基因编辑棉花的参考文献

质疑转基因的观点：请重点关注“绿色和平”组织的网站，还有反转斗士Jeffrey 的著作。赞同转基因的观点：请关注“孟山都”公司的网站，还有科普名人方舟子的博客。个人认为，支持转基因的公司或个人或多或少有商业利益在其中，而反对观点的科学性强一些。如果您有心作此方面研究，最好能调查一下，对于转基因食品（如大豆、玉米、玉米油等）1. 在我国鼓吹推广转基因最热心的专家看他们是否自己积极食用，2. 国家部委的子弟幼儿园是否积极食用，3. 看大型国际赛事和国际会议是否积极食用，也许，这才能够了解国家相关领导和专家对转基因食品的内心真实看法。

产经透视 转基因技术的研究综述及利弊关系张 兆 熙（ 华中师范大学附属第一中学摘 要 湖北 武汉 430223） 转基因技术作为生命科学的前沿技术之一， 已经逐渐走入了人们的生活。转基因 技术可以认为是 在一定程度上通过科学技术手段让其他生物、 植物朝着对人类有利方向发展的技术。 通过对转基因技术的介绍 ， 阐述了该技术的利弊关系， 指出只有通过正确的引导和规范管理， 才能很好地利用该技术， 使它为人类服务。 关键词 转基因技术 发展历程 利弊关系 文献标识码 中图分类号 Q78 B基因植株。 与农杆菌转化相比， 基因枪法转 化的一个主要优点是不受受体植物范围的 限制。 而且其载体质粒的构建也相对简单 ， 因此也是目前转基因研究中应用较为广泛 的一种方法。 （ 3 ） 花粉管通道法。 在授粉后向子房注 射含目的基因的 DNA 溶液， 利用植物在开 花、 受精过程中形成的花粉管通道， 将外源 1 前言转基因技术是生命科学前沿的重要领 传转化” 均为转基因的同义词。 2．1 转基因植物技术 转 基 因 植 物 是 指 利 用 重 组 DNA 技 术 域之一。 自从人类耕种作物以来， 我们的祖 先就从未停止过作物的遗传改良。过去的 几千年里农作物改良的方式主要是对自然 突变产生的优良基因和重组体的选择和利 用， 通过随机和自然的方式来积累优良基 因。遗传学创立后近百年的动植物育种则 是采用人工杂交的方法 ， 进行优良基因的 重组和外源基因的导入而实现遗传改良。 因此， 可以认为转基因技术是与传统技术 一脉相承的， 其本质都是通过获得优良基 因进行遗传改良。但在基因转移的范围和 效率上， 转基因技术与传统育种技术有两 点重要区别， 第一， 传统技术一般只能在生 物种内个体间实现基因转移， 而转基因技 术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系 的限制； 第二， 传统的杂交和选择技术一般 是在生物个体水平上进行， 操作对象是整 个基因组， 所转移的是大量的基因， 不可能 准确地对某个基因进行操作和选择， 对后 代的表现预见性较差。而转基因技术所操 作和转移的一般是经过明确定义的基因， 功能清楚， 后代表现可准确预期。因此， 转 基因技术是对传统技术的发展和补充。将 两者紧密结合， 可相得 益彰， 大大地提高动 植物品种改良的效率。 将克隆的优良目的基因整合到植物的基因 组中， 并使其得以表达， 从而获得的具有新 的遗传性状的植物。 1983 年世界第一例 自 转 基 因 植 物 —烟 草 问 世 以 来 仅 20 多 年 —— 的时间， 转基因植物的研究和应用就已经 得到了迅猛的发展， 已有近 1000 例转基因 植物被批准进入田间试验， 涉及的植物物 种有 50 余个， 已 有 48 个转基因植物品种 被批准进行商业化生产。常见的转基因植 物技术有： 农杆菌是普遍 （ 1 ） 农杆菌介导转化法。 存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它 能在自然条件下趋化性地感染大多数双子 叶植物的受伤部位， 并诱导产生冠瘿瘤或 发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌的细胞 中 分 别 含 有 Ti 质 粒 和 Ri 质 粒 ， 其 上 有 一 段 T－ DNA， 农 杆 菌 通 过 侵 染 植 物 伤 口 进 入 细 胞 后 ， 可 将 T－ DNA 插 入 到 植 物 基 因 组 中。 因此， 农杆菌是一种天然的植物遗传转 化体系。人们将目的基因插入到经过改造 的 T－ DNA 区， 借助农杆菌的感染实现外源 基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过 细胞和组织培养技术， 再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物 中， 近年来， 农杆菌介导转化在一些单子叶 植物（ 尤其是水稻） 中也得到了广泛应用。 （ 2 ） 基因枪介导转化法。 利用火药爆炸 或高压气体加速 （ 这一加速设备被称为基 因枪） ， 将包裹了带目的基因的 DNA 溶液 的高速微弹直接送入完整的植物组织和细 胞中， 然后通过细胞和组织培养技术， 再生 出植株， 选出其中转基因阳性植株即为转 DNA 导 入 受 精 卵 细 胞 ， 并 进 一 步 地 被 整 合到受体细胞的基因组中， 随着受精卵的发 育而成为带转基因的新个体。该方法于 20 世纪 80 年代初期由我国学者周光宇提出， 我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就 是用花粉管通道法培育出来的。该法的最 大优点是不依赖组织培养人工再生植株， 技术简单， 不需要装备精良的实验室， 常规 育种工作者易于掌握。 2．2 转基因动物技术 转基因动物是指用实验导入的方法将 外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳 定表达的一类动物。 1974 年， Jaenisch 应用 显微注射法， 在世界上首次成功地获得了 SV40DNA 转基因小鼠。其后， Costantini 将兔 － 珠蛋白基因注入小鼠的受精卵， 使受精 卵发育成小鼠， 表达出了兔卜珠蛋白； Palmiter 等 把 大 鼠 的 生 长 激 素 基 因 导 人 小鼠受精卵内， 获得“ 超级” 小鼠； Church 获得 了首例转基因牛。 到目前为止， 人们已经成 功地获得了转基因鼠、 、 羊、 、 羊、 鸡 山 猪 绵 牛、 蛙以及多种转基因鱼。 主要的转基因动 物技术包括有： （ 1 ） 原 核 显 微 注 射 法 ， 又 称 DNA 显 微 注射法， 即通过显微操作仪将外源基因直 接用注射器注入受精卵， 利用外源基因整 合到 DNA 中， 发育成转基因动物。其创始 2 转基因技术的介绍转基因技术是指用人工分离和修饰过 的外源基因导入生物体的基因组中， 从而 使生物体的遗传性状发生改变的技术， 可 分为转基因动物与转基因植物两大分支。 人们常说的 “ 遗传工程” “ 、 基因工程” “ 、遗 收稿日期： 2006－ 10－ 08 PIONEERING WITH SCIENCE ＆ TECHNOLOGY MONTHLY NO．11 2006 111 科技创业 月 刊 PIONEERING WITH SCIENCE ＆ TECHNOLOGY MONTHLY 人是 Jaenisch 和 Mintz 等。 此方法目前应用 较普遍， 现在的转基因动物研究大都是在 但是， 人类对自然界的干预是否会造 成潜在的尚不可能预知的危险？ 大量转基 因生物会不会破坏生物多样性？ 转基因产 品会不会对人类健康造成危害？ 一些科学 家们开始担心对生物、 植物生命进行的“ 任 意修改” 创造出的新型遗传基因和生物可 ， 能会危害到人类。它们可能会对生态环境 造成新的污染， 即所谓的遗传基因污染， 而 这种新的污染源很难被消除。 还有， 转基因 农作物和以此为原材料制造的转基因食品 对人体的影响也尚未有定论。 目前， 国内外学者对转基因技术的负 面影响也作了大量研究， 出现了许多相关 报道， 如英国的权威科学杂志《 然》 登 自 刊 了 美 国 康 奈 尔 大 学 副 教 授 约 翰?罗 西 的 一 篇论文， 引起世界震惊。论文指出， 研究人 员在实验室里把抗虫害转基因 玉 米 “ 玉 BT 米” 的花粉撒在苦苣 菜叶上， 然后让蝴蝶幼 虫啃食这些菜叶。4 天之后， 有 44％的幼虫 死亡， 活着的幼虫身体较小， 并且没有精 神。而另一组幼虫啃食撒有普通玉米花粉 的菜叶， 就没有出现死亡率高或发育不良 的现象。论文据此推断， BT 转基 因 玉 米 花 粉中含有毒素。 另据报道， 英国伦理和毒性 中心的实验报告说， 与一般大豆相比， 耐除 草剂的转基因大豆中， 防癌的成分异黄酮 减少了。 与普通大豆相比， 两种转基因大豆 中的异黄酮成分减少了 12％～ 14％ ， 还有 巴 西坚果事件等。 面对国际上出现的种种关于转基因作 物的争议， 许多科学家、 学术团体纷纷以各 种形式发表对转基因技术的支持态度。由 美国 Tuskegee 大学 Prakash 教授 2000 年 1 月起草的题为 “ 科学家支持农业生物技术 的声明” 已征集到世界上 3 000 多位科学 ， 家的签名， 其中包括 DNA 双螺旋结构的发 现者、 诺贝尔奖得主 James Watson ， 绿色革 命 的 创 始 人 、 诺 贝 尔 奖 得 主 Norman Bor－ 国 laug， 世 界 粮 食 奖 获 得 者 、 际 水 稻 研 究 所 首席育种家 Gurdev Khush 。该声明称， “ 对 植物负责任的遗传修饰既不新也不危险。 如抗病虫等诸多性状已通过有性杂交和细 胞培养的方法经常性地引入作物中。与传 统的方法相比较 ， 通过重组 DNA 技术引入 新的或不同的基因并不一定会有新的或更 大的风险， 且商品化的产品的安全性则由 于目前的安全管理规则而得到了更进一步 的保障。遗传新技术为作物改进提供了更 大的灵活性和精确性。” 因此， 笔者认为和现代任何一项工业 技术一样， 转基因技术也具有两面性， 有长 亦有短。 在发展转基因技术等生物技术时， 应该扬长避短、 利避害、 范管理， 使转 趋 规 基因技术能够健康发展。 Palmiter 等 方 法 的 基 础 上 有 所 改 进 而 进 行 的。这种方法的特点是外源基因的导入整 合效率较高， 不需要载体， 直接转移目的基 它可以直 因， 目的基因的长度可达 100Kb 。 接获得纯系， 实验周期短。 但需要贵重精密 仪器， 技术操作较难， 并且外源基因的整合 位点和整合的拷贝数都无法控制， 易造成 宿主动物基因组的插入突变， 引起相应的 性状改变， 重则致死。 （ 2 ） 逆转录病毒载体法， 指将目的基因 重组到逆转录病毒载体上， 制成高浓度的 病毒颗粒， 人为感染着床前或着床后的胚 胎， 也可以直接将胚胎与能释放逆转录病 毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目 的， 通过病毒将外源目的基因插入整合到 这种逆转录病毒被 宿主基因组 DNA 中去。 用 重 组 DNA 技 术 修 饰 后 作 为 基 因 载 体 在 应用中优于微注射法之处为 ： 无需要重排， 可在整合点整合转移基因的单个拷贝； 将 胚胎置于高浓度病毒容器中， 或者与被感 染的细胞体外共同培养， 或微注射鸡胚盘 里 ， 整 合 有 逆 转 录 病 毒 的 DNA 的 胚 胎 率 高。 缺点是： 需要生产带有转基因的逆转录 病毒； 插入逆转录病毒的基因有一定的大 小限度； 所得转基因家畜的嵌合性很高， 而 需要广泛的杂交， 以建立转基因系； 转基因 的表达问题尚未解决。 （ 3 ） 胚胎干细胞介导法是将基因导入 胚胎于细胞； 然后将转基因的胚胎干细胞 注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构 成， 形成嵌合体， 直至达到种系嵌合。其优 点是： 在将胚胎干细胞植入胚胎前， 可以在 体 外 选 择 一 个 特 殊 的 基 因 型 ， 用 外 源 DNA 转染以后， 胚胎干细胞 可以被克隆， 继而可 以 筛 选 含 有 整 合 外 源 DNA 的 细 胞 用 于 细 胞融合， 由此可以得到很多遗 传上相同的 转基因动物。缺点就是许多嵌合体转基因 动物生殖细胞内不含有转基因。 目前， 胚胎 干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟， 在 大动物上应用较晚。 4 转基因技术的发展展望当前条件下， 转基因技术还存在许多 不足， 还处于不断的发展与完善之中， 表现 在： 转基因表达水平低， 许多转基因的表达 强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的 影响， 往往出现异位表达和个体发育不适 宜阶段表达， 影响转基因表达能力或基因 表达的组织特异性， 从而使大部分转基因 表达水平极低， 极少部分基因表达水平过 高； 难以控制转基因在宿主基因组中的行 为， 转基因随机整合于动物的基因组中， 可 能会引起宿生细胞染色体的插入突变， 还 会造成插入位点的基因片段丢失， 插入位 点周围序列的倍增及基因的转移， 也可能 激活正常状态下处于关闭状态的基因； 不 了解哪些基因控制 多数生理过程， 不了解 基因表达的发育控制和组织特异性控制的 机制； 制作转基因动 物的效率低， 这是目前 几乎所有从事转基因动物研究的实验室都 面临的问题， 也是制 约着这项技术广泛应 用的关键； 对传统伦理是一种挑战， 对人类 的生存有一定的负面 作用等。但笔者相信 只要通过科学家的进一步研究和各国对转 基因技术的规范管理 ， 保证转基因技术的 研究和开发的健康而有序， 制定相关的法 律、 法规， 健全转基因生物 和转基因食品的 管理， 如对转基因作物进行监管， 对转基因 食品进行标识等， 应该更深 入的了解转基 因技术其中的奥秘， 只有更了解它才能利 用好它， 让我们的生活更加美 好和谐， 使公 众对转基因技术有一个较为科学的认识， 主动地接受转基因食品， 使转 基因技术贴 近民众， 造福于人类。 参考文献 1 2 3 陈吉美 ． 转 基 因 植 物 的 研 究 进 展 〔J〕． 德 州 学 院 学报， 2004 （ 2 ） 文 平 ， 王 仁 祥 ． 转 基 因 植 物 研 究 进 展 〔J〕． 生 物 学教学， 2005 （ 12 ） 郭黠， 谢辉， 何 承 伟 ． 转 基 因 动 物 研 究 进 展 〔J〕． 医学综述， 2006 （ 5 ） 3 转基因技术的利与弊科学家发明转基因技术的初衷是想利 （ 责任编辑 秋 实 林 洪） 用该技术造福人类， 既可加快农作物和家 畜品种的改良速度， 提高人类食物的品质， 又可以生产珍贵的药用蛋白， 为患病者带 来福音。 比如说， 抗虫的转基因玉米不会被 虫咬， 可以让人们放心食用； 将能产生人体 疫苗的基因转入植物食品， 人们就可以在 食用食物的同时增加自身对疾病的抵抗 力。

地处盆地，属于温带大陆性气候，昼夜温差大，降水量少，适宜大量长绒棉的生产，受雨水减产的影响少。人口较东部沿海城市少（地广人稀），适宜大面积的农业生产。亚欧第二铁路大陆桥通过，方便农产品运送。政府支持西部大开发，经济上的资金援助。

DOI:

microhomology-mediated end-joining (MMEJ)

DNA double-strand break (DSB)

local accumulation of DSB repair molecules (LoAD) system

homologous recombination (HR)

non-homologous end-joining (NHEJ)

homology-independent targeted integration (HITI) system

precise integration into target chromosome (PITCh) system

single-strand template repair (SSTR)

Gaps: 以往的研究从未在多个基因组位点同时产生多种模式或多个报告基因的组合。基因插入在每个位点独立进行，在不同的基因位点上进行双或三重敲入需要一定的步骤。

横向比较： CRISPR-Cas9基因标记使用的方法有（1）同源修复HR，（2）非同源end-joining NHEJ，（3）微同源介导的end-joining MMEJ。虽然HR的方法可以非常精准的knockin，但它的载体的构建和效率远低于end-joining的方法。

工作简介 ：

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原因在于：MS2可以与RNA结合，从而报告RNA的情况，将MS2与CtIP融合，可将CtIP导向到sgRNA所在的位置，形成一个滞留，发挥CtIP增加MMEJ的功效，从而造成了更多的DNA断裂，插入效率增加。

之前我看过一篇文章，说的是CRISPR-Cas9的效果由于P53的存在而大打折扣，而P53对抗HDR是CRISPR-Cas9造成DSB无法被修复，从而介导了CRISPR-Cas9的细胞毒性。那么就会有以下两种情况：（1）P53存在时，CRISPR-Cas9效果不好，且有细胞毒性；（2）P53敲除时，CRISPR-Cas9效率增加，但有致癌的风险。以此引发临床安全性的思考，提醒在人体上使用CRISPR-Cas9治疗需要注意的安全性问题，从而以一个相对简单的故事，发表在了Nature Medicine上。所以，我们在使用基因编辑工具的时候，需要注意一下它的细胞毒性情况。

老板亲自传授的文献阅读方法

（1）FACS结果显示，没有毒性：首先转入已被证实具有细胞毒性的载体来作为对照，MS2-CtIP组没有对细胞增殖产生影响，而ZFN组有。

（2）如我前面所说，DSB如无法被修复，则是细胞毒性。在这里作者也使用DSB修复实验来代表细胞毒性实验，首先使用依托泊苷诱导DSB，然后使用anti-γ-H2AX染色来查看修复情况，发现MS2-CtIP组DSB修复活性显著高于对照组。

以上结果表明，MS2-CtIP是通过诱导DSB修复来达到低（无）细胞毒性的效果。

我就不写了。。。因为我没看明白，嘤嘤嘤。

第一部分主要讲基因编辑系统的构建及基本情况，接下来就要讲一讲它作为一个基因编辑工具的基本素养了。

太多啦！简单说一下，就是对比了MMEJ和NHEJ它们在精确敲入，非精确敲入和未敲入这三个方面的情况，得到MMEJ几乎完败NHEJ的结论咯。 看看这图画得多漂亮！

回归前面说的Gaps，同时对多个基因进行编辑呢？结果显示是可以高效、准确的对多个基因进行编辑。这部分是灰常灰常棒的。

学习一下人家的思路~

创新点在于MS2的定位效应，MS2-CtIP的增强效应，MMEJ的精巧性。

参考文献： Nakade S, Mochida K, Kunii A, et al. Biased genome editing using the local accumulation of DSB repair molecules system[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 3270.