血液病是原发于造血系统，或影响造血系统伴发血液异常改变，以血液、造血器官以及出、凝血机制的病理变化为其主要表现特征的各种疾病。此类患者多伴有原发或继发的血小板减少或功能缺陷，因血小板原因所致的出血也是血液病较为常见的并发症，其严重危害血液病患者的健康甚至生命。血小板输注是目前国内外防治血液病患者出血的不可替代的重要治疗手段，用于改善血液病患者的出血症状及降低出血病死率。但实际临床工作中，并非每例血小板输注都能取得满意的疗效，时有血小板无效输注发生[1]。血小板输注疗效的影响因素无外乎免疫因素和非免疫因素两大类，血小板抗体是目前引发血小板输注无效的最重要的免疫因素。本研究对158例血液病[白血病、再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）、特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocyopenic purpum，ITP）、骨髓异常增生综合征（mylodysplastic syndrome，MDS）]患者血小板输注前血小板抗体检测、血小板输注疗效评价，对两者之间的关联，以及血小板抗体的相关影响因素进行统计学分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2011年8月～2012年12月贵州省人民医院收治的158例血液科输注血小板的白血病、AA、ITP、MDS四种血液病患者。其中男性82例，平均年龄40.5岁，女性76例，平均年龄43.2岁。
1.2 研究方法
1.2.1 标本采集及相关临床资料收集
1.2.1.1 血液标本的采集 用EDTA-K2作抗凝的采血管于血小板输注前和输注后24 h采集患者静脉血；计数血小板后将输注血小板前静脉血离心，取血浆保存于-20℃冰箱中待检（血小板抗体）。
1.2.1.2 病例相关资料的采集 收集患者的相关临床信息（姓名、性别、年龄、临床诊断、体重等）。
1.3 实验仪器及试剂
1.3.1 主要仪器：XT-1800全自动血细胞分析仪（性能评价符合要求）；TD-3B型血型血清学多用离心机。
1.3.2 实验试剂包括血小板抗体：血小板抗体检测试剂盒（固相凝集法）、指示红细胞（长春博讯生物技术有限责任公司，20120201）；血小板计数试剂：为原装进口试剂。
1.4 血小板悬液的制备和品种
由贵州省血液中心提供。单采血小板即机采血小板，是用细胞分离机单采技术，从单个供血者循环液中采集到超过一个成人治疗量所需的的血小板数量，每袋含血小板约2.5×1011/L；浓缩血小板采用全血分离制备而成，400 ml全血可制备2 U浓缩血小板，2 U约含血小板 4×1010/L，1个治疗量（8～12 U）浓缩血小板需要由多个献血者血液制备。
1.5 血小板抗体检测（ 固相凝集法）
1.5.1 检测步骤
①制备血小板悬液：将商品化的冻干血小板稀释后直接使用。
②根据检测量取出反应条，标记患者、阴性及阳性对照孔。并向每孔加入上述血小板悬液一滴（50 μl），轻摇反应板约10 min。
③用平板离心机将反应板以50×g离心5 min，使血小板固定在反应板底部。
④倒出反应板内的液体，用滴管滴加洗涤工作液清洗3次，洗涤过程中轻摇微孔板，最后1次洗涤后将反应板倒置于吸水纸上吸干残余液体。
⑤立即向每个反应孔中加入2滴（100 μl）低离子强度溶液，并分别向相应孔中加入1滴（50 μl）患者样本、阳性对照及阴性对照。低离子强度溶液将由紫色变为天蓝或青绿色，如仍为紫色则说明可能漏加样本。
⑥将反应孔用封口胶封好，轻摇混匀后置于湿盒中37℃水浴孵育30 min。
⑦取出已孵育完毕的反应板，弃去封口胶。按步骤4洗涤反应板5次。
⑧立即加入1滴（50 μl）抗人IgG及1滴（50 μl）指示红细胞，轻轻振荡混匀。
⑨将反应板以200×g离心5 min。
⑩将检测孔与对照孔的结果进行比较，判读并记录检测结果。
1.5.2 结果解释
①阳性结果：指示红细胞平铺在反应孔底部表面；若指示红细胞只结合到部分孔底，并且结合的区域比阴性对照大为弱阳性，表明患者血清或血浆中含有血小板抗体。
②阴性结果：指示红细胞在反应孔底部中央形成红细胞聚集，表明患者血清或血浆中不含血小板抗体。
1.6 血小板输注及输注后疗效评价
1.6.1 血小板输注
输注前复查供者和患者ABO血型及Rh血型，并做ABO血型系统交叉配血试验；成人和儿童分别每次输注血小板的量一般为10 U（即1个治疗量）和2 U/kg；取血后30 min内开始输注，并以患者能耐受的程度尽快输注。
1.6.2 输注有效判断标准
本研究根据患者血小板输注后24 h 血小板回收率（PPR），结合临床出血症状改善情况进行血小板疗效判断，对预防性和治疗性血小板输注分别进行判断。
1.6.2.1 PPR计算：PPR=（输注后血小板计数-输注前血小板计数）×全血容量/输注血小板总的数目×2/3，其中全血容量（L）=体重（kg）×0.07[2]。
1.6.2.2 输注有效的诊断标准 ①临床止血效果评价：无新的出血点或瘀斑，出血症状明显改善为有效；②输注血小板20～24 h PPR>20% 为有效[3]。
治疗性血小板输注主要根据临床止血效果和PPR值判断血小板输注疗效：PPR>20%且临床出血明显改善的为明显有效；PPR<20%但临床出血明显改善为有效；PPR<20%且临床出血无改善的为无效。
预防性血小板输注则主要根据PPR值判断血小板输注疗效：PPR>20%为有效。
1.7统计学处理
数据用SPSS 19.0统计软件分析，分别用卡方检验、卡方分割法对数据进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 158例患者血小板抗体总阳性率，血小板输注总有效率情况
158例血液病（白血病、AA、ITP、MDS）患者血小板抗体总阳性率为17.72%（28/158），血小板输注总有效率为53.16%（84/158）。
2.2血小板抗体与血小板输注疗效的关系
血小板输注有效组84例抗体阳性率为5.95%（5/84）远低于输注无效组，无效组阳性率为31.08%（23/74）（P<0.01）；血小板抗体与血小板输注疗效明显相关（χ2=17.038，R=0.317，P<0.01）。
2.3 不同疾病组的血小板抗体阳性率的比较
ITP组抗体阳性率最高（34.38%），白血病组最低（8.86%）；与白血病组比较，差异有统计学意义（P<0.01），其余两两比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
2.4 不同性别组的血小板抗体阳性率比较
男性阳性率为12.20%（10/82），女性阳性率为23.68%（18/76），差异无统计学意义（χ2=3.571，P>0.05）。
2.5 不同输注次数组血小板抗体阳性率的比较
1次输注组、2次输注组、3次及以上次数输注组阳性率分别为4.11%（3/73）、25.81%（8/31）、31.48%（17/54）（P<0.01）（表2），且随着输注次数增多血小板抗体阳性率增高。
2.6 不同血小板种类组的血小板抗体阳性率的比较
单采组阳性率为8.77%（23/101），低于浓缩组的22.77%（5/57）（χ2=4.898，P<0.05）。
3 讨论
随着人们对血液病的深入了解及成分输血的发展，在针对血液病出血的治疗中，血小板的输注疗效越来越受到重视，血小板输注无效的原因越来越值得探讨，血小板抗体作为最重要的免疫因素也备受关注。本研究通过对血液病输血小板患者血小板抗体的研究，探讨其与血小板输注疗效的关联，并分析血小板抗体产生的相关影响因素。
3.1 血小板抗体在血小板输注疗效中的作用
血小板抗体是影响血小板输注疗效的重要影响因素之一，这一点目前已毋庸置疑。本研究显示，血小板输注无效组血小板抗体阳性率远高于输注有效组，且血小板抗体和血小板输注疗效间具有良好的相关性，提示血小板抗体与血小板输注疗效密切相关，血小板抗体是直接影响血小板输注效果的重要免疫因素之一。这主要是因为血小板的表面存在十分复杂的血型抗原，除了ABO血型抗原外，还存在HLA和血小板特异性抗原（HPA），它们在免疫刺激后都可产生相应的同种抗体，发生抗原抗体反应继而引发血小板输注无效，但其产生的频率差异较大。目前因血小板输注前大多进行ABO系统的交叉配血，故ABO系统抗体引发的血小板输注无效极少见，而引发同种免疫反应所致血小板输注无效的主要是HLA和HPA抗体，HLA抗体能够使血小板输注后血小板的计数上升值偏低[4]；而HPA不管是单独出现还是和HLA抗体一起出现，都具有临床意义[5]，在输注与患者非相容的血小板后，都可以观察到血小板的计数上升很低或出现输注后紫癜。其中，HLA抗体产生的频率更高，Murphy MF等报道由HLA抗体引起的血小板输注无效占80%以上[6]，而日本学者报道90%左右的血小板输注无效主要是由HLA抗体引起的[7]，HLA抗原作为机体组织、细胞所共有的抗原系统，不仅存在于血小板的表面，也存在于白细胞中，受血者接受刺激的概率更高；而HPA由于在同一区域和（或）同一种族之间存在着高频率的HPA等位基因，在受血者与供血者出现不相合的可能性相对较小，故而产生的概率也相应较小[8]。
3.2 不同病因与血小板抗体产生有一定的相关性
不同病因的血液病患者中，ITP组抗体阳性率最高，主要是因为ITP患者本身的发病机制，此类患者体内多存在血小板抗体，故其血小板抗体阳性检出率最高。而本研究中，白血病组患者血小板抗体阳性率最低，可能是因为本研究中选择的白血病患者输注血小板时多处于化疗期间，此时患者处于一种免疫抑制的状态，故血小板抗体阳性率较另几种血液病患者偏低。
本研究发现，随着输注次数增加，血小板抗体阳性率逐渐增高。目前国内输注血小板大多仅作ABO系统的交叉配型，并未做到HLA和HPA配型输注，因此血小板输注除特殊要求做HLA及HPA配型外，基本上都为HLA和HPA随机输注状态。如此输注血小板，受血者和供血者HLA和HPA不匹配的概率很高，受血者血清中可产生相应的血小板同种抗体，当再次输入血小板后，会产生血小板抗原抗体的免疫反应，导致血小板输注无效。输注次数越多，产生血小板抗体的概率就越高，据文献报道可达31%～63%[9]。而白血病、AA、ITP及MDS患者因自身疾病原因，血小板原发性或继发性降低，多需反复多次输注血小板，势必增高血小板抗体产生的概率，从而降低血小板输注疗效。
本研究结果还显示，单采组血小板输注疗效明显优于浓缩组，这主要是因为前者相对于后者而言，采自单一供血者，其抗原成分相对单一，且其分离技术更为先进，血小板分离纯度较高，其他血液成分尤其是白细胞含量较低，因而血小板抗体尤其是HLA抗体产生的频率大大减少。本研究未提示血小板抗体的产生与患者性别相关。
综上所述，血小板抗体的产生是影响血小板输注疗效的原因之一，而血小板的产生与患者的病因、输注血小板的次数及输注的血小板种类有关，因此我们在制订血液病患者血小板输注方案时，应尽量明确患者病因，查明血小板减少或功能异常的原因，并针对患者可能导致血小板抗体产生的因素进行分析，尽可能一一进行排除，以降低血小板抗体的产生，提高血小板输注疗效。①应严格把握输血适应证，杜绝不必要的输注，减少受血者接触同种异体抗原的机率。②针对不同的病因及患者具体情况制订不同的血小板输注方案，如白血病组和AA组患者可考虑增加血小板的输入量来提高血小板输注的效果；ITP患者输注血小板应更严格掌握指征，并在输注前静脉注射免疫球蛋白中和已存在的自身抗体，以增加输入血小板的寿命。③血液病患者因病情大多需要多次输注血小板，为易产生血小板抗体的人群，应尽量为其提供单采血小板，并将血小板抗体筛选作为此类患者血小板输注前的常规检查，若有同种抗体存在，则需挑选HLA，HPA相合的供者血小板为其配血，以降低或避免因血小板抗体所致的血小板输注无效。④血小板输注完毕后应对血小板输注疗效及时进行正确评价，及时发现问题、分析病因、采取对策，为下一步患者的治疗提供数据支持。
[参考文献]
[1] 刘景汉，林武存.临床输血指南[M].北京：人民军医出版社，1998：15-17.
[2] 胡丽华.检验与临床诊断分析[M].北京：人民军医出版社，2009：60-62.
[3] 马金平，杨和军.血小板输注无效的病因和对策[J].中国输血杂志，2012，25（9）：906-911.
.Transfusion，2001， 41（6）：771-774.
[5] 周君纯，吴兆勇，龙亚银，等.多次输血的血液病患者血小板抗体与血小板输注效果的关系分析[J].广东医学院学报， 2009，27（4）：413-414.
[6] 张献清，穆士杰，夏爱军，等.血小板输注无效患者的供者筛选策略及临床研究[J].临床输血与检验，2009，11（2）：126-128.
[7] 李志强，乐嘉宜，刘建军，等.人类血小板抗原1-16基因与血小板输注无效风险研究[J].中国输血杂志，2009，22（5）：346-349.
[8] 张伟东，肖露露，叶欣，等.随机血小板输注无效患者的HLA抗体分析[J].广东医学，2004，25（7）：799-800.
[9] 张工梁.白细胞血型与输血反应[J].中国输血杂志，2005，1（3）：144.
