药学专业论文开题报告模板图片

开题 报告 很大程度上决定着学位论文的学术水平与品质，是学生对自己的论文写作所做的文字说明,也是论文写作或研究能否按计划实施和开展的重要保证。下面是我为大家整理的大学 毕业 论文开题报告ppt格式模板，希望你们喜欢。 大学毕业论文开题报告ppt模板 第一步、论文拟研究解决的问题 内容要求： 明确提出论文所要解决的具体学术问题，也就是论文拟定的创新点。 明确指 出国 内外文献就这一问题已经提出的观点、结论、解决 方法 、阶段性成果…… 评述上述文献研究成果的不足。 提出你的论文准备论证的观点或解决方法，简述初步理由。 撰写方法： 你的观点或方法正是需要通过论文研究撰写所要论证的核心内容，提出和论证它是论文的目的和任务，因而并不是定论，研究中可能推翻，也可能得不出结果。开题报告的目的就是要请专家帮助判断你所提出的问题是否值得研究，你准备论证的观点方法是否能够研究出来。 一般提出3或4个问题，可以是一个大问题下的几个子问题，也可以是几个并行的相关问题。 第二步、国内外研究现状 内容要求：列举与论文拟研究解决的问题密切相关的前沿文献。基于“论文拟研究解决的问题”提出，允许有部分内容重复。 撰写方法：只简单评述与论文拟研究解决的问题密切相关的前沿文献，其他相关文献评述则在文献综述中评述。 第三步、论文研究的目的与意义 内容要求： 简介论文所研究问题的基本概念和背景。 简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题。 简单阐述如果解决上述问题在学术上的推进或作用。 基于“论文拟研究解决的问题”提出，允许有所重复。 第四步、论文研究主要内容 容要求：初步提出整个论文的写作大纲或内容结构。由此更能理解“论文拟研究解决的问题”不同于论文主要内容，而是论文的目的与核心。 关于格式的论文 范文 格式条款的基本特征 现代 合同法的一个重要 发展 方向就是，经自由磋商产生的合同越来越少，取而代之的是标准化的格式条款。合同领域现实生活的变迁对合同法也提出了新的要求，我个人认为，合同法实际上已经演化为内在二重区分的双轨体系：针对经当事人自由磋商形成的合同和基于格式条款产生的合同(或者部分合同内容)，合同成立、合同生效、合同解释规则以及合同诉讼机制等方面都存在严格意义上的区别。由于如何认定格式条款涉及到合同法适用的各个方面，因此，诚有必要探讨，以此确保格式合同订入控制和内容控制。 一、格式条款的一般特征 判断合同条款为一般条款、即通过自由磋商形成的合同条款还是格式条款是对格式条款进行 法律 控制的前提，因此必须严格区分二者。格式条款的特征表现在主观和客观两个方面，其中预先制定、重复使用属于主观特征，单独提出属于客观特征，自由磋商实际上为消极要件，具体而言： 1.预先制定。所谓预先制定就是指合同当事人在合同磋商之前已经拟定好合同条款的具体内容，在判断是否存在预先制定的要件时，如下问题值得注意： 第一，格式条款是由使用人本人还是第三人制订并不影响对预先制定因素的判断，换而言之，使用人在合同订立时使用第三人的格式条款并不影响对该合同条款性质的认定。值得注意的是，合同当事人使用第三人制定的推荐性的范式合同也同样满足格式条款的预先制定标准。我国合同法第12条规定的内容，并不能够免除对范式合同的司法审查，尤其考虑到，我国行业协会与行业垄断 企业 存在一体性。从立法资料看，立法者同样主张范式合同文本不能免除内容控制[1]。我国合同法第39条第2款亦明文将预先拟定规定为格式条款的重要特征之一。但是该条具有一个严重缺陷，即将预先制定限制在由使用人本人提出，排除了将使用人直接使用第三人合同条款认定为格式条款的情况。就此，必须使用目的性扩张解释，扩大对该规定的适用余地。 第二，无论格式条款在整个合同中的范围有多大，如整个合同文本都是标准合同，或者合同中只有一部分或者一个条款是格式条款，都不影响对其性质的认定。 2.多次重复使用。多次重复使用反映了格式条款适应大规模重复性交易的特点，即该条款通常并不是为某个具体合同拟定的，而是为某一类交易。判断合同条款是否旨在多次使用的关键是使用者主观意图，在此采取了一种推定的方式。具体而言：如果某合同条款起初仅仅准备用于某次特定合同磋商，虽然此后其再次被用于 其它 合同，但无法认定其是格式条款，原因在于：使用者主观上缺乏使用该格式条款的 计划性。使用者从一开始即将合同条款设定为多次使用的，即使在现实中仅被使用一次，并不妨碍认定该条款具有格式条款多次重复性特征。就企业使用的格式条款而言，因为企业赖于重复交易而生存，所以应推定其具有多次重复使用的特征，企业负担相反认定的举证责任。无论该条款是针对特定的合同当事人还是针对未来不确定的合同当事人都具有重复适用的性质。另外，在数量上如何确定多次重复使用也是一个主观裁量的问题。我个人认为，二次的使用目的即可满足多次重复的标准。 在 实践中，公司章程以及其他团体协约都具有多次重复使用的特点，就此是否能够认定该协议的属性为格式条款?从严格意义上出发，我国合同法将格式条款定义为合同条款，合同法的适用范围也不包括 公司法 和其他社团法上的协议，因此，并不能认定此类协议为格式条款，但是，此类协议的发起人也可能利用该条款单方面违反公平和诚实信用原则非法牟取利益，因此，可以类推适用格式条款法律控制的相关规定。 3.单方提出。依据我国合同法第39条第2款的规定内容，所谓单方提出就是格式条款使用人在订立合同时未与对方协商单方面决定合同内容。单方提出是格式条款产生危险的核心原因，因为其剥夺了对方当事人进行合同磋商的可能，并通常导致合同对方当事人丧失判断自由。从法 社会学的角度出发，格式条款的单方提出特征使其获得了与法律规范相类似的法律地位：使用人通过单方提出格式条款并事先确定其内容为其所有潜在的合同当事人设定了合同内容，其在功能上恰恰替代了合同法中的任意法部分。从此种角度出发，有学者认为，格式条款具有规范性的性质。 4.未经磋商。与上述第三个特征相关联，单方面提出格式条款的结果就是合同对方当事人丧失了磋商的可能。反之，即使格式条款的使用人单方提出格式条款，但该条款订入合同是基于当事人的自由磋商而发生的，则该格式条款演化为普通合同条款，其不再受制于内容控制。我国合同法并没有严格区分格式条款的单方面提出和未经磋商该两个特征，但在认定格式条款时，仍旧应当区分该二者，因为在现实中存在，双方当事人同时指定使用某格式条款的可能，在此种情况下虽然存在未经磋商，但该格式条款并不是某合同当事人单方面提出，因此不能认定其具有格式条款的性质。 5.条款的具体表现形式并不影响对格式条款的认定。依据我国合同法第10条的规定，合同形式有书面形式、口头形式和其他形式。因此，使用人以记忆的方式，多次单方面重复使用事先拟定的条款订立合同的，不影响对该条款属性的认定，当然，主张者应当负担举证责任。 必须指出的是，在认定是否存在格式条款时，必须同时存在上述特征，而不能孤立地适用单个特征以确认存在格式条款。 二、消费者保护对认定格式条款的影响 值得注意的是，随着消费者权益保护法的发展，民法中的主体原型由“一元”变为“二元”，即从一个“自我决定、意思自治的个人”为单一主体模式，发展到保留形式上平等的个人自治的“个人”与时刻处在需要法律提供外在保护的“弱者”并存的主体模式。民法的功能从彰显个人自治向直接外在“他治”转化。在民法中，保护弱者已经享有与“意思自治”同样的地位。因此，民法在围绕主体展开时，必须围绕两个主体原型的不同特点提供不同的制度模式，以私人自治为核心的法律行为制度原则上仅适用于主体具有外在意思表示真实的条件下，否则，法律以强行法的“他治”方式介入主体法律生活，以此实现实质正义。我个人认为，仅仅承认民法本位从“个人权利本位”过渡到“社会本位”并不足以解决对现代社会中因结构性不平等所导致的问题，必须承认民法的主体变迁和二元的主体模型并将消费者保护作为民法的一个核心任务之一，才能够确立民法在市民社会中的核心地位，否则民法在法律实际生活中地位不断受到侵袭并面临边缘化的困境将难以得到解决。将消费者保护法作为民法的特别法的作法是不足取的，其直接后果就是民法丧失市民社会中核心的法律地位。 受到消费者保护法律政策的影响，1993年的欧洲共同体关于消费者合同不公平条款的指令规定，经营者事先提出合同条款的，如果消费者在合同磋商时自身无法影响到该条款的内容，则该条款也被视为不公平条款。这样一来，在欧盟内部，格式条款法的适用范围获得了很大的扩张。由于欧盟指令具有一定意义上的强行性，所以所有成员国必须在最低限度内将该指令所规定的内容转入到内国法中，当然，成员国就具体方式享有选择权。目前，英国、德国等国家都吸纳了此种内容，此种扩张直接影响到在消费者合同中对格式条款的认定。 1.在经营者单方面提出合同条款时，即使其主观目的仅在于针对某个特定的消费者，即该条款并不具有重复使用的特点，但由于经营者和消费者之间结构性的不平等，导致消费者无法经过磋商改变该条款的内容，为了更好地保护消费者，在此情况下不采用重复使用的要件。 2.经营者使用该一次性的条款可能是基于自己事先的拟定 工作，有可能基于第三人的条款基础，也可能是基于自己的专业咨询人如律师的建议，但这些都不影响对格式条款的认定。 3.认定消费者是否无法对该条款施加内容上的影响，不仅仅要看消费者是否存在和经营者进行磋商的可能，还要看该格式条款的内容是否清晰、透明。在现代民法中，透明原则渗透到许多部分法中，“透明原则”也应当构成现代合同法的一个重要原则，即复杂合同条款的订立人必须负担详尽的说明义务，否则此种严重侵害具有合理期待的合同主体利益的合同条款无法成为有效的合同条款。尤其在格式条款文本中，使用者通常故意乃至恶意订立复杂难懂的格式条款文本，该文本还使用很多具有很大解释空间的概念，文本之间相互援引，即使是专业的法律人才也难以正确区分其间真正的权利义务分配和风险负担。从 经济 的角度出发，判断格式条款是否透明还必须考虑到时间因素。我们无法期待一个 法学教授在超市购买一个电话时，准备花费数个小时的时间研究商场和供应商所使用的格式条款或者标准合同。因此，经营者针对消费者负担尽可能清晰、透明制定其使用的条款的义务。 我国合同法形式上并不区分消费者合同和非消费者合同，但由于我国1993年的《消费者权益保护法》第24条先于《合同法》规定了对格式合同以及其不同表现形式加以规制的内容，因此，我国目前的立法体例还是从主体上区分相关法律的适用。如合同法也承认消费者合同的特殊性，合同法第113条第2款规定，经营者对消费者提供商品或者服务有欺诈行为的，依照《中华人民共和国消费者权益保护法》的规定承担损害赔偿责任。由于我国实行统一合同法，合同法第2条明确规定了合同法的适用范围，而且在体系上，格式条款法也被规定在合同法第二章“合同的订立”中，因此，无论是经营者之间的合同还是消费者合同，只要涉及到格式条款，都适用合同法第39条以下的规定内容。就合同的性质而言，区分消费者合同和非消费者合同具有一定的意义，如在违约责任方面，我国《消费者权益保护法》实行的惩罚性原则，而《合同法》实行的是补偿性原则。 从强化保护消费者的角度出发，有必要讨论是否应当引入上述欧盟所颁布的有关滥用条款的规制内容，即在消费者无法影响到一次性使用的合同条款的内容时认定该条款为格式条款。我个人认为，合同正义原则是我国合同法的基本原则[2]，合同的内容控制并不是一般合同的必然要求，其更多的在于纠正格式条款的结构性失衡。考虑到在格式条款之前消费者的利益更容易受到侵害，因此法律须针对主体特殊性提供特殊性的保护。既然经营者一次性适用的条款对消费者的利益构成侵害，以实质正义为本位的合同法必须作出相应的救济手段。我个人认为，强化消费者保护将增加企业生产成本、削弱民族企业竞争力的反对理由并不足取，因为在国际商品一体化的贸易 环境下，法律无法依据生产者的国别制定不同的消费者保护水平。尤其值得注意的是，我国市场中直接进口的产品在市场中的份额并不小，如果简单主张削弱对消费者的保护以增强民族 工业 竞争力，可能会发生对本国国民“低国民待遇”的后果。 综上所述，在保留目前立法体例的前提下，我国《消费者权益保护法》第24条应当作出比《合同法》第39条有关格式条款特征更为严格的认定要件，即在经营者单方面一次性合同条款且消费者无法改变该条款内容时，可以将该条款认定为格式条款，类推适用有关格式条款的法律规定。 三、商事活动对认定格式条款的影响 在 历史 上，我国受到“重农抑商”治国策略的强烈影响，商人自始至终没有成为 中国 社会中一个独立的社会阶层，传统中国法也没有体系化的商法，当然，实质上的商法规范还是存在的。由于历史的特殊原因，商法在欧洲大陆先于一般民法发展起来，商法的价值也具有不同于一般民法的特点，如交易安全性、迅捷性和习惯性。在资产阶级民主 政治 在西方取得胜利之后，商人已经不再是一个特殊的社会群体，相反，任何人都享有经济上的平等权利，商法更多的表现为民法之外的特殊性规定内容，在法的部门划分上不具有独立性。我国民法自民国时期第一次法典化即不采用民商分立的体系。 值得注意的是，随着社会群体基于在市场中不同地位而发生的分化，现实法律生活中经营者和消费者的二元对立的法律意义已经逐渐超出了商人与非商人的区分意义，由此民法体系内部出现了两个子系统，即保护消费者的法律和调整经营者活动之间的法律。此种分化对各国民事立法都产生了很大的影响，如在法国，立法者在《法国民法典》之外又单独制定了一部相对独立的《消费者保护法典》，在奥地利亦是如此;而德国采取了民法中心的立法模式，将消费者保护的任务纳入到民法功能范围内，这集中体现在2002年的《德国债法现代化法典》中。在法律适用上，经营者的主体性特征优于商人主体特征，此外，关于商主体的内部复杂划分标准也是商人主体特征逐渐被经营者主体特征取代的一个重要原因。 因此，我个人认为，在 现代 社会 经济 结构的背景下，经营者之间的 合同与消费者合同的划分远比商事合同和非商事合同重要。在认定格式条款时，应当考虑到经营者的特殊主体性。 有人认为，经营者在经济上实力强大、具有较强的专业知识，并且此种合同的目的旨在盈利，其应当承受正常的商业风险，因此格式条款法不适用于经营者之间的合同。但此种观点值得商榷： 首先，市场中的任何经营者都以获利为生存基础，因此经营者的任何商业活动都必须计入到成本中。所以， 法律 无法期待经营者在面对任何一个格式条款时都以一种不 计算 成本的方式通过聘用法律专业人才等方式规避格式条款所带来的弊端，或者两个经营者通过博弈达到合同法所期待的理想公平结果。 其次，并不是任何经营者都从事法律服务的业务，其就其经营业务之外的 法律知识 的掌握情况与消费者并不本质区别，甚至其如同消费者一样在法律面前一无所知，如一般的小型合伙 企业 。 第三，经营者所订立的合同并不都旨在牟利，其同样必须购买与经营活动无直接关系的合同。这也是适用法律的一个重要难点，即依据何种标准判断一个民事主体在一定的法律活动中从事的行为是旨在获利的独立经营行为。虽然我们可以采取推定的方式，认定私法上一切旨在盈利的法人所从事的一切活动都是经营活动，但不可否认，在格式条款面前，经营者通常同样面临消费者面临的问题，除非经营者之间所使用的是行业中通用的交易条款。 从比较法上看，德国新债法第310条第1款规定：“本法第305条第2款及第3款、第308条及第309条不适用于针对经营者、公法上的法人或公法上的特殊财产所适用的一般交易条件。就本款第1句所规定的情况，本法第307条第1款和第2款造成第308条和第309条所规定的合同内容无效的，该两款亦有适用余地;此处应适当考虑到交易活动中具有效力的惯例和习惯”。其中，德国民法典第305条第2款及第3款涉及到格式条款订入控制的内容，其理由基于经营者之间通常存在惯例的考虑，但这并不影响对经营者之间格式条款的内容控制。而德国民法典在第308条及第309条所列举的绝对无效和相对无效的一般交易条件“黑名单”虽然不直接导致此类条款在经营者之间无效，但实际上，由于格式条款内容控制的一般条款如诚实信用原则集中体现在此类具体规定的内容上，所以，消费者合同中的无效格式条款具有很强的指示功能，即此种条款出现在经营者之间的合同中通常也应无效，只有商事惯例和经营者之间的特殊 联系可以作为推翻此种指示作用的理由。 我个人认为，虽然我国采取统一合同法，但我国民事立法总体上仍旧区分消费者合同和非消费者合同，格式条款法首先适用于消费者合同，而且其应进一步适用于经营者之间的合同，经营者独立的盈利活动不应构成否定格式条款属性的事由，但对经营者合同之间的格式条款的内容控制力度应有所不同，这体现在商事惯例和经营者之间的特殊联系可作为经营者之间使用的格式条款生效的特定事由。 四、社会保障领域格式合同的特殊性 须探讨的是，合同法所规定的格式条款法是否可适用于所有合同类型?我国合同法第10章专门规定了供用电、水、气、热力合同，依据此类合同的性质，其通常建立在格式合同基础上，依据合同的整体解释，合同法第39条以下的规定内容必然适用于此种格式合同。但是，我国合同法将供用电、水、气、热力合同与 买卖合同 等其他合同并列规定为有名合同似乎不妥： 首先，此类合同涉及到国计民生的基本社会保障，此类合同面向所有不特定的民事主体，其所承担的社会功能不同于一般合同类型，因此其必须采取格式合同(而不仅仅是格式条款)的形式，而且在合同订立规则上应实行缔约强制原则。 其次，至少在针对普通市民(消费者)而言，此类合同通常并不以盈利为目的;这集中体现在电、水、气、热力的价格必须由国家权威部门通过听证会的方式确定。实际上，价格是此类合同格式条款的重要组成部分，而在一般格式合同中，当事人仍然可以就价格进行自由磋商。 第三，此类合同的具体条款通常必须取得国家相关主管部门的许可，因此该合同的格式条款多以行政规章的形式出现，对其内容控制通常出现在立法过程中，而不是事后的司法控制。 我个人认为，我国合同法不应将供用电、水、气、热力合同规定为与买卖合同相并列的典型合同形态，其应当通过相关部门的论证以单行规章的形式确定此类格式合同的内容。与其相适应，对此类格式合同的内容控制体现在单性规章制定过程中，在通过事前立法审查之后，以行政规章表现出来的此类社会供给格式合同将免于司法上的内容控制，不应将其认定为一般意义上的格式合同，否则法院将针对依据一定的立法程序产生的法律规章享有司法审查权，而这显然违反了目前我国法院所享有的司法权范围。 综上所述，在认定合同条款是否为格式条款时，必须从预先制定、多次重复使用、单方提出、未经磋商等方面考察;在消费者合同中，为了强化对消费者的保护，对经营者一次性使用、但消费者无法改变其内容的条款应类推适用格式条款的规则;当经营者之间使用格式条款时，商事惯例和经营者之间的特殊联系可作为否定格式条款属性的特定事由;对于社会供给领域的合同，应当通过事前的立法审查来保证此类特殊合同的公益性，法院事后无权针对具有法律渊源效力的特殊格式合同规章进行司法审查。 -------------------------------------------------------------------------------- 注释: [1]合同法第3稿第2章第29条规定：采用定式合同文本订立合同的，制订合同文本的一方应当采取合理的方式提请对方注意其免除责任的条款以及负有主要义务的条款，并应对方的要求对上述条款予以说明。对定式合同条款的理解发生争议的，应当作出有利于对方的解释。使用行业协会、主管部门或者母公司制定的定式合同文本订立合同的，适用前款规定。 [2]参见王利明著：《合同法研究》，第一卷，178页以下，2002年版。 看了“大学毕业论文开题报告ppt模板”的人还看： 1. 毕业论文开题报告模板免费 2. 本科毕业论文开题报告模板免费 3. 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药学毕业论文开题报告篇3 题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响 研究现状： 一、普鲁兰酶 普鲁兰酶(Pullulanase，. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( , Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶( )，异淀粉酶( , Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。 在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。 二、普鲁兰酶的研究现状 1.产普鲁兰酶的微生物 普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。 蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus ) 由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。 嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌() 上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热 (60℃)，耐酸()。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基(( ～)上生长良好。 枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis) 1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为～，但在时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。 耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes) 1987年.德国的等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在～有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域. Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans, 上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。 产普鲁兰酶的高温菌菌种 自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, , Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, , Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, 2.普鲁兰酶的分子结构 至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～,α～,α～,α～,α～,α～糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。 3.普鲁兰酶的应用 普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用: 单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。 普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪 饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。 试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加，麦芽糖含量平均增加了，糊精含量平均减少了高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。 用于啤酒外加酶法糖化 啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～和α～糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。 总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。 研究目的和意义： 酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。 其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。 研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集; (2)菌种初筛; (3)菌种复筛; (4)菌种保藏方法; (5)酶活力测定方法的建立。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响; (2)初始PH对发酵产酶的影响; (3)接种量对发酵产酶的影响; (4)发酵温度对产酶的影响; (5)金属离子对产酶的影响。 重点或关键技术： (1)纯菌株的分离; (2)菌株的鉴定方法的选择。 研究方法、手段： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样 (2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。 (3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。 (4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。 (5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。) (2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。) (3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%， 10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。) (4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。 (5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。) 研究进度 ：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。 ：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。 ：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。 2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。 文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等) 自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和，具有一定的耐热和耐酸特性。 陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达，最佳发酵条件下产量可达 .酶的最适作用温度为600C，最适pH值，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。 技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。 主要参考文献： [1][美]惠斯特勒等编王雏文等译.淀粉的化学与工艺学[M].北京：中国食品出版社，1988 [2]张树政.酶制剂工业[M]. 北京: 科学出版社，1998 [3]邬显章.酶的工业生产技术[M]. 吉林: 吉林科学技术出版社，1988 [4]Taniguchi H, Sakano Y, Ohnishi M, Okada G(1985) Pullulanase[J].TanpakushitsuKakusan Koso. 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