【摘要】 目的 在蛋白及mrna水平确定过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxiome proliferatoractivated receptorγ, pparγ）在大肠肿瘤中的表达。方法 结肠镜下活检标本，分为正常大肠粘膜组、大肠腺瘤组及大肠癌组，免疫组化及rtpcr方法检测各组pparγ的表达。结果 正常大肠粘膜中表达pparγ蛋白的细胞主要是接近肠腔，分化良好的腺上皮细胞；而在大肠腺瘤中，pparγ阳性的细胞呈弥漫分布。pparγ蛋白及mrna在大肠癌中的表达显著增加，明显高于大肠腺瘤和正常大肠粘膜(p<0.05)。pparγ蛋白及mrna在正常大肠粘膜及腺瘤中的表达无差异（p>0.05）。pparγ mrna在重度异型增生腺瘤中的表达高于正常大肠粘膜(p<0.05)，接近于在大肠癌中的表达（p>0.05）。结论 大肠腺瘤最先发生pparγ表达部位的变化,pparγ在重度异型增生的大肠腺瘤及大肠癌中的表达水平较高，表明pparγ可能在早期即参与大肠癌的发生发展。
【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体γ 大肠腺瘤 大肠癌
大肠癌多数由大肠腺瘤演变而来，其发生的经典多步骤模式为“腺瘤—腺癌序列”。过氯化物酶体增殖物激活受体γ(peroxiome proliferatoractivated receptorγ,pparγ)是由配体激活的核转录因子ppars的一个亚型，与消化道肿瘤关系密切。wwW.133229.cOM有研究发现pparγ在大肠粘膜细胞中有表达，本研究旨在蛋白水平和mrna水平确定大肠肿瘤中pparγ的表达情况。
1 材料与方法
1.1 材料收集、分组 所有组织均取自北医三院消化科结肠镜下活检标本，并经病理诊断证实。正常大肠粘膜15例、大肠腺瘤16例及大肠癌上皮15例行免疫组织化学染色。正常大肠粘膜24例、大肠腺瘤58例(其中重度异型增生大肠腺瘤14例)及大肠癌上皮38例行rtpcr。
1.2 pparγ的免疫组化染色 组织取材后于福尔马林中固定、脱水、常规石蜡包埋、切片（厚4μm）→铺于多聚赖氨酸涂布的载玻片上→常规脱蜡至水→0.1m pbs浸泡5min→抗原修复（0.1m枸橼酸盐缓冲液预热至92℃～98℃，放入玻片，微波炉内92℃～98℃加热5min，自然冷却至室温）→0.1m pbs冲洗5min→3%过氧化氢孵育10min，消除内源性过氧化物酶活性→0.1m pbs冲洗5min→滴加封闭用正常山羊血清（北京中山生物科技公司），室温孵育15min，倾去→滴加1∶20稀释的鼠抗人pparγ单克隆抗体(一抗，santa cruz 生物技术公司，美国)，4℃过夜。→0.1m pbs冲洗5min→滴加生物素标记羊抗小鼠igg（二抗，北京中山生物科技公司），37℃孵育15min→0.1m pbs冲洗5min→滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（北京中山生物科技公司），37℃孵育15min→0.1m pbs冲洗→dab显色，自来水充分冲洗→苏木素复染后封片。阴性对照用正常山羊血清代替一抗。
pparγ阳性反应表现为细胞核和胞浆呈棕褐色。每张切片选取3～5个视野，用《真彩色病理图像分析系统 4.0》（北航图像中心）对免疫组化染色结果进行分析，计算面密度(阳性目标总面积/统计场总面积)，并进行统计。
1.3 rt pcr trizol（invitrogen公司）提取组织总rna，适量depc水溶解后，分光光度计（uv1601，shimadzu）测od260 及od280的值及电泳测定rna浓度及纯度；各取2μg的rna，impromiirt试剂盒（promega公司）将rna逆转录为cdna；taq dna聚合酶（北京泛基诺科技有限公司）作用下进行pcr反应（pcr仪为geneamp9700， 美国applied biosyetems公司）。反应条件见表1。
阴性对照不加逆转录酶，代以去离子水，余反应条件同前。
内参βactin及目的基因pparγ的pcr产物各6μl于1.5%琼脂糖凝胶75v/cm恒压电泳，eb染色后在紫外灯下观察，清晰见341bp和500bp的条带，在imagemaster凝胶成像系统仪（quantity 0ne，美国柯达公司）下分析。pparγ与βactin电泳条带灰度的比值代表各组pparγ的表达水平。
1.4 统计学分析
结果用±s表示。采用spss11.0软件分析。计量资料的组间比较采用单因素方差分析，p<0.05认为差异有统计学意义，p<0.01认为差异极具统计学意义。
2 结果
2.1 pparγ 蛋白在人正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中的表达
免疫组化结果显示：在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中均有pparγ的表达。正常大肠粘膜组织中表达pparγ的细胞主要是接近肠腔、分化良好的腺上皮细胞，见图1a；而在大肠腺瘤组织中，pparγ阳性细胞的分布发生异常，分布的极性消失，呈弥漫分布，见图1b。pparγ蛋白在正常大肠粘膜及腺瘤中的表达差异无统计学意义(p>0.05)。 pparγ蛋白在大肠癌细胞中高表达，见图1c, 明显高于在大肠腺瘤及大肠粘膜中的表达 (p<0.01) ，见表2。表2 pparγ蛋白在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌中的面密度(阳性目标总面积/统计场总面积）
2.2 pparγ mrna 在正常大肠粘膜、大肠腺瘤及大肠癌上皮中的表达
rtpcr结果显示：大肠癌中的pparγ mrna的表达水平最高，明显高于正常大肠粘膜和大肠腺瘤，与两者相比，差异均有统计学意义（p均<0.01）；pparγ在正常大肠粘膜和大肠腺瘤中的表达差异无统计学意义（p>0.05），见表3，图2。
2.3 pparγ mrna在正常大肠粘膜、重度异型增生大肠腺瘤及大肠癌中的表达
rtpcr结果显示：重度异型增生腺瘤中pparγ mrna的表达高于正常大肠粘膜，两者间差异有统计学意义(p<0.05)，但与大肠癌中pparγ的表达差异无统计学意义（p>0.05），见表4。表1 pparγ pcr扩增反应条件
扩增基因反应体系cdna模板引物序列退火温度循环次数产物大小pparγ25μl2μl上游: 5′atgacagcgacttggcaata3′50°c40341bp下游: 5′gcaactggaagaagggaaat3′βactin25μl1.5μl上游: 5′gtggggcgccccaggcacca3′55℃25500bp下游: 5′ctccttaatgtcacgcacgat3′
图1 pparγ蛋白在正常大肠粘膜(a)、大肠腺瘤(b)及大肠癌中的表达(c)
m:marker;control:阴性对照;n:正常大肠粘膜;a:大肠腺瘤;c:大肠癌表3 pparγ在正常大肠粘膜、大肠腺瘤
3 讨论
pparγ是由配体激活的核转录因子ppars的一个亚型，亚油酸、花生四烯酸，15脱氧－△12，14－前列腺素j2(15d－pgj2) 是其天然配体，噻唑烷二酮类药物（tzd）、某些非甾体类抗炎药（nsaids），如舒林酸为其合成配体。pparγ的生物学功能复杂，在调控脂肪和糖代谢、脂肪细胞及单核细胞分化成熟、炎症反应、诱导肠细胞分化及肿瘤细胞的分化和凋亡中起重要作用。
已证实，pparγ在脂肪细胞中高表达，近期数据表明大肠中pparγ的表达水平与脂肪细胞中相似[1,2]。mansen[1]等免疫组化及western实验发现鼠大肠和小肠粘膜均表达pparγ。而且，pparγ在朝向管腔分化好的大肠粘膜细胞中表达水平较高，大肠中pparγ mrna的表达也高于小肠。lefebvre[3]等的研究发现啮齿动物和人类大肠中pparγ mrna及蛋白的表达水平高于小肠，而且pparγ都分布在分化较好的大肠粘膜细胞中。在 caco2和ht29人大肠腺癌细胞系中，pparγ的表达随分化级别的增高而增加，说明pparγ表达水平与大肠上皮细胞的分化表型有关。此外，在多种小肠肿瘤的小鼠中，pparγ在大肠中的表达也高于小肠[4,5]。这些结果表明肠道粘膜中存在pparγ，但它同大肠肿瘤的关系尚不明了。
最近的研究显示，pparγ的代表性配体－噻唑烷二酮具有抑制pparγ阳性的大肠癌细胞系ht29的生长和转移的作用[6]。而且，pparγ的配体可以促进多种细胞，包括大肠癌细胞的凋亡，并促进其分化及生长抑制[7]。可见，pparγ与大肠肿瘤的关系密切。
我们的研究显示：pparγ主要在朝向大肠管腔的分化好上皮细胞中表达，同国外的研究结果相同[1,3]。pparγ蛋白及mrna在正常大肠粘膜与大肠腺瘤无明显差别。然而，pparγ蛋白在大肠腺瘤中弥漫分布，可见于腺窝底部分化不好的上皮细胞中。同时，pparγ蛋白及mrna在大肠癌中高表达，明显高于正常大肠粘膜及大肠腺瘤中的表达。这些数据表明pparγ表达异常可能是大肠癌发生的早期事件，首先发生pparγ表达部位的异常，随后出现表达量的异常。我们研究显示重度异型增生腺瘤中pparγ mrna表达接近于大肠癌中的表达也支持这一假设。我们的结果同houseknecht[7]、dubois[8]和su[9]的结果一致。
然而，大肠肿瘤中pparγ升高的原因尚不明确。chen[10]等考虑大肠肿瘤中pparγ的高水平表达为代偿性的。已证实大肠癌中抗凋亡基因bcl2的表达升高，使大肠癌细胞凋亡减少而起到促进肿瘤生长的作用。同时，越来越多的证据说明激活pparγ后促进癌细胞的凋亡[1113]，即pparγ和bcl2在大肠癌中的作用相反，两者在维持细胞的增殖、分化和凋亡的平衡中存在相互制约的关系。chen的研究[11]提示大肠肿瘤中pparγ内源性配体存在缺陷，在无外源性配体存在的情况下，pparγ不能被充分激活。大肠肿瘤中高表达的pparγ不能充分发挥其促凋亡作用，而高水平表达的bcl2却可以抑制大肠肿瘤的凋亡，为了与升高的bcl2维持制约平衡，大肠肿瘤中pparγ进一步代偿性升高。另外，park等[14]认为，在腺瘤样大肠息肉易感基因（apc）突变的大肠癌细胞中，ppars的另一个亚型——pparβ的表达也增加，而pparβ和pparγ竞争性结合维甲酸x受体（rxr）进而发挥其转录作用。因此，为了充分发挥作用，大肠癌细胞中pparγ水平升高。
总之，pparγ表达部位的变化首先见于大肠腺瘤，重度异型增生的腺瘤及大肠癌中pparγ的表达水平较高。这些数据表明pparγ可能在大肠癌发生的早期起作用，pparγ表达水平的升高有可能成为大肠肿瘤的表型标志。
【参考文献】
［1］ mansen a, guardioladiaz h, rafter j,et al. expression of the peroxisome proliferatoractivated receptor (ppar) in the mouse colonic mucosa[j]. biochem biophys res commun，1996,222(3):844851.
[2] auboeuf d，rieusset j, fajas l,et al. tissue distribution and quantification of the expression of mrnas of peroxisome proliferatoractivated receptors and liver x receptoralpha in humans: no alteration in adipose tissue of obese and niddm patients[j]. diabetes，1997,46(8):13191327.
[3] lefebvre m, paulweber b, fajas l,et al. peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma is induced during differentiation of colon epithelium cell[j]. j endocrinol，1999,162(3):331340.
[4] saez e, tontonoz p, nelson mc,et al. activators of the nuclear receptor ppargamma enhance colon polyp formation[j]. nat med 1998,4(9):10581061.
[5] lefebvre am, chen i, desreumaux p,et al. activation of the peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma promotes the development of colon tumors in c57bl/6japcmin/+ mice[j]. nat med，1998,4(9):10531057.
[6] yoshizumi t, ohta t, ninomiya i,et al. thiazolidinedione, a peroxisome proliferatoractivated receptorgamma ligand, inhibits growth and metastasis of ht29 human colon cancer cells through differentiationpromoting effects[j]. int j oncol, 2004,25(3):631639.
[7] houseknecht kl, coleb m, steele pj. peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma and review [j]. domest anim endocrinol, 2002, 22(1):123.
[8] dubois rn, gupta r, brockman j,et al. the nuclear eicosanoid receptor, ppargamma, is aberrantly expressed in colonic cancers[j]. carcinogenesis，1998,19(1):4953.
[9] su cg, wen x, bailey st,et al. a novel therapy for colitis utilizing pparγ ligands to inhibit the epithelial inflammatory response[j]. j clin invest，1999,104(4):383389.
[10]chen gg, lee jf, wang sh,et al. apoptosis induced by activation of peroxisome proliferator activated receptorgamma is associated with bcl2 and nfkappab in human colon cancer [j]. life sci，2002, 70(22):26312646.
[11]brockman ja ,gupta ra，dubois rn. activation of pparγ leads to inhibition of anchorageindependent growth of human colorectal cancer cells[j]. gastroenterology，1998,115(5) :10491055.
[12]kitamura s, miyazaki y, shinomura y, et al. peroxisome proliferatoracticated receptor gamma induces growth arrest and differentiation markers of human colon cancer cells [j]. jpn j cancer res，1999，90(1) :7580.
[13]sarraf p, mueller e ,jones d, et al. differentiation and reversal of malignant changes in colon cancer through pparγ[j]. nature med，1998，4(9) :10461052.
[14]park bh, breyer b, he th. peroxisome proliferatoractivated receptors :roles in tumorigenesis and chemoprevention in human cancer[j]. curr opin oncol，2001,13(1):7883.
