【关键词】 大肠癌 pgdh 转染 细胞生长 p53
分子遗传学在人类肿瘤研究领域中的应用,使人们认识到有一类基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着重要的负调控作用,并能潜在地抑制肿瘤的生长。这类基因的特点是：一是该基因在正常组织中表达;二是恶性肿瘤组织中功能失活、结构改变或表达缺陷；三是将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞内,可部分或全部逆转其恶性表型[1] 。wWW.133229.cOM近年研究表明, 15羟基前列腺素脱氢酶(15hydroxyprostaglandin dehydrogenase, pgdh)具备类似上述的特征,如mrna及蛋白在大肠粘膜及多种正常组织中表达，但在大肠癌组织中表达下调[2,3] ; 肺腺癌a549细胞转染表达pgdh后,裸鼠致肿瘤能力明显降低[4]；转染pgdh能够诱导乳腺癌细胞凋亡[5]等。大肠癌中pgdh的抑癌作用及可能的机制国内尚无报道，对pgdh的进一步研究不仅对探索肿瘤发生发展的分子生物学机制具有重要意义,并能够为肿瘤的诊断和治疗提供实验及理论的积累。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
trizol、rpmi1640、lipofectamintm购自invitrogen公司；mtt、细胞用琼脂粉购自sigma公司；限制性内切酶、反转录pcr试剂盒购自takara公司；大肠癌细胞株sw480购自上海细胞库；pgdh单克隆抗体购自cayman公司；p53、p21单克隆抗体及hrp标记二抗购自santa cruz公司；ecl检测试剂购自amersham公司；其他均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的构建 利用trizol提取正常人大肠粘膜组织总rna，通过反转录pcr扩增pgdh编码框。合成5′端含hind ⅲ (上游)和bamh ⅰ(下游)酶切位点的引物( f1：5′aag ctt ctg cac cat gca cgt ga 3′；f2：5′gcg gat cct tca gct atg gct aac3′）。再将载体pcdna3.1和pgdh的pcr产物分别于37℃，bamh ⅰ和hind ⅲ酶切,回收产物经t4连接酶16℃连接20h，然后转化感受态dh5α，阳性克隆命名为pcdna3.1pgdh，经pcr、双酶切和测序验证。
1.2.2 细胞培养和基因转染 sw480大肠癌细胞在5%co2、37℃、饱和湿度条件下培养于含10%已灭活的胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的rpmi1640培养基中。收获对数生长期的细胞(细胞数约5×106)接种于60mm培养皿，待细胞密度长至90%时，参照lipofectamintm2000试剂操作指南分别用pcdna3.1pgdh和pcdna3.1质粒转染细胞，获得sw480/pcdna3.1pgdh (实验组)及sw480/pcdna3.1(对照组)细胞。
1.2.3 细胞生长曲线 取转染24小时后的细胞，分别以1×104个/ml细胞浓度接种于96 孔板，置培养箱，24小时后每孔加20μl mtt (5mg/ml)，4小时后加入二甲基五枫100μl，室温振荡10min，应用酶联免疫测定仪，测波长490nm吸光度值，每天计数，每组细胞10孔，连续检测6天，绘制细胞生长曲线。
1.2.4 细胞平板集落形成实验 取转染24小时后的细胞200个接种于6孔板。5%co2、37℃、饱和湿度条件下培养14天，可见细胞集落时终止培养。常规pbs漂洗，甲醇固定10min，0.4%结晶紫染色10min。实验重复3次,显微镜下计数大于50个细胞的集落数,取平均值。集落形成率=集落数/接种细胞数×100%。
1.2.5 软琼脂集落形成实验 将0.7%琼脂糖和1.2%的琼脂粉灭菌处理后，当温度降至40℃时，按1∶1比例与2×rpmi1640 (含双倍血清和抗生素)混合成为上层和下层培基，加1.5ml下层培养基于6孔板凝固后，将约2 000个细胞与1.5ml上层培养基混合,加到已凝固的底层琼脂上。5%co2、37℃、饱和湿度条件下培养20天，于倒置显微镜下观察。实验重复3次，镜下(×40)随机挑选10个视野计数细胞克隆数。
1.2.6 流式细胞仪检测 1×105个/ml的细胞悬液，用pbs洗涤2次，700ml/l冷乙醇固定，dapi染色，上样于流式细胞仪进行细胞周期检测，计算各周期百分比。
1.2.7 western blot检测 western blot检测pgdh、及p53、p21蛋白水平的变化，βactin作为对照。收获转染48小时的细胞(约1×106)于200μl细胞裂解液中，冰上裂解30min，4℃、12 000g离心10min，收集上清，用bradford法定量。取50μg样品与等体积的2×上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min，12% sds聚丙烯酰胺凝胶(page)分离蛋白。半干式电转移至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉室温封闭2h，加入封闭液1∶1 000稀释的pgdh、p53、p21及βactin多抗，4℃过夜；pbst洗3次，每次5min；加hrp标记的二抗，室温反应2h，pbst洗3次，每次5min；ecl发光，x线胶片曝光。
1.3 统计学方法
采用spss11.0统计软件对计量资料进行student′s t检验分析，计数资料进行χ2检验。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 pcdna3.1pgdh真核表达质粒的构建和鉴定
采用基因重组技术构建了pcdna3.1pgdh质粒, pcr及酶切后送菌液测序,正确的质粒用于下一步实验，见图1。
2.2 pgdh基因对sw480细胞形态学的影响
转染表达pgdh后，细胞形态发生变化，对照组细胞呈卵圆形、多边形、贴壁叠堆状生长,胞浆均匀透亮;而实验组细胞叠堆状或多层明显减少,细胞间相互分散,出现梭形细胞,胞体变长,胞浆透亮度下降,颗粒感增强,部分细胞皱缩、细胞胞体回缩变圆或脱落呈悬浮状,并出现细胞碎片，见图2。
2.3 pgdh对肿瘤细胞增殖能力的抑制
从图3的3种细胞生长曲线可见, 实验组sw480/pcdna3.1pgdh细胞的生长速度明显下降，而对照组sw480/pcdna3.1生长曲线在三天后呈现持续升高的趋势，与未转染的sw480细胞生长能力相似。
平板集落实验中,接种细胞一周后,可以见到对照组已有散在的细胞集落形成,而实验组集落偶见；14天后，与对照组相比,实验组细胞克隆个数少而且体积较小，见图4。计数发现，实验组细胞集落形成率为16%，对照组为58%，两者差异有统计学意义(p<0.05)。进一步分析显示，pgdh对sw480细胞的集落形成抑制率为82.3%。结果表明pgdh可以抑制肿瘤细胞增殖。
2.4 流式细胞仪检测细胞周期
实验组细胞g1期平均值153.4，占86.8%；g2期平均值292.4，占5.7%；s期占7.5%；g2/g1为1.863。对照组细胞g1期平均值146.5，占62.8%；s期占19.9%；g2期平均值281.1，占16.6%。比较后可见, 实验组静止期细胞所占比例增加，dna合成期所占细胞比例减少，表明细胞转染表达pgdh后分裂增殖能力被抑制。
2.5 pgdh对肿瘤细胞悬浮非依赖能力的抑制
软琼脂集落形成实验是检测肿瘤细胞悬浮非依赖能力的重要手段,实验发现,在接种细胞第10天时,对照组出现高倍镜下(×100)明显可见的细胞克隆,而实验组偶见小的克隆;第14天时,两组克隆虽然增多、增大,但与对照组相比,实验组的克隆数目少，克隆体积小，见图5。计数后显示，实验组每视野平均克隆个数为（7±1.68）；对照组为（16.3±3.63），两组差异有显著的统计学意义(p<0.01) 。
2.6 western blot检测结果
sw480细胞没有内源性pgdh蛋白表达, 转染pcdna3.1pgdh质粒48h后在细胞裂解液中可以检测到pgdh蛋白。与转染空载体细胞相比，p53、p21蛋白表达明显升高，见图6。提示p53途径可能与pgdh抑制肿瘤细胞恶性增殖有关。
3 讨论
大肠癌的发病率和死亡率在全世界呈逐年上升趋势[6]。大肠癌发生发展是多基因参与、多步骤及多阶段的分子事件模式，如 dna甲基化水平变化，ras激活myc扩增，p53和apc突变等[7，8]，这些基因仍不足以解释肿瘤的发生、发展的全过程。前列腺素（prostaglandin，pg）合成的重要限速酶——环氧合酶(cox)2 参与肿瘤的发生和发展过程，pgdh作为pgs的降解酶，可降解pge2，对cox2亦有天然拮抗作用。最近有研究显示在结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和甲状腺髓样癌中pgdh表达缺失或减少，其表达缺失或减少乃至其生物活性的降低是肿瘤发生的早期事件，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。但是pgdh在大肠癌中如何发挥作用机制尚不清楚。
无限增殖和凋亡受阻是肿瘤细胞的重要特征，抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡是治疗肿瘤的理想方法。本研究发现大肠癌sw480细胞转染表达pgdh后，细胞叠堆状或多层明显减少，细胞间相互分散，出现梭形细胞，胞体变长，胞浆透亮度下降，颗粒感增强，部分细胞皱缩、细胞胞体回缩变圆或脱落呈悬浮状，并出现细胞碎片，提示pgdh基因转染干扰了人大肠癌细胞的正常生长。细胞生长曲线表明转染pgdh基因抑制了sw480细胞的增殖能力。平板集落形成实验14天后观察发现，与空载体转染组相比，细胞克隆个数少而且体积较小。实验组细胞集落形成率为16%，对照组细胞集落形成率为58%，经比较，差异有统计学意义（p<0.05），两组相比，pgdh基因集落抑制率为82.3%。说明pgdh基因转染降低了人大肠癌sw480细胞的集落形成能力，对sw480细胞的增殖有抑制作用，并且阻滞于g1期。软琼脂克隆形成实验是测试细胞恶性程度的重要指标。肿瘤细胞丧失了接触抑制，而且可达到高于正常细胞的密度，甚至形成多层细胞，肿瘤细胞丧失“着壁”生长特性，不依赖固体基质，能在半固体琼脂糖培养基中形成细胞集落，也称停泊非依赖性。我们通过双层软琼脂培养发现， pgdh基因转染后软琼脂克隆形成慢，个数少而且体积小，提示pgdh部分逆转了sw480细胞的恶性表型。通过western blot检测进一步发现，转染pgdh基因后伴随着p53、p21蛋白表达升高。提示pgdh基因可能是通过p53、p21通路发挥作用。
肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤生存和侵袭转移的前提条件，pgdh基因能够抑制癌细胞的增殖，可以降低癌细胞的恶性程度，通过对其具体作用机制的深入研究，pgdh基因有望作为一种基因药物应用于临床。
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