IL1基因多态性对胃粘膜TNFα、NFκB的表达

【摘要】 目的探讨il1的基因多态性影响h.pylori感染后胃癌发生的机制。方法通过多态性分析和血清h.pylori抗体测定，收集105例癌低发区的学生作为研究对象，其中il1511t/t基因型32名（13名h.pylori+），c/c基因型36名（15名h.pylori+），c/t基因型37名（14名h.pylori+）。结果在胃体组织，h.pylori阴性个体tnfα和nfκb表达量极少，而且il1b511各基因型间也无显著差异。在h.pylori阳性个体，胃体部tnfα和nfκb mrna有较为明显的表达，il1b511t/t基因型个体比c/t和c/c基因型明显增加，分别为1.20±0.17 vs. 0.87±0.18和0.94±0.16；1.10±0.16 vs 0.90±0.15和0.97±0.17，f=33.4和12.9，p=0.0001和0.001。h.pylori阴性的nfκb mrna活性很低。在h.pylori阳性个体，nfκb 活性显著增加。而且il1b511t/t基因型个体比c/t和c/c基因型明显增加，分别为0.99±0.12vs 0.89±0.15和0.90±0.14，f=5.6，p=0.005。结论h.pylori感染促进tnfα和nfκb mrna表达，上调nfκb活性，在il1b511t/t基因型个体更明显。提示h.pylori感染后，存在il1b基因多态性→il1β↑→炎症细胞因子↑→胃癌发生的完整通路。WwW.133229.cOM

【关键词】 胃癌；il1b；多态性；tnfα；nfκb；炎症

enhenced nfκb activity and tnfα transcript in h.pylori (+) individuals are associated with il1b gene polymorphisms

cheng huanchao1, feng jueping2, wei shaozhong1, zhang keliang1, li guangcan1, hu desheng1, hu yanping1, hu sheng1

1.the department of oncology,hubei cancer hospital，wuhan 430079, china；2.the fourth hospital of wuhan city

corresponding author: hu sheng,email: ehusmn@yahoo.com.cnabstract：objective il1β gene polymorphisms affect the expression of of il1β. the induction of il1β by h.pylori strongly inhibited acid secretion,which has been supposed to contribute to a high incidence of gastric cancer. however, il1b511 t allele has no influence in gastric acid output according to our recent study. we hypothesized that the expression of proinflammatory cytokine such as il1b and tnfa and activation of nfκb may be involved in il1b511 t allele associated gastric cancerogenesis.methodsone hundred and five healthy samples from the regions with low incidence of gastric cancer were genotyped for il1beta 511 polymorphisms by pcrrflp. the expression of il1β, nfκb and tnfα were measured using rtpcr, and nfκb activity were detected by emsa.resultsin gastric corpus of h.pylori() individuals, the expression of nfκb and tnfα were similar and remarkably lower than h.pylori(+) group.in addition, t/t genotype of il1b511 among the h.pylori infected individuals, expressed higher level of nfκb and tnfα(1.20±0.17 vs. 0.87±0.18 and 0.94±0.16；1.10±0.16 vs. 0.90±0.15 and 0.97±0.17，f=33.4 and 12.9，p=0.0001 and 0.001,respectively) and induced the strongest nfκb activity (0.99±0.12 vs. 0.89±0.15 and 0.90±0.14，f=5.6，p=0.005) than that of other two genotypes. whereas,h.pylor() individuals showed attenuated activity of nfkb.conclusionchronic h.pylori infection induced expression of il1β, tnfα and activate nfκb activity, which predisposed individuals with il1b511t/t genotype. our findings suggested tnfα and nfκb signaling play crucial role in the relationship between il1b gene polymorphism and gastric cancerogenesis.

key words：gastric cancer; il1b; polymorphism; tnfα; nfκb;inflammatory

1资料与方法

1.1研究对象通过多态性分析和血清抗体测定，收集胃癌低发区（广东籍贯）的105例健康学生作为研究对象，无胃病史、无系统性红斑狼疮、糖尿病、类风湿性关节炎、炎症性肠病病史、无胃癌家族史。其中il1511t/t基因型32名（13名h.pylori+），c/c基因型36名（15名h.pylori+），c/t基因型37名（14名h.pylori+）。具体资料见表1。表1所有研究对象的一般资料

tab 1common materials of 105 subjectsil1511基因型（il1511genotype）t/t(n=32)c/t(n=36)c/c(n=37)h.pylori+ 13 15 141sex（f/m） 14/18 16/20 18/192age（years） 22.6±1.6 22.7±1.5 22.0±1.63 1：χ2=0.7;2：χ2=0.3，p>0.05;3：f=0.2，p>0.05il1b511基因多态型分析（使用avai核酸内切酶，识别序列为c▲（t/c）cg（a/g）g）和h.pylori抗体测定（elisa方法，试剂盒为biocheck 公司产品，igg>20u/ml为阳性），具体见文献[5]。在各基因型之间，h.pylori感染率、性别构成和年龄均无明显差异，提示各基因型间的一般资料具有可比性。

1.2组织标本的采集所有入选对象均进行胃镜检查。胃镜检查取胃粘膜组织如下：胃窦2块（1块供病理检测，1块快速尿毒酶实验），胃体2块，供mrna测定和核蛋白测定。

1.3il1β、tnfα和nfκb mrna表达的检测

1.3.1rna的提取取将称量后的新鲜胃粘膜组织标本放入1000μl玻璃匀浆器中。加预冷的trizol 1000μl充分混匀，反复冰上碾磨，在15℃~30℃孵育5min使核定白复合物完全解离。加入氯仿200μl反复混匀30秒，离心（12000×g）15min。取上清离心（12000×g）10min，加入75%乙醇、室温干燥。加入40μl te缓冲液（ph=8.0）4℃过夜溶解rna（具体见文献5）。

1.3.2mrna的定量首先对组织标本进行重量测定，依据组织重量加rna溶解te缓冲液。然后在lambda10型分光光度计（pe公司）测定溶液a260/280，a260为1时相当于40μg/ml rna，最后依据如下公式计算mrna浓度（n为稀释倍数）。rna total=a260 ×40×n

1.3.3rtpcr扩增il1β的扩增产物为480bp[4]。扩增tnfα的引物序列为，p1：gagtgacaag cctgtagccc atgtt； p2：aagccctggt atgagcccat ctatct，扩增产物为336bp。扩增nfκb的引物序列为：p1：aagtgcgagg ggcgctccgc gggcag；p2：gagcagcgtg gggactacga cctga；扩增产物为403bp。rtpcr反应体系为50μl，使用promega公司accessquicktmrtpcr系统。具体pcr的循环次数由il1β、tnfα和nfκb和gapdh（为内参加，引物序列为p1：5'cacagtccatgccatcactg'3，p2：5'tactccttggaggccatgtg'3，扩增产物为480bp）的扩增量决定，每次采用循环次数梯度递减的方法，直到找出最少的必需循环次数。il1b rtpcr产物8μl以2.0%琼脂糖凝胶电泳，100v 25min，然后0.5μg/ml溴乙锭染色，紫外灯下观察结果，并在凝胶成像系统（gel doc 100 system，biorad公司）扫描电泳结果，计算il1mrna与gapdh mrna的光密度（od）的比值。

1.4nfκb活性的凝胶电泳迁移实验检测

1.4.1胃粘膜核蛋白提取使用核蛋白抽提试剂盒（thermo fisher scientific inc，rockford，usa），按产品说明书操作（稍有改变，）：将称量后的胃粘膜组织的置于冰上碾碎，在匀浆中匀浆并500×g离心，弃上清后干燥细胞团，加0.2ml冰冷的胞浆蛋白裂解液ⅰ，冰上孵育10min。加11μl 冰冷的胞浆蛋白裂解液ⅱ，冰上孵育1min。再振荡5sec，离心16000g离心5min。迅速移出上清，上清液即为胞浆蛋白液，于-80℃保存备用。

1.4.2nfκb凝胶电泳迁移实验按照说明书进行nfκb探针（5′agttgaggggactttaggc3′，promega）标记。配制20ml 4％的聚丙烯酰胺凝胶。设置emsa结合阴性对照反应体系，阳性对照反应体系，特异性冷竞争反应，非特异性竞争反应，nfκb（p49或p50）反应体系。按照顺序依次加入各种试剂，混匀后立即上样。4%非变性丙烯酰胺凝胶电泳，用0.5×tbe作为电泳液。按照10v/cm的电压预电泳10min。电泳结束后，干胶仪器上干燥emsa胶。然后用x光片压片，然后检测光密度值。

1.5统计学方法计量资料以

　　2结果

2.1il1511基因多态性与tnfα和nfκb mrna表达量的关系在h.pylori阴性的个体，tnfα和nfκb mrna的表达量极少，在il1b511各基因型间il1β mrna的表达也无显著差异；在h.pylori阳性个体，tnfα和nfκb mrna有较为明显的表达，而且il1b511t/t基因型个体更明显；如图1、2所示。

2．2nfκb活性检测

进一步分析胃体组织nfκb的活性发现，h.pylori阴性的nfκb mrna活性很低，il1b511各基因型之间也无明显差异。然而，在h.pylori阳性个体，nfκb 活性显著增加。而且h.pylori阳性，il1b511t/t基因型个体nfκb 活性比c/t和c/c基因型明显增加，分别为0.99±0.12vs 0.89±0.15和0.90±0.14，f=5.6，p=0.005，见图3。lane 1: negative control;lane 2: positive control;lane 3: c/c genotype with h.pylori infection;lane 4: c/tgenotype with h.pylori infection;lane 5: t/t genotype with h.pylori infection;lane 6:t/t genotype without h.pylori infection;lane 7:a standard dna ladder.exposure time was 30 seconds with xray film

3讨论

癌症与炎症的联系首先由virchow1863年假设提出[7]，近来逐渐得到了大量研究的支持。流行病学研究已经发现，慢性炎症患者对多种癌症易感，据估计，全世界范围内，感染和炎症反应与15%~20%的癌症死亡存在联系[1]。有很多慢性炎症的启动因素，包括微生物感染（如h.pylori感染与胃癌和胃粘膜淋巴瘤）、自身免疫疾病（炎症性肠病与结肠癌）和不知原因的炎症状态（前列腺炎和前列腺癌）都会增加癌症危险性。然而，感染h.pylori后的临床后果差异甚大，近年较普通接受的假说认为，宿主局部酸分泌状态是决定h.pylori感染后慢性胃炎类型的主要因素。当酸分泌处于较低水平，易发生全胃炎，有发展为胃粘膜萎缩和肠化的倾向，进而发生胃溃疡和胃癌的危险性较大[89]。el0mar 等[1]认为，il1b基因多态性与胃粘膜感染h.pylori时il1β的产生量有关，而后者具有很强的抑制胃酸分泌作用，但是，我们以前的研究未能发现il1b基因多态性→il1β↑→胃酸分泌↓的通路。所以，il1b基因多态性中，感染后的大量炎症信号的激活可能与胃癌发生有关。nfκb是刺激抗凋亡基因表达的主要转录因子，在静息的细胞中，nfκb被阻隔在细胞浆内，与iκbs等抑制性蛋白形成复合体，处于无活性状态，可以由活性氧化物、蛋白水解酶、透明质酸il1和tnfα等诱导活化nfκb[6]。目前已经发现，h.pylori感染后的胃粘膜微环境中，存在大量的前炎症因子的表达，如tnfα，il1β，il8和il6。虽然还不十分准确地知道前炎症因子如何在h.pylori感染后的胃癌发生中的机制，但我们知道tnfα也是一个关键的因素。主要的依据有：tnfα本身是很强的肿瘤启动因子，在体外可以诱导细胞发生转化[10]。在tnfα缺陷小鼠，佛波酯和冈田酸难以诱导皮肤癌的发生。已经有研究发现，在慢性炎症中il1β是诱导nfκb上调的原因，而nfκb激活是诱导tnfα表达的关键因素；当然，tnfα也可促进nfκb的激活。提示il1β，tnfα和nfκb之间并不是只有单向调节作用，还存在复杂的相互调节。本课题进一步对胃黏膜tnfα和nfκb mrna表达研究发现，在h.pylori阳性胃体粘膜，tnfα和nfκb mrna，以及nfκb的活化存在明显上调，而且il1b511t/t基因型的表达比其他基因型要高（p<0.05）。说明h.pylori感染后，存在il1b基因多态性→il1β↑→炎症细胞因子↑→胃癌发生的完整通路。值得提出的是，我们研究结果将来对胃癌预防有提示作用，即h.pylori感染后使用抑酸药物不一定不安全，而抗炎药物可能会减少胃癌的危险性[11]。

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