线粒体凋亡途径的研究论文

细胞凋亡的途径 细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。通过细胞凋亡，机体可消除损伤、衰老与突变的细胞来维持自身的稳态平衡和各种器官及系统的正常功能。由于细胞凋亡是一种复杂的生理及病理现象，所以在其发生的3个阶段中涉及不同的信号转导途径及其调控。 细胞凋亡（apoptosis）是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是受基因调控的细胞主动性死亡过程，是细胞核受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应，然后凋亡的细胞将被吞噬细胞吞噬。经研究发现，不管是单细胞生物还是多细胞生物，细胞凋亡被称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]。是因为细胞死亡往往受到细胞内的某种遗传机制决定的“死亡程序”控制的。也会因为它的失调，机体也会失去稳定性，引发人类疾病如肿瘤、免疫系统等疾病[2]。由于它保证多细胞生物的健康生存过程中的重要性，引起了人们对其途径的广泛深入的研究，成为目前生命科学研究的热点之一。但其凋亡的途径不是很清楚，本文从多个方面概述了细胞凋亡途径。1 细胞凋亡形态学上的特征 细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr教授根据形态学特征最先提出的[3],主要强调的是这种细胞凋亡是自然界中的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。为此，在形态学上把细胞凋亡分为3个阶段[3]：第一个阶段是凋亡的开始。此阶段只是进行数分钟， 细胞中所表现的特征是：微绒毛消失，细胞间接触消失，但是质膜保持完整性，线粒体大体完整，核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并与质膜发生融合，染色质固缩等等。第二阶段是形成凋亡小体。核染色质发生断裂，形成许多的片段，与一些细胞器聚集在一起，然后被细胞质膜包围，形成凋亡小体。第三阶段是凋亡小体被吞噬细胞所吞噬，而其残留物质被消化后重新使用。细胞凋亡是一个主动性自杀过程，所以它是一个耗能的过程，需要ATP提供能量。其次此过程中质膜保持完整，内含物也不发生外泄。2 细胞凋亡的基本机制细胞凋亡的途径复杂，在不同环境、不同细胞或不同刺激的情况下，细胞凋亡的途径是不同的，而且细胞凋亡的信号途径具有多样性，这使得凋亡的发生及调控机制非常复杂。本章将从以下几个方面来说明细胞凋亡途径。 线粒体途径及调控线粒体为一双层膜围成的囊状结构，外膜与内膜间的空腔称为外室，由内膜包围的腔称为内室或线粒体基质，线粒体外膜通透性较大，而内膜通透性比较小。然而质子泵存在于内膜，它将基质内质子泵输入外室，从而形成横跨线粒体内膜的线粒体跨膜电位。线粒体跨膜电位的改变与许多的机制有关。Zamzami等[4]报道膜通透性改（permeability transition,PT）的孔位位于线粒体内外膜间，是一种由蛋白质组成的复合体。该复合体由胞质的己糖激酶、外膜的peripheral bermdiazepine receptor (PBR)、电位依赖的阴离子通(voltage—depedentanion channel，VDAC)、外室的肌酸激酶、内膜的腺苷酸转运蛋(adeninenucleotide trans[cx：ator，ANT)及基质的亲环蛋白D(cyelophilin D)组成。通过实验证明，细胞凋亡时，PT孔开放，并且促进PT孔开放的物质可诱导细胞凋亡，而抑制PT孔开放的物质可阻止细胞凋亡。此外，线粒体跨膜电位改变与Caspase家族也有关系。Caspase是一组存在于细胞质中具体类似结构的蛋白酶。它们的活性位点均包括半胱氨酸残基，能够特异的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。Caspase主要负责的是选择性地切割某些蛋白质，切割的结果是使靶蛋白活化或失活，并非完全降解。迄今为止，Caspase家族已有15种，其中Caspase-1和11主要负责白介素前体的活化，不直接参与凋亡信号的传递；Caspase-2，-8，-9，-10，-11主要负责对执行者得前体进行切割，从而产生有活性的执行者；Caspase-3，-6，-7主要负责切割细胞核内、细胞质中的结构蛋白和调节蛋白。目前很多研究表明Caspase-1和3与线粒体跨膜电位之间的关系，可以通过对Fas/APO-1诱导胸腺细胞凋亡研究证实。通过研究表明：所有动物细胞都具有类似的凋亡机制，蛋白酶Caspase在其中发挥很重要的作用，这种凋亡方式被称为Caspase依赖性的细胞凋亡，近几年来，还发现细胞中还存在Caspase不依赖性的细胞凋亡。在哺乳动物细胞中，Caspase依赖性的细胞凋亡主要通过两条途径引发的：由死亡受体起始的外源途径和线粒体起始的内源途径。凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）是1999年克隆的第一个能够诱导Caspase非依赖性细胞凋亡的因子。在凋亡过程中，AIF从线粒体转移到细胞质内，进而进入细胞核，引起核内DNA凝集并断裂形成许多片段。最后，线粒体跨膜电位改变与Bcl-2有关。Bcl-2家族主要包括抑制凋亡的成员如Bcl-2、Bcl-W、Bcl-Xl等。Bcl-2是线虫抗凋亡蛋白Ced9的同源物。Bcl-2家族成员含有一个或者多个BH结构域，大多存在于线粒体外膜上，或受信号刺激后转移到线粒体外膜上。通过实验证明：Bax与Bcl．Xc调节细胞凋亡是依赖TM结构域．未激活的Bax与Bcl-XL存在于胞浆。Hsu等报道在胸腺细胞凋亡早期，Bax与Bal-XL的分布发生改变，从胞浆移到线粒体膜Bad因为没有TM结构域而分布于胞浆，与Bax和Bal-XL一样，当H202诱导心肌细胞凋亡时，它从胞浆移到线粒体膜,除去TM后的Bcl-2其抑制凋亡作用随不同的实验体系而不同，这可能与Bcl-2在不同实验体系中的作用强弱以及它在内质网与核膜上的作用大小有关. 内质网信号途径及调控内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网对细胞凋亡的作用的作用表现在两个方面：一是内质网对Ca2+的调控，二是凋亡酶在内质网上的激活，Ca2+是真核细胞内重要的信号转导因子，它的动态平衡在细胞正常生理活动中起着很重要的作用。因此，作为细胞内重要的钙库，内质网对胞质中Ca2+浓度的精确调控可细胞凋亡的发生。很多文献指出，细胞在凋亡早期会出现胞质内Ca2+浓度迅速持续的升高，这种浓度升高来源于细胞外Ca2+的内流及胞内钙库的钙释放，相对高浓度的Ca2+可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶，又可以作用于线粒体，影响其通透性和膜电位的改变，从而促进凋亡。但是内质网上Bcl-2家族中抑制凋亡蛋白则可以调节网腔中游离Ca2+浓度，使胞质的Ca2+维持在合适的浓度水平，进而起到抗凋亡的作用[5]。细胞凋亡的死亡受体途径及调控胞外的死亡信号可通过死亡受体转入细胞内。死亡受体是一类跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)受体基因家族成员，其细胞外有一段富含半胱氨酸的区域，胞质区有一同源的氨基酸残基组成的结构，有蛋白水解功能，称为“死亡区域”。目前至少发现有五种死亡受体在细胞凋亡信号传导中发挥作用。其中最典型的死亡受体有CD95(Fas或Apo1)和TNFR1(p55或CD120a)。CD95与Fas配体结合后迅速诱导Fas阳性细胞凋亡。Fas与Fas相关的死亡结构域蛋白（FADD）和Caspase-8组合形成复合体，可抑制FasL诱导的细胞凋亡。 其他因素与细胞凋亡的关系NO参与细胞凋亡关系密切，可诱发多种细胞发生凋亡，并与其他活性氧自由基的凋亡传导途径存在对话效应，NO诱导凋亡促进P53基因表达，其分子作用机理正是目前的研究的重点。铅在工业上具有广泛的用途，但同时也易对环境和人畜健康造成严重危害，铅引起细胞死亡可通过两种不同的途径：一是为一定剂量的铅通过启动细胞内的凋亡程序，促使细胞凋亡；二是为在铅质量浓度过大时，直接引起细胞发生坏死。3 细胞凋亡与一些疾病细胞凋亡是正常T细胞和B细胞分化和稳定的重要机制。近年来，许多的研究表明细胞凋亡在自身免疫疾病机制中起到的重要作用。Fas/FasL途径介导的细胞凋亡的抑制是产生自身反应性T细胞和自身抗体的主要原因，DNA低甲基化也会抑制细胞凋亡，导致自身反应性B细胞的增殖。细胞凋亡受抑制，细胞存活期延长，死亡率下降，细胞数量增加，使得这些细胞表现出明显的生长优势，DNA受损的细胞得以持续生存，突变物积聚，从而促进肿瘤的发生发展。综上所述，细胞凋亡途径主要是通过三个阶段的。细胞凋亡在生理条件下作为机体细胞群生长消亡平衡的重要方式，与细胞增殖同等重要，共同维持细胞群的自身稳定。细胞凋亡有利于器官形成，消除不必要的器官结构，控制细胞数量，消除异常、无功能和有害的细胞以及产生没有细胞器的分化细胞等功能。

凋亡有许多信号途径，其中一条就是线粒体途径，主要是在细胞受到刺激凋亡时线粒体释放细胞色素c和凋亡诱导因子，从而激发下游的凋亡执行者，在凋亡中线粒体的作用是相当重要的，也比较复杂，也是科研的热点

线粒体属于内源性caspase-induced凋亡途径中的中心细胞器。其中第一个线粒体源的凋亡促进因子cytc的释放将会在细胞质中招募apaf1和caspase9，形成凋亡复合体，凋亡复合体中caspase9相互活化，最终活化多种效应caspase（3等）。第二个发现的线粒体凋亡因子smac，在凋亡启动后释放到细胞质中，可以解除AIP对pro-caspase9的抑制，促进调往复合体的形成，因此促进凋亡。

线粒体在细胞凋亡中的重要性： 如前所述，在诸如细胞毒药物诱导细胞凋亡的信号转导途径中，线粒体在促凋亡信号和Caspases激活之间起着不可替代的作用。实际上， 线粒体在细胞凋亡中的作用远不止此。线粒体在细胞凋亡中的作用包括：释放Caspases激活因子如Cyto-c；丧失电子转移功能并减少能量的产生；线粒体跨膜电位的消失以及与BCL-2蛋白家族促凋亡和抑制凋亡功能相关等方面。甚至有人提出：线粒体在细胞凋亡中起着决定性的作用。实验证明，γ辐射、Ceramide（凋亡信号转导中的重要分子，介于促凋亡信号和凋亡过程之间）、Fas与配体结合等均可导致线粒体在电子转移方面功能的紊乱，从而影响呼吸链，ATP产量下降。这种能量代谢上的障碍主要发生在细胞凋亡的晚期。

线粒体在细胞凋亡过程中最重要的一点在于它可释放能够激活Caspases的蛋白。在无细胞的体系中，自发的、可以由Bcl-2抑制的染色质聚集和DNA片段化依赖于线粒体的存在，进而发现实际上是依赖于Cyto-c从线粒体中的释放。从线粒体释放的Cyto-c与Apaf-1、Procaspase 9结合在一起形成"凋亡体"（Apoptosome），其结果是Caspase 9的激活。除Cyto- c之外，线粒体还可释放其它介导细胞凋亡的分子：Procaspase 3和AIF（Apoptosis-inducing factor）。AIF在体外可作用于Procaspase 3，并且其本身可能就是一个Caspase。

线粒体发生上述改变的机制在于线粒体膜上一种叫PT通道（Permeability transiton pore，又叫Megachennal）的形成。线粒体在细胞凋亡中的重要性还在于它与Bcl-2基因家族之间的关系。实际上，很多Bcl-2家族的蛋白如BCL-2、BAX、BCL-XL等都定位于线粒体膜上。而且实验证实，BCL-2家族蛋白可以影响PT通道开放及其Cyto-c、AIF的释放，还可以改变线粒体外膜的通透性。

线粒体膜电位变化的检测：在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。