基因编辑的参考文献

DOI:

microhomology-mediated end-joining (MMEJ)

DNA double-strand break (DSB)

local accumulation of DSB repair molecules (LoAD) system

homologous recombination (HR)

non-homologous end-joining (NHEJ)

homology-independent targeted integration (HITI) system

precise integration into target chromosome (PITCh) system

single-strand template repair (SSTR)

Gaps: 以往的研究从未在多个基因组位点同时产生多种模式或多个报告基因的组合。基因插入在每个位点独立进行，在不同的基因位点上进行双或三重敲入需要一定的步骤。

横向比较： CRISPR-Cas9基因标记使用的方法有（1）同源修复HR，（2）非同源end-joining NHEJ，（3）微同源介导的end-joining MMEJ。虽然HR的方法可以非常精准的knockin，但它的载体的构建和效率远低于end-joining的方法。

工作简介 ：

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原因在于：MS2可以与RNA结合，从而报告RNA的情况，将MS2与CtIP融合，可将CtIP导向到sgRNA所在的位置，形成一个滞留，发挥CtIP增加MMEJ的功效，从而造成了更多的DNA断裂，插入效率增加。

之前我看过一篇文章，说的是CRISPR-Cas9的效果由于P53的存在而大打折扣，而P53对抗HDR是CRISPR-Cas9造成DSB无法被修复，从而介导了CRISPR-Cas9的细胞毒性。那么就会有以下两种情况：（1）P53存在时，CRISPR-Cas9效果不好，且有细胞毒性；（2）P53敲除时，CRISPR-Cas9效率增加，但有致癌的风险。以此引发临床安全性的思考，提醒在人体上使用CRISPR-Cas9治疗需要注意的安全性问题，从而以一个相对简单的故事，发表在了Nature Medicine上。所以，我们在使用基因编辑工具的时候，需要注意一下它的细胞毒性情况。

老板亲自传授的文献阅读方法

（1）FACS结果显示，没有毒性：首先转入已被证实具有细胞毒性的载体来作为对照，MS2-CtIP组没有对细胞增殖产生影响，而ZFN组有。

（2）如我前面所说，DSB如无法被修复，则是细胞毒性。在这里作者也使用DSB修复实验来代表细胞毒性实验，首先使用依托泊苷诱导DSB，然后使用anti-γ-H2AX染色来查看修复情况，发现MS2-CtIP组DSB修复活性显著高于对照组。

以上结果表明，MS2-CtIP是通过诱导DSB修复来达到低（无）细胞毒性的效果。

我就不写了。。。因为我没看明白，嘤嘤嘤。

第一部分主要讲基因编辑系统的构建及基本情况，接下来就要讲一讲它作为一个基因编辑工具的基本素养了。

太多啦！简单说一下，就是对比了MMEJ和NHEJ它们在精确敲入，非精确敲入和未敲入这三个方面的情况，得到MMEJ几乎完败NHEJ的结论咯。 看看这图画得多漂亮！

回归前面说的Gaps，同时对多个基因进行编辑呢？结果显示是可以高效、准确的对多个基因进行编辑。这部分是灰常灰常棒的。

学习一下人家的思路~

创新点在于MS2的定位效应，MS2-CtIP的增强效应，MMEJ的精巧性。

参考文献： Nakade S, Mochida K, Kunii A, et al. Biased genome editing using the local accumulation of DSB repair molecules system[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 3270.

环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类由mRNA 前体(pre-mRNA)经反向剪接形成的共价闭合环状非编码RNA。CircRNA最早是在上世纪70年代在病毒中被发现，但是由于早期RNA文库制备广泛使用polyA富集的方式（circRNA没有游离的5’和3’末端），以及RNA-seq读数要求以线性方式与基因组对齐的计算算法，导致大量circRNA的信息被遗漏，使得人们一度认为环状 RNA 只是错误剪接的副产物，对circRNA的关注并不高。 随着高通量测序技术和生物信息学的发展，成千上万种circRNA被发现，围绕着circRNA的基础研究也越来越多。大量研究表明circRNA在哺乳动物细胞中具有内生、丰富、保守、稳定等特点，并经常表现出组织或时空特异性，可以通过多种机制参与机体生长发育调控，以及疾病的发生和发展。因此，近年来circRNA逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。 根据circRNA序列的来源，可以分为3类： 1. 序列全部来源于外显子，称为Exonic circRNAs   2.  序列来源于外显子和内含子，称为EIciRNAs   3. 序列全部来源于内含子，称为ciRNAs。 circRNA是由mRNA前体（pre-mRNA）经反向剪接（back-splicing）形成的，目前报道的成环模型主要有以下3种： · 内含子反向互补序列驱动环化环化 外显子两端的侧翼内含子含有多对反向互补序列，反向互补序列促使内含子序列配对，使得下游的剪接供体（Splice-Donor）与上游的剪接受体（Splice-Acceptor）靠近，从而结合形成环状RNA。（图1.左） · RNA结合蛋白驱动环化 环化外显子两端的侧翼内含子含有RNA结合蛋白（RBPs）识别的基序，RBP分别与两翼内含子特异基序结合后，会形成二聚体，促进两翼内含子互相靠近，进而连接成环。（图1.右） · 套索驱动环化 mRNA前体剪接时，会发生外显子跳读事件，产生包含外显子和内含子的套索中间体，随后该中间体发生反向剪接，形成环状RNA。（图2.） circRNA最常见的功能是作为miRNA海绵体与miRNA结合，从而影响miRNA对基因的调控。比如研究得比较多的小脑退行性相关蛋白基因(CDR1)反义链转录的环状RNA分子： Cdr1as，它包含约70个miR-7 的结合位点和1个miR-671结合位点，其中与miR-7的结合方式是非完全互补，只是结合，不会被AGO2蛋白介导降解，而与miR-671的结合方式是完美的互补。当Cdr1as高表达时，miR-7被结合，无法抑制原癌基因的mRNA，从而上调原癌基因的表达，导致癌症的发生。当miR-671高表达时，Cdr1as被降解，miRNA得到释放，与原癌基因mRNA结合，起到基因下调的作用，抑制癌症的发生。（图3.） 很多环状RNA上含有蛋白结合的位点，可以作为蛋白的海绵体。如RNA剪切因子MBL，可结合亲本基因第二外显子，促使其环化形成circ-Mbl，circ-Mbl又能与MBL结合，降低MBL有效浓度，减少MBL生成。 除了作为miRNA及蛋白海绵体，circRNA还可以作为支架蛋白促进酶的共定位、结合转录因子抑制靶基因表达、参与亲本基因表达调控、在特定的情况下还可以翻译出多肽。根据参与的功能不同，circRNA所处的细胞定位也不同，如作为miRNA或蛋白海绵体时，circRNA需由细胞核运输到细胞基质起作用，而参与亲本基因表达调控或结合转录因子抑制靶基因时，circRNA常在细胞核中起作用。 （参考文献：Kristensen, L. S., Andersen, M. S., Stagsted, L. V., Ebbesen, K. K., Hansen, T. B., & Kjems, J. (2019). The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics, 20(11), 675-691.） 随着越来越多内源性的circRNA被发现在人体组织中有着广泛表达，circRNA与疾病的关系逐渐成为焦点。目前研究最多的是circRNA与实体瘤之间的关系，促进肿瘤生成的一些circRNA，如头颈部鳞状细胞癌中的circPvt1；结直肠癌，食道鳞状细胞癌和肝细胞癌中的cirs-7（CDr1as）。抑制肿瘤的circRNA，如胶质母细胞瘤中的circsMARCA5 and circ-SHPRH。还有一些circRNA在不同组织或不同细胞所起的作用可能不同，如circHiPK3，在直肠癌中是原癌基因，但是在膀胱癌中又是抑制癌细胞的。 除了癌症，研究还发现circRNA与糖尿病，心血管疾病，慢性炎症和神经系统疾病都有密切的关系。相信随着生物技术的发展以及越来越多对circRNA的深入研究，circRNA的形成和作用机理可以更加清晰，在疾病预防，检测及治疗方面也可以起到重要的作用。 circRNA敲除方案比较难设计，一般会使用以下两种方法： 方案一：将两条gRNA分别设计在circRNA exon的两端，直接敲除环化的外显子序列。这种方案虽然敲除彻底，但是在敲除circRNA的同时，也会影响到编码蛋白的亲本基因，需要根据具体的实验目的考虑是否可行。   方案二：通过破坏circRNA成环来达到敲除的目的。需要先找到circRNA的成环元件，成环元件一般位于被环化外显子两端的长侧翼内含子中。找到成环元件后，在两端设计gRNA进行敲除，既不破坏编码基因的外显子，又可以实现circRNA的敲除（图4.） 应用案例： circ-HIPK3是人体细胞内含量丰富的一种环状RNA，它可以与多种miRNA结合，作为细胞生长的调节剂，影响肿瘤的形成。为了验证circ-HIPK3成环的机制，需要找到侧翼内含子中的成环元件，对上下游预测的两个成环元件分别设计一对sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统将预测的成环元件进行敲除，检测circRNA表达情况是否发生变化。经过PCR和RT-QPCR验证，发现下游成环元件敲除后，circHIPK3表达明显下调，而上游成环元件敲除后，circHIPK3的表达不仅没有下调还有所升高。推测可能是上游的成环元件序列太多，预测的不准确。为了进一步验证是其他成环元件驱动的成环，将gRNA3或gRNA4分别与gRNA5或gRNA6共注射，敲除成环元件上游大片段内含子。RT-QPCR结果显示circHIPK3表达确实下降了，说明上游是由其他的成环元件起到成环的作用。 （参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.） 在研究circRNA功能的方法中，最经典的抑制circRNA的方法是通过RNAi的方式（shRNA）进行敲降。为了避免影响到mRNA，设计方案时需将干扰序列设计在反向剪接位点（BSS）处。 源井生物通过设计高效的shRNA，用慢病毒法将干扰载体转入细胞中，根据最佳药筛浓度对细胞进行药物筛选，直到对照组细胞全部死亡，获得circRNA敲降的稳定细胞株。 应用案例： 用siRNA进行敲降后，通过检测细胞增殖凋亡情况，说明circ-HIPK3敲除后抑制细胞增殖。首先设计三组实验，分别针对HIPK3 mRNA线性转录本、circ-HIPK3环状转录本和两种转录本共有部分设计siRNA，并在HEK-293 T细胞系上验证设计的siRNA只干扰相应的转录本。 利用增殖凋亡检测试剂盒：CCK-8和EdU进行细胞增殖凋亡检测，结果显示HIPK3 mRNA敲降后不明显影响细胞增殖，而circ-HIPK3敲降后，会明显抑制细胞增殖。 （参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.） circRNA过表达一直有成环效率低，容易错配成环等难点。通过优化侧翼成环框架，如成环元件、QKI等RBP的结合位点，使circRNA准确高效环化。过表达后仍需要检测是否成功成环，以及线性mRNA是否表达。为了研究一种新环状RNA 载体表达 系统的成环效率，选择小鼠circRtn4环状基因在多种细胞系（包括Hela，N2a，HEK293）中进行表达验证。根据不同细胞系中进行的RT-QPCR实验数据显示，新载体系统pCircRNA-DMo-Rtn4成环效率在几种不同的细胞系中均比普通的载体系统（pCircRNA-BE-Rtn4）要高效得多。Northern Blotting是检测circRNA的金标准，探针通常跨反向剪接位点设计。但由于Northern Blotting需要的circRNA量非常大，耗时间精力，而且探针一般是放射性标记，操作上比较困难。常用的检测方案还是用RT-PCR或者是RT-QPCR，引物设计在反向剪接位点两端。（图9.）

作者从Jackson实验室购买了 Ppia -/- 小鼠，与野生型小鼠（WT）一起，经过脂多糖（LPS）0、6h、12h、24h、3d、5d、7d的诱导，形成了不同时间点的小鼠肺炎模型。首先通过组织病理学染色实验（图1A），对不同时间点小鼠的肺部切片进行了病理性评分（图1B），同时，对相同时间点的肺干湿质量变化（图1C）和肺指数（图1D）进行统计，发现他们的结果惊人相似，由此说明 Ppia 编码的CypA在炎症的不同阶段发挥着不同的作用。 由于细胞因子在炎症反应中起着重要作用，为了检测这些细胞因子在炎症模型中的表现情况，作者分别提取了 Ppia -/- 和WT小鼠肺部、支气管肺泡灌洗液（BALF）、血清中的mRNA，通过qPCR、ELISA以及免疫组化实验，分别检测了肺部细胞因子Il1b（图1E），以及BALF（图1F）、血清（图1G）和肺部（图1H和图1I）的分泌细胞因子IL-1β的表达量，发现WT小鼠不同部位中这两个细胞因子在6h、12h、24h时的表达量均高于 Ppia -/- 小鼠，而到3d、5d、7d后的表达量出现了反转。除此以外，作者还检测了其他细胞因子在不同部位的表达量。总而言之，所有实验结果表明，在LPS诱导的炎症小鼠模型中，CypA主要通过调节IL-1β的表达量来控制其在炎症不同阶段中的作用。 为了进一步确定CypA为什么能在炎症早期促进IL-1β的表达，首先查阅文献可知，CypA可以通过调节NF-κB中的p65来促进促炎细胞因子的产生。这里作者选择了经典的小鼠原代细胞系——骨髓来源巨噬细胞（BMDM），人源非小细胞肺癌细胞系A549和炎症研究的人源经典细胞系THP-1 （THP-1/ P PIA -/-   细胞由源井提供） ，通过CRIPR-Cas9、干扰等方法，获得对应的 PPIA 敲除或敲降的突变细胞系。随后，通过LPS对这些WT和突变细胞系进行处理来模拟肺炎，分别在0、2h、4h、6h、8h检测并比较了在小鼠模型中检测过的细胞因子Il1b或IL1B的mRNA表达量（图S2A-C）；又通过免疫印迹，分析了0、4h、8h、12h时CypA、pro-IL-1β的蛋白表达量（图S2D-F），以及0、15min、30min、60min时磷酸化的p65的表达量（图S2G-I）。由此说明，CypA是通过增加p65的磷酸化水平来提高 Il1b 和 IL1B 的表达，以及pro-IL-1β的含量。为了进一步确定CypA是怎么促进IL-1β的表达，作者对CypA的PPIase活性功能域进行了突变（R55A），检测了与PPIA敲除细胞系相同的成分（S2J-L），显示出与PPIA敲除时一致的结果，由此说明，在炎症早期阶段，CypA介导的IL-1β表达的增强需要其酶的活性。 THP-1基因编辑细胞作为研究免疫和炎症的典型工具细胞，却时常面临转染难、单克隆生长率低等困难，源井生物历经上百例真实项目摸索总结，对THP-1细胞的基因编辑体系进行针对性优化，大幅提升THP-1的基因编辑成功率。 点击查看更多基因编辑细胞细节，助您进行疾病的病理生理学研究和高通量药物筛选 >> 根据前人研究结果可知，IL-1β最初是作为一种不活跃的促细胞因子（pro-IL-1β）合成的，一旦二级信号被激活，pro-IL-1β则被NLRP3/ASC/caspase-1炎性小体切割成有活性的IL-1β。因此，作者进一步研究了CypA是否对pro-IL-1β的加工具有影响。首先通过在BMDM/ Ppia -/- （图2A）、THP-1/ P PIA -/- （图S3A）、A549/CypA-（图S3B）模型中的ELISA实验可知，当ATP刺激炎症小体激活时，CypA突变型细胞系中IL-1β的表达是显著低于对应WT细胞系的。 （ 2 ） LPS 诱导的炎症消退阶段中， CypA 的抑制作用 有报道指出，在没有如ATP的二级信号的刺激下，IL-1β的加工和释放是低效的，且大多数合成的产物都被留在细胞内，要么不被处理，要么被降解。为了探究CypA为什么能在炎症晚期阶段抑制IL-1β的表达，作者随后研究了CypA对pro-IL-1β稳定性的影响。首先还是利用免疫印迹法，直接检测了BMDM/ Ppia -/- （图2B）、THP-1/ P PIA -/- （图S3C）、293T/CypA-、模型中pro-IL-1β的表达量，结果表明，CypA能加速上述三个WT细胞中内源pro-IL-1β的降解。随后，将带有FLAG标签的pro-IL-1β表达载体转染到293T，并用DMSO、MG132和NH4Cl处理（图2C），比较发现，MG132能促进pro-IL-1β的降解，由此说明pro-IL-1β的降解是由泛素-蛋白酶体途径降解，且这个过程不依赖于CypA的PPIase活性（图S3E）。 （ 3 ） CypA 影响 pro-IL-1 β泛素化 有研究报道，K63连接泛素化的pro-IL-1β对炎性小体的激活和IL-1β的分泌具有重要作用。因此，为了验证CypA是否影响pro-IL-1β的泛素化，作者实施了泛素化实验，通过免疫印迹的方法，在293T和BMDM细胞中发现，在没有ATP刺激下，CypA对pro-IL-1β的K48连接泛素化具有显著影响（图2D、图S3F），但当ATP单独作用时，CypA则逐渐增加pro-IL-1β的K63连接泛素化（图2E、图S3G）。 （ 4 ） pro-IL-1 β关键泛素化位点验证 为了进一步验证pro-IL-1β的关键泛素化位点，通过质谱分析，找到了K73、K132、K143这三个潜在的泛素化位点。免疫印迹实验证明，K73R、K132R和K143R突变导致pro-IL-1β的K48连接泛素化减少，而K132R、K143R突变导致pro-IL-1β的K63连接泛素化减少（图2F）。仍不能确定哪个才是pro-IL-1β加工的关键泛素化位点。于是作者将NLRP3、ASC和caspase-1与pro-IL-1β的野生型或突变型共转染293T细胞，并用ATP刺激，通过免疫印迹（图2G）和ELISA（图2H）实验发现，K143R突变会阻止pro-IL-1β剪切成活性的IL-1β，从而判断K143是pro-IL-1β加工的关键位点。随后再次通过免疫印迹检测转染了编码野生型pro-IL-1b-myc及其不同突变基因载体的293T（图2I），发现K132和K143是pro-IL-1β降解的关键位点。 综上所述，这些数据表明，在炎症激活期，有高浓度ATP的刺激下，CypA主要通过增强K143位点的K63连接泛素化来促进pro-IL-1β的加工；而在炎症缓解期，低浓度ATP环境下，CypA主要通过促进pro-IL-1β在K132和K143位点处K48泛素化来加速pro-IL-1β的降解。 当然，作者的研究不止步于此，后续利用类似的方法，通过精心的实验设计与对比，对IL-1β诱导的炎症模型进行了更加系统的研究，揭示了CypA加剧IL-1β诱导的炎症机制，阐明了CypA在IL-1β诱导的II型上皮间质转化(EMT)肺修复中作用，为未来对与炎症相关疾病的治疗提供了更系统的理论基础，及相关靶点筛选的方向。