含量高的酸奶)。在对乳进行热处理之前，要对乳进行均质作用，以阻止乳在发酵过程中乳状液分层现象的发生，均质压力在10-20MPa之间，均质温度在55-65℃之间。在均质的过程中，乳脂肪球被破碎成较小的脂肪球，增加了脂肪球的表面积。均质的使用也防止了酸奶在存储过程中脂肪的分离，减少了乳清的析出，提高了酸奶的勃度。均质后酪蛋白和乳清蛋白在脂肪球的表面形成了一层新的表面层，其增加了酸奶中各成份间的组织连接的数量原料乳热处理热处理温度偏低或时间不够，就不能使大量乳清蛋白变性，而变性乳清蛋白可与酪蛋白形成复合物，能容纳更多的水分，并且具有最小的脱水收缩作用。防止方法 （1）变性的乳清蛋白质含量>75%（2）选择合适的杀菌条件发酵时间最常见的乳清析出主要是后发酵产生的，若发酵时间过长，乳酸菌继续生长繁殖，产酸量不断增加。酸性的增强破坏了原来已形成的胶体结构，使其容纳的水分游离出来形成乳清上浮。所以控制好发酵时间，发酵完成马上将产品冷却，防止后发酵。发酵时间过短，乳蛋白质的胶体结构还未充分形成，不能包裹乳中原有的水分，也会形成乳清析出。发酵温度发酵温度对酸奶的微观结构和物理特性均产生影响。在使用较高的发酵温度(如42℃)进行发酵的酸奶与低温(如30℃)发酵的酸奶相比，会降低凝胶时间和存储模量值。此结果说明，在高温下形成的凝胶，凝胶较弱，网络比较粗糙。在低温下发酵的凝胶形成过程中，蛋白质的聚集现象发生的比较缓慢，但却形成了大量的蛋白质一蛋白质键，这就减少了颗粒的重排现象。布氏漏斗被用于测定搅拌型酸奶的黏度，在低温下发酵的酸奶的黏度要比高温下发酵制得的酸奶的黏度高. 将38℃下发酵的酸奶与43℃下发酵的酸奶相比，更加可口，更加细腻。低温下发酵的搅拌型酸奶的非口感薪度也有所增加。随着发酵温度的增加，搅拌型酸奶的入口感和细腻程度有所降低。防止方法 （1）保证发酵剂的质量（2）选择合适的发酵温度（3）酸乳发酵时，应抽样检查乳中蛋白质含量对酸奶凝胶的影响在酸奶的制作过程中，乳蛋白是影响酸奶凝胶质量的主要因素，增加蛋白质含量，通常会增加蛋白质网络结构的密度，减小凝胶中微孔的大小。可以更牢固的束缚产品中的水分即减少乳清析出。乳中蛋白质的强化可以通过添加乳粉、乳清粉、乳蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物或酪蛋白酸钠等物质来完成。蛋白质含量对酸奶凝胶的影响很大，其影响程度取决于蛋白质的种类及添加量，如酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物的添加对酸奶的各个方面的性质仅起到负面的影响。添加乳清浓缩蛋白的效果最好，随着蛋白质添加量的增加宏观上表现出质地更均一致密，持水能力更强;微观结构方面上随着蛋白质含量的升高酪蛋白形成的分支链逐渐变短，凝胶的空隙逐渐减小，形成更规则更细小的网状结构，酸奶的流变性研究指出随着蛋白质含量的增加，酸奶的弹性模量和表观粘度均呈线性的增加，损失应力减少，凝胶强度。其他原因 干物质含量低、发酵剂添加量多、发酵时震动、钙盐不足、菌种污染、容器灭菌不彻底、更重要的是稳定剂的选择防止方法 （1）干物质>8.5%（2）接种量2-4%（3）添加适量的氯化钙.
现在的乳品行业，在实际生产中采用最先进的加工机械和加工工艺,也很难达到质量要求,常发生油脂上浮和蛋白质沉淀的质量问题。对此各大生产厂家在产品加工过程中加入一定量的添加剂——稳定剂、乳化剂、增稠剂等混合物质作为品质改良剂使用,以提高口感的味道,来吸引更多的顾客。当今的社会是科技迅猛发展的社会,产品也在日新月异的变化,在提高产品品质的同时,千万要控制好品质改良剂——增稠剂的用量,更要让消费者买得放心、喝得开心。增稠剂的用量控制是通过它的粘度来反映其含量,这是关系到成本经济性与食品安全性的重要保证.上海金澳食品（正广和）有限公司. 所测产品:酸 奶仪器生产厂商名称及型号:上海地学仪器研究所/数字旋转粘度计SNB-2及低温恒温槽SD-206.配件: 0、1、2、3、4号转子购买日期 2006-7-12主要用途及说明:我公司主要生产酸奶产品，在加工工艺中利用增稠剂来控制酸奶的粘度，而增稠剂的含量越多对人体伤害越大，所以使用SNB-2数字旋转粘度计及恒温槽对其酸奶进行粘度检测，以求达到企业标准或行业标准.使用已达半年时间，主要效果体现在以下几点：1）可以有效的控制因增稠剂的过量对人体造成的伤害；2）提高了产品的质量、同时也降低了生产成本；3）仪器连续测量快捷、读数方便、精度高、稳定性好；上海地学仪器研究所也向我们介绍了该产品在其他行业的应用,比如:火腿肠业、牙膏业、果汁业、食品添加剂行业等等.更多详细情况,有兴趣的话,你可登陆上海地学仪器研究所网址 具体再了解.
1、看储存条件超市中的酸奶有的放在冷柜储存，有的是常温储存，低温冷藏的酸奶是活菌型酸奶，低温是为了使活性菌存活更长时间，防止酸奶变质。而常温酸奶也叫灭菌型酸奶，在出厂前已经灭掉了乳酸菌，因为这样做可以得到更长的保质期，方便存放与运输。2、看有没有“发酵乳”字样发酵乳是纯乳中加入乳酸菌发酵后所制的产品，不添加任何香料、增稠剂等添加剂。发酵乳在保质期内，产品必须含有大量与之相应的活性微生物。可以更有效地对人体起补充营养与保健的作用。3、看营养成分表营养成分表主要关注2个指标，一个是蛋白质含量。根据规定原味酸奶的蛋白质含量应≥2.9％，蛋白质含量越高，营养越丰富，对人体越有好处。另一个是糖就是标签中的碳水化合物，建议含量不应超过12％。因为世卫组织建议每天糖摄入最多25克。碳水化合物超过12％，那100克酸奶含糖机会超过12克，占了每天糖摄入量的一半，容易使糖分过高，不利于健康。4、看是否有“风味”字样通常加了“风味”字样的酸奶，都是商家为了提升酸奶口感添加了其他成分，比如果粒、添加剂、营养强化剂、糖等，虽然口感会更好，但对于健康却未必是好事。5、乳制品为含乳饮料含乳饮料是指以鲜乳或乳制品为原料，经发酵或未经发酵加工制成的制品。其蛋白质含量要求低于酸奶。通常还会加入白砂糖、甜味剂、酸味剂、果汁、茶等物质。扩展资料：酸奶是往牛乳里添加保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌，由这些菌将酸奶中的乳糖和蛋白质发酵成乳酸。酸奶在制作的过程中会把1/3的乳糖分解掉，从而减轻乳糖不耐受情况的发生，同时产生乳糖酶，有利于消化、吸收。酸奶的奶质普遍比普通牛奶要高，是对人体健康很有好处的食品。但有些酸奶产品在广告中宣传自己的益生菌添加量达到上百亿，并且鼓吹这些活菌的功效，其实并没有依据。检测报告显示，大部分低温酸奶模拟消化后，含有的乳酸菌数所剩无几。
如下。酸奶感官评价的指标包括口感，凝固状态，滋味，色泽这几方面评定，其中占比是口感（40分），凝固状态（20分）、滋味（30分）、色泽（10分），酸奶的国家标准是蛋白质大于2.9或者等于2.9，感官指标是检测酸牛奶质量的最基本方法，酸奶的感官检验是通过检验者的视觉、嗅觉、触觉及味觉等感觉器官，对酸牛奶的质量均匀细腻，无大块颗粒，进行检查。
本论文采用两种茶叶蒸青和炒青进行超微粉碎制得三种...制作成超微茶粉酸奶,既能保持酸奶原有的营养价值和...第二章 引言2.1 研究的目的与意义2.2 研究内容...
真正的酸奶最主要的指标就是看这种酸奶的发酵工艺到底是怎么样的，如果是发酵工艺比较好的话，那么肯定是比较好的酸奶。
目前市场上发酵奶制品中提到的乳酸菌传统意义上是指：保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌。这两种菌是酸奶发酵过程中传统使用的乳酸菌，其中保加利亚乳杆菌主要影响酸奶的风味，嗜热链球菌主要影响酸奶的质地和口感。市面上很多酸奶都说自己使用HN-345、BB-12、LB81等各种各样的乳酸菌，那这些代号是什么意思呢？就拿其中的LB81乳酸菌举例子，LB81乳酸菌是起源于保加利亚的菌种，「 LB81 」名称的由来是菌株编号。「 LB 」是Lactic Acid Bacteria （乳酸菌）的首字母， 81是使用「保加利亚乳杆菌2038菌株」和「嗜热链球菌1131菌株」的末尾数组合出的数字，明治从艾比保加里肯股份有限公司获得了LB81乳酸菌的使用权，该公司成立于1950年，历史悠久，是保加利亚国唯一的国营乳业生产商。所以你知道该怎么选了吧。
酵母菌是真核单细胞生物，具有成型的细胞核，也具有如‘线粒体’‘核糖体’等真核生物才具有的细胞器，酵母菌的生殖方式分无性繁殖和有性繁殖，以无性繁殖为主，主要为出芽生殖。而乳酸菌则是典型的原核生物，具有拟核与仅有的细胞器‘核糖体’，是一类以糖为料发酵产生乳酸的细菌, 革兰氏染色呈阳性, 生殖方式为裂殖，即‘二分裂’. 一定记牢哦 1酵母菌富集培养基 葡萄糖5% 尿素0.1% 硫化铵0.1% 磷酸二氢钾0.25% 磷酸氢二钠0.05% 七水合硫酸镁0.1% 七水合硫酸铁0.01% 酵母膏0.05% 孟加拉红0.003% pH4.5 2 Ashby无氮培养基 富集好养自生固氮菌 甘露醇1% 磷酸二氢钾0.02% 七水合硫酸镁0.02% 氯化钠0.02% 二水合硫酸钙0.01% 碳酸钙0.5% 酵母菌在自然界中广泛分布，主要生长在偏酸性的含糖环境中，以水果、蔬菜的表面和果园的土壤中最为常见。酵母菌主要营腐生生活，在生态系统中属于分解者。酵母菌的用途相当广泛，涉及到工业、农业、畜牧业、医学和现代生物学技术等诸多领域。在现行的高中生物学教材中，常以酵母菌作为一种代表生物，在历届高考中也常以“酵母菌”为素材来命题。考查的知识面广，命题角度多样，并且与现实生活联系紧密。因此，应将高中生物教材中有关“酵母菌”的知识进行归纳、整理，构建知识结构体系，才能达到高三复习应有的广度和深度。下面就根据自己的教学体会来谈谈对酵母菌的复习，谨供老师和同学们在复习时参考。一、形态结构：酵母菌是典型的单细胞真核微生物，无鞭毛，不能运动。其细胞直径一般比细菌直径粗10倍。一般呈球形、卵圆形或柱形，大多数酵母菌菌落呈圆形，比细菌大而厚。菌落的色泽、质地、表面和边缘形状等特征，是酵母菌菌种鉴定的重要依据。细胞结构类似高等生物，由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核构成，在成熟的酵母菌细胞中，有一个大型的液泡，其内含有一些水解酶等物质。
21 乳酸菌的检测依据：GB/T 4789.35《食品卫生微生物学检验乳酸菌饮料中乳酸菌检验》。乳酸菌计数时：应把嗜热链球菌和双岐杆菌计算在内。检验益生菌时：检测之前初步判断其所含乳酸菌属（一般样品的说明中会注明添加的益生菌种类），根据乳酸菌属确定培养方法和所用培养基及接种条件，具体依据GB/T4789.35中规定，如只检双歧杆菌必须用涂布法且厌氧培养，如样品不含双歧杆菌，且作乳酸菌计数时可采用倾注法。培养基的选择：13在国标GB/T4789.35-2008中明确说明：根据样品中含有乳酸菌属的不同选择不同的培养基：(1)只含有双歧杆菌属，采用MRS琼脂培养基专性厌氧培养；(2)只含有乳杆菌属，采用MRS琼脂培养基兼性厌氧培养；(3)只含有嗜热链球菌属，采用MC琼脂培养基兼性厌氧培养；(4)同时含有双歧杆菌属和乳杆菌属，采用MRS琼脂培养基专性厌氧培养和兼性厌氧培养，总数为两种培养基上菌落总数的加和；(5)同时含有双歧杆菌属、乳杆菌属、嗜热链球菌属，采用MRS琼脂培养基专性厌氧培养和兼性厌氧培养及MC琼脂培养基兼性厌氧培养，总数为三种培养基上菌落总数的加和。双歧杆菌的计数：只要样品配料中加入双歧杆菌菌种，不论添加多少双歧杆菌菌种，不论有无独立的双歧杆菌的卫生指标标准，进行乳酸菌计数时必须进行双歧杆菌的检测。菌落的计数及结果的报告：(1)分别选取乳酸菌菌落数在30-300之间的平板进行分别计数，具体计数方法及菌落的报告依据GB/T4789.2中规定进行；(2)最终的结果取其和，报告方式依据GB/T4789.2中规定进行。
太麻烦的，要有条件，把样品稀释后，例如估计含乳酸菌的量，稀释到每毫升大约30-300个左右，再用特殊的平板培养基，添加了1%碳酸钙的平板培养基，采用倾注法与呈液体状态的40度含碳酸钙的琼脂营养培养基混合，倒制于90毫米在小平皿中，培养后，长出菌落，同时，菌落周围有透明圈的，就是乳酸菌，还可以计数，再剩稀释倍数，还可得含量。
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电气自动化单片机论文
现在是个计算机和信息技术都在高速发展的时代，而且越来越受到重视的智能技术的开发的速度也在加快增长。计算机的智能化程度在不断的发展，应用范围也从原先的相对单一到后来的多元化发展。只要你到网上查一查，在海底的深处，是不是有一个个白色的东西。接下来我搜集了电气自动化单片机论文，仅供大家参考，希望帮助到大家。
摘要 ：
单片机是当前被运用到各个领域的一个技术产品，随着当前社会生产活动的增多，单片机被运用到众多的生产领域中，在一定程度上提升了人们的生活水平和质量。就当前单片机的使用情况看，单片机更多地被运用到电子技术领域中，提升电子领域的发展程度，例如在仪表仪器中使用单片机可以提升其智能程度;单片机在工业控制中通过自身功能的发挥，可使工业控制更加先进化。该文从单片机的概述入手，研究在电子技术发展中单片机运用的程度。
关键词 ：
单片机；电子技术；应用研究
20个世纪70年代，单片机得到快速的发展，形成一个品种较为全面，功能更加强大的技术产品，开始在各生产领域中运用。随着近半个世纪的发展，单片机取得更优质的成果，科技水平更加先进，在众多领域中实现高效运用，提升这些领域的发展程度。单片机现在在电子技术领域中得到广泛的使用，如在通信功能、仪表仪器等方面实现高效的运用，促进这些企业实现优质的发展。同时，随着单片机运用程度的增加，应用领域的扩展，其技术呈现创新发展趋势。
1、单片机的科学分析
1.1概述
单片机是嵌入式系统的一个组成部分，它采用规模较大的电路技术将CPU、RAM、ROM以及定时器等众多功能集成在一个硅片上，继而形成一个具有完善功能的，微型的计算机系统。单片式是1970年左右开始在生产中运用，随着多年技术的革新和使用程度的加深，当前它在汽车电子，医疗器械，工业控制以及仪表仪器中得到运用。单片式发展速度较快，由最开始的4位单片机发展成8位单片机，到目前300M具有高速运转和处理能力的单片机。
1.2主要特点
单片机是当前计算机发展的一个重要组成部分，随着计算机水平的增长，单片机也呈现高效革新的态势，且呈现不同用途的，不同型号的单片机产品。以AT89S52型号单片机为例，单片机目前重要的发展特点有6个方面。第一，单片机具有使用方便的特点，单片机整体体积较小，系统构成较为简单，整体呈现模块化;第二，对环境的要求较低，单片机具有较强的环境适应能力，可以在不同的环境得到运用;第三，控制能力较强大，单片机有着较强的科技力量，通过众多功能的集成，其具有很强的控制功能;第四，功能消耗较低，单片机在运行的时候只需要较低的电压，整体对功能的消耗低;第五，速度快，单片机具有极强的处理功能，对各项数据和信息有着极快的处理速度;第六，可靠性高，单片机可以实现长时间的工作，提升整体系统的运转能力。
2、电子技术中单片机的应用情况分析
2.1手机通信中的运用
单片机在电子通讯中得到运用，主要体现在手机语音功能的建设中，单片机对手机语音信息进行识别，并开展相关操作。在手机的音频入口安置单片机可以使其收集众多的音频信息，系统分辨工作开展之后，向各个部件下具体的指令和信息，实现语音信息中的手机操作。
2.2单片机提升医疗器械诊断正确性
人们在实现温饱之后，更加关注自身的健康，对医疗水平有着越来越高的需求。但是，在医疗建设的过程中总会出现一些问题，检测手段以及消毒水平存在一定的不足，影响整体医疗建设的质量。单片机在医疗器械中得到运用之后，大大减少了医疗问题的出现，使医疗工作得到一定程度的提升。单片机的使用增加了医疗设备的诊疗准确性，提升了诊断的精准性。同时，随着单片机在医疗器械中的运用，整体医疗设备朝着更加智能化、自动化的发展方向前进，使医疗诊断的结果更加精准，更好地为人们的健康提供医疗保障。
2.3单片机使仪表仪器的使用更加智能化
单片机因其集成度高等特点被用于仪表仪器的生产，随着单片机科研水平的不断革新，仪表仪器的发展更加智能化，更加符合当前人们的使用需求。同时，随着单片机使用程度的增加，仪表仪器设备朝着数字化方向发展，整体测试水平较高，仪表仪器控制和处理的功能建设更加优质。例如，在航天仪器制造的时候，使用单片机这种先进的技术可以使仪器的精准性和集成性更强，提升航天电子系统的数字化程度，大大降低航天事故发生的几率。
2.4家电中普遍使用单片机
单片机不仅在高科技的领域中实现运用，如医疗器械、仪表仪器等领域，同时也在日常生活中得到运用，例如在家电行业中。随着科研水平的发展，单片机越来越多地在生活中得到运用，提升人们生活的质量和幸福感。当前人们家庭生活中使用的洗衣机、微波炉以及电视机等家电都运用了单片机这项技术。在电视机的运用中，通过使用单片机使其系统控制技术更加先进，功能操作更加便捷。例如，人们可以通过遥控器自由切换不同的电视频道，选择自己想看的电视节目。单片机在微波炉建造中，通过系统信息的处理，可以根据食材的不同进行科学的、自动的选择工作，主要是选择加热时所需要的温度和具体时间。单片机在洗衣机的系统控制中，可以根据衣物的材质以及脏污程度进行自动洗涤，对洗衣液的使用量、洗涤的强度控制以及详细的洗涤时间有着科学的控制和选择。
3、单片机在未来电子技术领域中开发趋势分析
随着社会生产实力的增强，科研技术程度更加深入，单片机型号和技能革新的速度会越来越快，其在电子领域的应用开发主要从以下3个方面进行。
3.1对单片机程序开发
随着单片机自身开发程度的加深，其在嵌入式系统的建设中得到越来越全面的运用，目前已经不在裸机的环境中实现开发和使用。单片机已经实现一定程度的自动执行，可以对数据进行较强的储存，科学处理和传输数据。单片机具有较强的环境使用能力，可以保障计算机在不同的环境中实现正常的运转和数据的处理，对外界的物理参数实现高质量的采集，并对其进行逻辑分析和正确的处理。
3.2优化C语言系统程序
C语言有着强大的数据处理能力，可以以简易的方式对编程语言开展编译、处理等工作，有着强大的编程能力。为了使单片机在复杂的计算数据和控制数据的环境中实现正常的使用，提升系统的集成和控制能力，一定要加强C语言在单片机中的运用程度。通过对C语言更深度的开发，可以加大单片机的开发程度和力度，进而拓展单片机使用和运用的范围和领域。
3.3加强对计算机的研发
目前，单片机的制作中使用众多的通信接口，通过接口的连接可以和计算机进行数据的交流和沟通。可以说，单片机通过通信接口可以让通信设备和计算机形成一定的联系，可以使双方进行精准的数据支持，提升设备对数据的使用程度和运用程度。为此，要想对单片机进行深度的开发，应该对计算机进行系统的分析和运用，提升数据连接和传输的质量。
4、结语
单片机是当前计算机发展的一个重要组成部分，随着计算机水平的增长，单片机也呈现高效革新的态势，在电子领域实现高效的运用。突出表现在手机通信中和家庭电器的使用中，提升人们的生活建设质量。同时，单片机使仪表仪器的使用更加智能化，提升医疗器械的诊断正确性。在未来的发展中，可以通过对单片机程序进行开发、优化C语言系统程序以及加强对计算机的研发这3个方面提升单片机在电子领域的运用程度。
参考文献
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[5]许文涛.单片机在电子技术中的应用[J].黑龙江科技信息，2016(19)：15.
【 摘要 】
过去的以教师为中心的单片机课程教学，由于课程的综合性太强使得学生在学习过程中对很多知识点难以接受，我们通过对本门课程项目式和模块化改革的结合，合理安排教学内容和教学资源，降低初学者入门门槛，引导学生以兴趣为导向，极大的提高了学习者主动获取知识的意愿，明显提高了本课程的教学效果。
【 关键词 】
模块化教学；项目驱动；教学改革
“单片机技术”课程在本科院校里是电子信息类专业的必修课程，这门课程是以电子技术基础，编程语言，计算机理论等知识为基础的一门专业性和应用性很强的综合性课程。基于以上特点，对于初学者来说对单片机的理论知识的正确把握往往感觉比较吃力，给初学者造成学习困难。但是经过我们多年的教学经验，这类有很强的应用性和实用性的课程，以项目式教学更能推动学生的学习兴趣，同时模块化的教学设计更能降低初学者入门的门槛。两者相结合教学方法的采用对本门课程的教学效果提升明显.
1、单片机项目驱动教学法
以往的单片机教学模式是以教师为中心，老师在课堂上按照教材，或者教学大纲按部就班的讲授理论原理和知识点；以课堂教学为中心，学生学习为被动接受，由于知识点综合性比较强，理论太深奥使得学生往往学习兴趣不高，同时缺乏动手实践机会，教学效果一般不够理想。以项目驱动的教学法是学生为主体，教师为主导，以实践应用为根本目标，围绕具体的项目构建教学内容体系，通过师生共同参与完成一个具体的项目而展开的教学活动。注重的不是最终的结果，而是项目完成的过程，在项目的教学实施过程中，学生按需学习，亲身实践，学生在项目的实践过程中，理解知识和掌握技能，学习成为一个参与的创造实践活动，培养分析和解决问题的能力。引进单片机项目教学方式打破了原有的教学组织安排，以项目的开发步骤作为教学内容，将课程的内容分解为一个个小项目，从项目引入到项目解析再到任务分解然后到知识点讲解最后知识点应用，将原教学方案里单片机的知识点穿插到具体项目开发的过程中。这里面包含了软、硬平台搭建到项目展开再到项目完成的一系列教学活动，使学生从被动学习变为主动学习，按照这种方法我们将以往教学体系中的知识内容变化为若干个工程项目，然后围绕着这些工程项目任务的展开同时开展教学，让学生以具体工作目标的展开来进行教学环节的工作。有利于激发学生的学习积极性和创新能力，调动了学生的学习积极性。在这整个过程中，学生能很好的把握课程的知识要求，在体验创新与探索的过程中，又培养了学生们的分析解决问题的能力及团队协作能力等。
【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.netpolyA( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 19761〔2〕 ven den Hoogen BG, de Jong JC , Groen J , et al , A newly discoveredhuman pneumovirus isolated from young children with respiratory tractdisease1 Nat Med , 2001 , 7 : 719 - 7241〔3〕 Fouchier RA , Hartwig NG, Bestebroer TM, et al1 A previously unde2scribed coronavirus associated with respiratory disease in human1 ProcNatl Acad Sci U S A , 2004 , 101 : 6212 - 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All rights reserved.
PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
2.1 实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
2.2 多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
2.3 单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
3.1 PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
3.2 PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
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