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可能就是通过不正当的路子发表的吧，应该是没有经过任何的审核。
现在具体情况还不明确，工作组已经去该杂志社进行调查，之后会把事情的真相公诸于众。
对从事生物学、医学与药学专业的研究生而言，能让自己的文章在SCI期刊发表是一种莫大的荣耀。说的世俗一些，一篇SCI论文（哪怕是IF低于1.5分的期刊）会为一名硕士带来不少荣耀。当然了，对博士研究生而言，SCI的IF是关系到其能否顺利毕业的保证。前期在论坛上看到博士毕不了业，对导师以死相逼。究其原因仅仅是因为一纸论文。发表SCI论文真的有那么难吗？笔者看来有实验结果发表SCI论文其实不是一件难事。这里实验结果不一定就是国内的教授们的“首次报道”类的结果。如果你的试验结果可以组织成一个合理的story，完全可以去投稿SCI论文。 1. 论文写作论文写作非一日之功。前期要阅读大量文献，并将阅读文献做一个小记，这样不会出现读完后一点儿印象都没有。更重要的是为以后的参考文献选用打下良好基础。因为你引用参考文献时要有针对性，不能乱引用。比如说你在Cell中读到1985年Blackburn E H女士与其博士后Greider CW发现了端粒。那么你就记录一下，用到的时候很方便。在这里我建议大家采用Endnote管理文献，该软件对文献管理与论文写作非常有用。采用该软件你可将所有的文献进行分类管理，并可在摘要内做适当记录。在书写论文时，Endnote在参考文献管理方面的优势就体现出来了，一切参考文献都是一键输入，根本不用手写。大家都知道投稿鲜有一次成功的，每种期刊都有其特定的参考文献要求，万一稿件不中，还要修改转投其他期刊，如果其他期刊的参考文献不一样，那么你惨了。你需要人工修改。使用Endnote则很简单，Endnote收录高分期刊的参考文献模板与写作模板。所以你根本不用愁格式。如果低分的期刊没有收录其参考文献模式与写作模板，你有两个办法：一，找一个相同的参考文献模板引用。例如你投稿到ABBS，你发现Cell的文献文献格式与其相同，你只需要在Endnote插入格式内选择Cell的文献格式就可以了。一键完成。二，如果你是在找不到相同的模板，那你就自己编写吧，也很简单。在这里我就不赘述了。阅读了大量论文，试验也做的差不多的时候。需要着手写论文了。写作论文时一定要集中时间写。在写作时不一定非要从Abstract写到Acknowledgement。你可以最后写方法与致谢，但是摘要一定字斟句酌，摘要是一篇文章的高度概括。大家在搜集信息时一般看看文章的摘要就知道这篇文章是否适合自己去阅读。文章的摘要需全面体现开展该项研究的意义的深度概括。Introduction主要是概括该领域的研究，引出待解决、需研究的问题。说明为何开展该项研究等等。材料与方法就相对好些了，详细阐述方法与步骤即可。结果与讨论也非常重要。结果部分将试验结果展开论述，一般辅以图片说明。试验图片一定要清晰，否则审稿人会让你重新进行一次试验的。说句不负责任的话，你可以拼错一个单词，但是图片不可以出现模糊或不清晰这种情况。讨论就是对结果的意义进行进一步探究。SCI期刊的讨论不像国内期刊最后的讨论那样写的天马行空，就事论事、简洁是讨论写作的基本原则。2. 论文定位稿件分为综述性文章与实验性文章。投稿时首先对自己的论文有一个准确的定位，这就需要阅读大量的文献，掌握目前该领域研究到了什么状态，研究的热点是什么。你的工作对当前研究有什么意义。期刊是读者交流的主渠道，很多科学家在从事类似研究，有很多未解决问题困扰着他们，如果你的研究能对这些困扰提出一个论据，哪怕是一个细小分支。你的这篇论文也可以投一篇IF较高的期刊。我研究生时的专业是端粒酶。该领域的研究主要是围绕着端粒酶活性检测与端粒与细胞衰老信号通路的关系。端粒酶检测方法在1994年就已经发表，现在方法很成熟，试剂盒都研发出来了。对于端粒酶与细胞衰老方面存在很多的信号通路，如果能找到一些调节细胞信号通路的因子，那么高的可以发到Cell，低的也可以发到3分以上的期刊。如果你对信号通路进行综述，除非是该领域的大牛进行综述，否则该综述不可能被收录，因为信号通路这一领域很难解释一个所以然。如果能解释所以然，这篇文章可以在Cell上发表。如果你对端粒酶检测方法进行综述，你就Out了。这种综述90年代就发表了。所以投稿前，一定要掌握该领域的研究趋势，明确自己的结果在投稿时的定位。3. 选定期刊稿件定位后，就开始选择期刊了。选期刊怎么选？在Google上搜索？那真是海底捞针了！我推荐大家每人拥有近3－5年的影响因子表格。一般期刊的影响因子的变动不大，在Excel表格内将采用IF升序或降序的方法排列。如果你觉得你的文章可以投稿到1分的期刊，那么你就在IF为1的期刊列内搜索，找到生物学、医学、药学领域的期刊，一次多找几个。然后到期刊的官方网站去看该期刊的征稿范围（Scope），确保范围准确。4. 在线投稿现在Elsevier、Springer、Wiley这些数据库等均采用在线投稿的模式，所以投稿者需对投稿系统有所了解。第一次投稿由于不熟悉投稿界面，经常会出现一些意想不到的问题，这个多操作几次就熟练了。每种期刊的系统不同，但是原理是相通的。一般在投稿时会需要写作Cover Letter，这个需要事先写好，到时候复制、粘贴就可以了。后续的交流主要是通过邮箱进行，所以邮箱一定是常用邮箱。这个很重要。5. 文章审理一般情况下，投稿一周内会收到期刊编辑的邮件，会告知你的稿件已经给了审稿人。文章审理工作就此开始了。审稿人对你的论文进行评述，然后将意见反馈给期刊编辑，后者将意见反馈给你。一般审稿人都会有两名，给出的意见采用概率分析方法无非就这么几种：当然有些期刊存在3名评审人员的可能，这里就不多说了。道理是一样的！两优评恭喜你，你的论文进入到了minor revision（小修）阶段。离文章发表仅有一步之遥了！当然不能大意，有些进入到这一环节也被拒稿的。只需要按照评审人的要求仔细修改，发表应该没问题一优评，一差评 这是常见的，称之为manor revision（大修）。这里你要做的就是将差评的内容进行修改，并逐条进行回复。请注意是逐条修改，逐条回复。优评的如果有要求，你也要回复。同样的处理。回信时你需要告诉编辑，建议采用分条的方法，逐条列出。这样条理清晰。如果你修改的符合评审人员的要求，你就进行minor revision或者直接发表。如果不符合要求，你的结果就是拒稿。两差评理论上你存在转变为大修与小修的可能，但实际上可能性不大。你需要转投其他稿件了。稿件派给审稿人到审稿人给出回复时间（也就是编辑给你回复的时间）差不多在25天左右。大修与小修给的时间分别不同，大修的时间有时候跟稿件派给审稿人到审稿人给出回复时间相同，小修时间会短一些，但不排除与稿件派给审稿人到审稿人给出回复时间相同的可能。6. 论文接收论文接收后的心情绝对是不一样的。那时候你会发现自己这么多年来的熬夜与坚持不懈是多么的值得。导师也会对你温和了很多。师弟师妹们会簇拥到你那里请教。。。这是闲话，说说论文接收后的工作吧，就是移交版权（你将出版权出让给期刊）。这时候官方的互动就不是你的事儿了，导师会跟那边交流。需要你的他自然会去找你。期刊一般会有稿酬，一般100-200美金。这笔费用你拿不到。因为期刊建议你不要拿这笔费用，因为他们在来信说编辑与审稿人很辛苦，这笔费可以给他们买点儿礼物。导师会顺水做个人情，告诉你这个钱咱不要了。那时觉得论文发表很开心，所以这钱就不要了。哈哈！有彩页的要交钱，不用不低，不过不用担心，只要你论文发表了，这钱导师出。版权出让，拿到接收函后过一阵子期刊排版，会给你一份稿件让你校对，看是否有错误。没错误那里就准备发表了。之后你就等着期刊在线刊登吧。这是我的一些论文发表心得，分享给大家。大家觉得有不妥的地方，欢迎交流！注：本文是我在创新医学网看到的感觉挺好转过来的希望能和大家共同学习。
就在最近，在河南郑州一职业培训学校，该学校的校长在一本名叫《写真地理》的杂志上发表了一篇以熟鸡蛋返生为主题的论文，这件事很快就有得到了大众的关注。该名校长所发表的论文中，该校长的论文中的“选择正常新鲜的受精鸡蛋，经过开水煮沸以后，变成熟鸡蛋，再通过’特异学生’的意念和’能量传播’使鸡蛋还原成生鸡蛋，做到不伤害鸡蛋的生物活性，使它能正常孵出小鸡，并能够正常生长”这一段话，很快就受到了相关部门以及网友的关注。很多网友都在想，为什么这篇天马行空的，毫无科学根据的论文却能够过审成功，还刊登在杂志上的呢？并且这篇论文还很夸张的在摘要中声称熟鸡蛋孵化的相关实验已经成功了。他们密切的关注着孵化过程，最后成功孵化出的新的雏鸡是具有同样的生命力的。无论从哪个方面来看，这样的说法都是非常的愚昧并且无知的。
我想熟熟鸡蛋能够孵出小鸡这种想法真的是非常的天马行空。这不免让人思考为什么这个毫无科学依据的文章却能够刊登在这本杂志上呢？并且《写真地理》这本期刊是具有一定权威性的期刊，他的刊登过的很多论文都是可以在知网上查到的。这样子的不负责任的刊登文章真的不会给别人带来误解吗？
自从这件事情被爆出之后，很多人都在讨论为什么这样的反智论文可以过审并且刊登出来呢？我觉得这件事就变相的反映出了现代社会科学领域的一些幕后操作。好像如今发表一篇论文变得更加的容易了。即使文章里没有真正的有用的内容，也可以很简单的发表了。这对那些努力专研科学的人来说真的有些不公平，所以还希望相关部门能因为这件事更加重视这方面的审核。
据学术堂了解，有很多计算机论文都是在《计算机应用》和《计算机研究与发展》这两大期刊进行发表的，很靠谱。《计算机研究与发展》(月刊)创刊于1958年，由中国科学院计算技术研究所、中国计算机学会主办。刊登内容：计算机科学技术领域高水平的学术论文、最新科研成果和重大应用成果。刊登内容：述评、计算机基础理论、软件技术、信息安全、计算机网络、图形图像、体系结构、人工智能、计算机应用、数据库技术、存储技术及计算机相关领域。《计算机应用》(月刊)创刊于1981年，由中国科学院成都计算机应用研究所主办。该刊把介绍计算机应用技术作为重点，以推动经济发展和科技进步为宗旨，把促进计算机开发应用创新作为目标。主要涉及计算机网络与通信、软件应用技术、信息系统集成、数据库、多媒体、图形、图像处理、计算机控制、先进制造技术、人工智能、专家系统及新型计算机软硬件系统开发经验等。
CN就是国内统一刊号CN 类刊物是指在我国境内注册、国内公开发行的刊物。该类刊物的刊号均标注有 CN 字 母教育类的期刊我给您介绍一些《新课程》《教师》《中国教育技术装备》《中国校外教育》《新作文》《教学与管理》《职教论坛》《继续教育研究》《新课程学习》《考试周刊》《中国科教创新导刊》等等这些都是可以的天天期刊网 是专业的论文发表机构 ，你可以去他们那看看 关于论文发表做了如下总结您可以作为参考 现在发表论文都是在学术期刊上面发表。所以，要问清楚你们有没有特别规定的期刊。至于学术期刊的分类，现在也就是省级、国家级、核心、这几类。由于作用不一样所以发表期刊的等级也是有要求的。
到中联论文网，或天天期刊网。一个是论文最全的知识宝库，一个是期刊最全的。都可以发表党史博采。
一般发国家级正规期刊都是可以的，但是为了保险期间可以发一些质量好一些的刊物，比如《中国卫生产业》《中国伤残医学》《海峡药学》《中外医疗》等等的，你可以去 天天期刊网 咨询下，他们的专业客服会为你解答的，希望采纳~！
三次经验告诉你，凡事什么事都还没干就要收你钱的，多半不靠谱。我最后是找山东凤鸣文化传播有限公司发的，没有定金什么的，录用后支付的版面费。价格来说还算公道
1.首先得有你自己创作的文章2.根据你的文章内容以及方向去选择知网收录的刊物3.然后投稿送审 录用 定版 邮寄样刊 最后上网检索文章
请问一下如何在中国知网上发表论文？？ 知网不能发论文，只能收录论文，可以发到被知网收录的期刊上。可以联系我哦 怎样在中国知网论文上发表论文？ 中国知网只是收录学术论文期刊的网络载体 需要在收录的学术期刊里面寻找适合自己学术领域的期刊进行发表 给您推荐《科技传播》杂志国家级科技学术期刊 中英文目录 知网万方全文收录 百度空间有详细期刊信息 在知网上发表论文有什么益处？ 你可以更有名，哈哈。 读书的话，可以有益于申请很多东西啊，什么奖啊。 有的学校还能直接保研 如何在"中国知网"上查询自己发表的论文? 前提是你要在正规的期刊上发表过，然后你打开知网就能看到检索栏。输入你的名字或者论文的题目就可以了。九品论文发表助您学业事业步步高升 在知网怎么查询已经发表的文章 登陆ki，点击左上角“旧版入口”，弹出页面后在“检索项”选择“作者”，在“检索词”中输入自己的名字，点击检索即可。 论文怎么发表在中国知网，或者出现在中国知网上面，知道的给点具体点的，谢谢了啊 1、首先，你先发表在知网收录的期刊中，注意是正式的期刊，不是加刊之类的。具体的可以查查知网上面的期刊目录。 2、待知网更新的时候会将你的文章收录进去，就可以出现在知网上面了。 怎么在中国知网上免费下载自己发表的论文？ 不能免费的。 怎么在中国知网中查询核心期刊的文章 使用中国知网的高级检索可以实现查找核心期刊，具体步骤： 中国知网首页 → 点击右侧的“高级检索”按钮 → 进入高级检索界面（见下图） → 选择“期刊”（图中1） → 在来源类型 → 勾选“核心期刊”（图中2），即可。 在知网上发表了文章、可以增加内容和修改? 你逗我吗，知网是一个检索的网站，并不是发表论文的网站，在期刊上发表了论文可以上知网，增加内容、修改？那更是不用说了，不可能啊，除非你重新发表一篇。 在中国知网上如何只搜索核心期刊上发表的论文 你好，不要选择跨库检索，直接选择“中国期刊全文数据库”，然后进入检索页面的时候，最下面一行有一个“范围”，可以选择“EI来源期刊”“核心期刊”等。 我专门为百度知道提问者提供论文。 还有什么不明白时请百度hi我，我常在线，不在线时也可以发百度消息给我，但不要留言，我不常到空间去，直接写问题补充我也很少看得见的。 希望对你有帮助！ ——百度知道 举手之劳团队 队长：晓斌11蓝猫
网上的期刊代发的有很多论文发表网站，也有一些是淘宝店，还有一些是个人，这个没法笼统的说，就好像之前刚刚在网上做生意的一样，可能也是有靠谱的有不靠谱的，就是辨别起来十分吃力，因为这个一般人不了解这个期刊的知识，有的只看价格，价格低了就觉得靠谱，所以容易发表到假刊上或者定金。建议你发表论文之前先去学习下论文发表知识，你可以去淘淘论文网上看下，上面有不少关于发表论文的知识，比较实用。
职称论文三大网站是知网、万方、维普。
1、中国知网
知网一般是中国知网。知网是国家知识基础设施的概念，由世界银行于1998年提出。CNKI工程是以实现全社会知识资源传播共享与增值利用为目标的信息化建设项目。由清华大学、清华同方发起，始建于1999年6月。
提供CNKI源数据库、外文类、工业类、农业类、医药卫生类、经济类和教育类多种数据库。其中综合性数据库为中国期刊全文数据库、中国博士学位论文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库、中国重要报纸全文数据库和中国重要会议文论全文数据库。每个数据库都提供初级检索、高级检索和专业检索三种检索功能。高级检索功能最常用。
2、万方
万方数据库是由万方数据公司开发的，涵盖期刊、会议纪要、论文、学术成果、学术会议论文的大型网络数据库；也是和中国知网齐名的中国专业的学术数据库。
其开发公司——万方数据股份有限公司是国内第一家以信息服务为核心的股份制高新技术企业，是在互联网领域，集信息资源产品、信息增值服务和信息处理方案为一体的综合信息服务商。万方期刊集纳了理、工、农、医、人文五大类70多个类目共7600种科技类期刊全文。
3、维普网
维普网，建立于2000年。经过多年的商业运营，维普网已经成为全球著名的中文专业信息服务网站。网站陆续建立了与谷歌学术搜索频道、百度文库、百度百科的战略合作关系。
网站遥遥领先数字出版行业发展水平，数次名列中国出版业网站百强，并在中国图书馆业、情报业网站排名中名列前茅。
（1）比较好的论文期刊网站。按数据库来说，知网，也就是CNKI，万方数据库，维普网，这三个都是论文数据库，可以在里面检索论文，知网最权威。（2）按照论文发表网站来说。中国科技论文在线，可以直接在上面发表论文，有些单位也认可。淘淘论文网可以帮忙快速发表论文，是比较靠谱比较专业的论文服务机构。这两个都是不错的。
最好的学术论文发表网站？我看到：通知：部分论文、考试取消、条件放宽。查阅各省最新政策可搜：全国论文办郑州郑密路20号办（简称、统称，搜索可查各省全部政策，在百度、360、搜狗58-68页，也可搜17年前的：全国论文办郑州郑密路18号）、全国职称办郑州郑密路20号办、高级职称全国办郑州郑密路20号办。 搜：高级经济师郑州郑密路全国办、高级会计师郑州郑密路全国办、高级农经师郑州郑密路全国办、高级审计师郑州郑密路全国办、高级统计师郑州郑密路全国办、高级政工师郑州郑密路全国办、高级工程师郑州郑密路全国办、高级教师郑州郑密路全国办、高级人力资源管理师郑州郑密路全国办。在百度、360、搜狗58-68页。 查阅最新政策、论文（选题、题目、范文、辅导）、报考条件、评审条件、考试科目，搜：高级经济师最新政策郑州郑密路全国办、高级经济师论文郑州郑密路全国办、高级经济师论文选题郑州郑密路全国办、高级经济师论文题目郑州郑密路全国办、高级经济师论文范文郑州郑密路全国办、高级经济师论文辅导郑州郑密路全国办、高级经济师报考条件郑州郑密路全国办、高级经济师评审条件郑州郑密路全国办、高级经济师考试科目郑州郑密路全国办。后面把“高级经济师”依次换成“高级会计师、高级农经师、高级审计师、高级统计师、高级政工师、高级工程师、高级教师、高级人力资源管理师等”再搜索。在百度、360、搜狗58-68页。
从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。
2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。
在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。
2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。
CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所
“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”
除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”
此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。
Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”
该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。
3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）
A.质粒示意图；B.N2a细胞中 Pten 的下调；C.Western检测PTEN及AKT的表达； D.CasRx与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；F.G.H.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达
图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）
A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；E.F.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。
图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）
A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；B.C.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；D.VEGFA蛋白的表达；E.AAV病毒质粒示意图；F.实验流程图；G.CasRx的mRNA表达水平；H.I.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；J.CNV诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；L.M.CNV面积统计。
2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。
该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。
人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。
在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。
作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。
帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。
该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。
大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。
研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。
为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。
在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。
（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。
（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。
（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only 2.8 kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
[ https://www.obiosh.com/kyfw/zl/aav/209.html](