论文番茄抗寒性研究进展

（1）含目的基因的外源DNA分子上有PstⅠ、SmaⅠ、AluⅠ三种限制酶切割位点，但用AluⅠ切割会破坏目的基因，单独用PstⅠ切割会导致目的基因或质粒自身环化，也会导致目的基因和载体的黏性末端发生任意连接，因此为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ分别对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割；用限制酶PstⅠ、SmaⅠ切割含目的基因的外源DNA分子后会产生4种DNA片段，而用限制酶PstⅠ、SmaⅠ切割质粒后会产生2种DNA片段．（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有抗氨苄青霉素基因作为标记基因．（3）将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；在个体水平检测鱼抗冻蛋白基因是否表达，通常采用将植物在寒冷的环境中培养方法．故答案为：（1）PstⅠ、SmaⅠ含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒    4、2（2）抗氨苄青霉素基因（3）农杆菌转化    将植物在寒冷的环境中培养

番茄种质资源是其遗传育种的基础，番茄育种中几乎每次重大突破都是与重要材料的创新与利用相联系的。种质资源越多，研究越深入，就越能加快新品种选育的速度。筛选和创新高产、抗多种病害、高品质、耐高温和低温胁迫、抗旱、耐盐等种质一直是番茄遗传育种研究的重点。番茄种质资源创新最有效的手段是常规育种，此外还有基因工程、诱变育种和原生质体融合等途径。

一、常规育种与多种新技术相结合创新番茄种质

至今，常规育种技术仍然是创新番茄资源最有成效的手段，几乎所有育成的品种和杂交种，所有的亲本、自交系，以及所有野生番茄中的抗病虫、抗逆、高品质等基因向栽培番茄骨干亲本的渗入几乎都通过常规育种方法实现。利用基因工程、诱变育种、原生质体融合等手段所获得的番茄新种质，也最终需通过常规育种程序来选择和验证。

（一）常规育种与抗病性鉴定技术相结合加速抗病种质的创新

常规育种创新抗病材料突出的例子是Manapal番茄的选育、引进及其在育种中的广泛应用。Frazier，.（1946）在夏成夷农业试验场采用秘鲁番茄（）、醋栗番茄（）、多毛番茄（）这3个野生番茄复合杂交选育得到抗病品系，SOOST，.（1958，1963）根据抗病性的分离比例明确了抗病性由显性基因控制，Clayberg，.（1960）将其定名为Tm-2，并将其定位于第9条染色体上，和nv（netted viresent）连锁。（1971）利用回交育种方法连续9次回交将抗病基因和nv基因导入到了Manapal中育成Manapal Tm-2v，纯合的Tm-2v其植株表现为抗病、矮缩、黄化、生长缓慢。日本引入该抗病材料后，育成强力玲光、强力圣光、强力明光等品种，中国引入该基因后育成不同类型的亲本材料，选育出高抗番茄烟草花叶病毒（TMV）的中蔬、中杂、红杂、苏抗、佳粉、西粉、浦红、浙红、浙粉、东农、渝红等系列品种，解决了中国番茄生产中TMV的危害问题，在20世纪90年代，每年制种10万kg，约占番茄用种量的50%以上。随后，中国又引进了抗枯萎病、叶霉病、根结线虫、青枯病、晚疫病等抗性材料，在番茄抗病育种中发挥了重要作用。

（二）常规育种与分子标记辅助选择相结合创新优异种质

国际知名的种子公司如孟山都、先正达、安莎、瑞克斯旺、龙井、农友等已将分子育种作为其育种的重要手段，并将一些番茄重要性状如抗病毒、真菌、抗虫、抗逆、高品质基因等的分子标记引物序列应用于分子标记辅助选择。这些公司利用上述方法已聚合了一批同时含有3～6个抗病基因的育种材料。育成的番茄品种可抗ToMV、叶霉病、枯萎病、根结线虫、黄萎病、细菌性斑点病等6种病害。同时，还加强了对番茄重要园艺性状如品质、抗逆性、产量等数量性状的分子标记辅助选择研究。

国内的研究者从“十五”开始，逐步建立了番茄高产，抗病毒病、叶霉病、枯萎病、细菌性斑点病、晚疫病、青枯病、抗根结线虫，高番茄红素、高可溶性固形物等基因的实用分子标记，并利用分子育种手段创新了同时含有4～5个抗病基因且园艺性状优良的育种材料。现以中国农业科学院蔬菜花卉研究所对中杂9号母本的选育及其抗病性改良为例简述中国抗多种病害番茄育种材料的创新过程（图24-13）。

图24-13 中杂9号母本的选育及其多个抗病基因的添加

1.中杂9号母本的选育

1986年从荷兰引进杂交种编号为86-5，经过多代自交分离选择，结合人工接种抗病性鉴定筛选，培育出了同时含有Tm1、Cf5和I-1基因、复合抗病性强、产量高、品质优良、对低温弱光适应性强的优良自交系892-43，该自交系即中杂9号的母本。

2.添加抗根结线虫基因Mi和叶霉病基因Cf9基因

课题组用引进的含Cf9和Mi基因的材料041-373，将其与中杂9号母本杂交，再用中杂9号母本为轮回亲本进行连续回交，从回交2代开始，每个回交世代的幼苗在定植之前均进行DNA提取，再用分子标记检测筛选同时含Cf9和Mi基因的单株，淘汰其余单株。连续4次回交和利用分子标记辅助选择后，再进行2次连续自交和利用分子标记辅助选择，结果获得了以中杂9号母本为遗传背景的含Tm1、Cf5、Cf9、Mi和I-1基因的优异种质07g-2，该材料除具有复合抗病性外，其熟性、丰产性、株型、耐低温弱光性等均与中杂9号母本相当。

3.添加抗细菌性斑点病基因Pto基因

课题组再次将引进的含Pto基因的材料Ⅱ6A-986，与07g-2杂交，再用07g-2为轮回亲本进行连续回交，从回交2代开始，每个回交世代的幼苗在定植之前均进行DNA提取，再用分子标记检测筛选含Pto基因的单株，淘汰其余单株。上述工作在顺利进行，有望获得以中杂9号母本为背景遗传背景含Tm1、Cf5、Cf9、Mi、I-1和Pto基因的优异种质。

图24-14 Mi基因

图24-15 Cf5和Cf9基因

图24-16 含Mi基因抗根结线虫的抗性表现

图24-17 以9706为遗传背景同时含Mi、Cf5、Cf9等6个抗病基因的新种质

（三）数量性状位点（QTL）技术在种质创新中的研究和应用

1.产量QTL

研究发现，在多毛番茄（）、潘那利番茄（）、细叶番茄（）、小花番茄（）、奇美留斯基番茄（）等果实小、产量低的野生番茄中存在增加番茄产量的基因（QTL），目前共鉴定了40个与番茄产量（如果实大小、果实直径、果实重量、前期产量、总产量等）有关的QTL，克隆了一个具有副作用的QTL ，并建立了高产量QTL近等基因系或亚近等基因系。例如TA1229多毛番茄（）的1个近等基因系，含有来自多毛番茄（）第一染色体的长24cM的DNA片段，已经证明，该外源DNA片段为含有增加产量的QTL，能增加植株重量和果实数量，在植株生长的后期仍能维持其生长效率，维持营养生长与生殖生长之间的转化率。

2.抗逆性和高品质QTL

研究者们还利用、、、、、、和的RIL、F2、F3、BC1、BC1S1、BC3、BC4S1、NIL群体，结合RFLP、AFLP、RAPD分子标记方法和QTL分析等技术绘制了不同的QTL连锁图谱，并且分离和定位了近1000个数量性状QTL。这些QTL分别与抗逆性（耐高低温、耐盐、耐涝）、品质（番茄红素、胡萝卜素、可溶性固形物、糖、甜度、酸度、滴定酸、pH、维生素C、干物质、黏度）、果实性状（果形、外观颜色、内部颜色、果肩色素、硬度、弹性、果实心室数、果实种子数、种子千粒重、果皮厚度）、植株形态（植株鲜量、干重、分枝数、叶片节数、第一花序节位、叶长、开花期等）、风味品质[芳香味浓度、柠檬气味、糖味、橘子果实味、药味、pent-1-en-3-one，pentanal，pantan-3-one，2-methylbut-2-enal，haxanal，3-methylpentan-1-ol，（E）-hex-2-enal，Hex-3-en-1-ol，2-（Methylthio）ethnol，3-（Methylthio）propanal，6-Methylhept-5-en-2-one，2-Isobutylthiazole，2-Phenylethanal，Orthomethoxyphenol，Eugenol，Geranlacetone，Beta-ionone]等有关。

目前QTL研究存在的普遍问题是高产量、抗逆性好、高品质等QTL的近等基因系中所含有野生番茄的DNA片段长度比较长，QTL与低产量、小果实等不良基因间连锁累赘的影响仍然较大，在育种实践中直接应用这些高产量QTL仍有很大的难度。因此将常规育种与分子育种相结合，打破优良QTL与不良基因之间的连锁，将高产和高品质QTL导入到目前国内栽培品种的高产量骨干亲本中，则番茄产量、抗病性、抗逆性和品质育种将有望取得突破。

四）远缘杂交创新种质

一些野生种番茄具有普通番茄所缺乏的某些宝贵遗传基因，如多种抗病性、抗逆性（耐寒性、耐盐性），以及具有高可溶性固形物等有价值的性状（吴定华，1999）。因此通过与野生种番茄的远缘杂交也是创新番茄种质的重要方法。近几十年来，国内外的番茄研究者对远缘杂交进行了大量研究，并取得优异成绩。研究者们利用较多的野生番茄主要是秘鲁番茄、多毛番茄、智利番茄和醋栗番茄。表24-5列出了近年所筛选的抗源和育成品系。

表24-5 利用远缘杂交选育的新品系