第1篇：体内药物分析中电化学传感技术的应用
20世纪80年代初，治疗药物监测（开始在国内医院开展，其目的是制定合理的给药方案，指导临床用药个体化。TDM是在现代药动学指导下，应用灵敏快速的分析技术手段，检测患者血液或其他体液的药物浓度，主要集中对以下几种药物监测：抗癫痫药物、免疫抑制剂、抗肿瘤药物、强心苷类及茶碱类等。体内药物分析是TDM中极其重要的环节，分析结果的正确与否关系到TDM的成败。由于生物样品量少、不易重复获得，样品中的干扰成分较多，对分析方法要求高及测定目标与数据处理复杂，体内药物分析对检测技术的要求越来越高，本文对近年来电化学传感技术涉及体内药物分析的应用进行综述，以期为TDM技术的发展提供参考。
1电化学传感技术在体内药物分析中的优势地位
体内药物分析是分析机体内药物及其代谢物浓度，了解药物在体内数量和质量的变化，获得药物代谢动力学的各种参数和转变，以及代谢的方式、途径等信息，用于药物研究和临床合理应用等。用于体内药物分析的方法很多，国内各医院TDM所采用的方法主要有气相色谱法（GC)、高效液相色谱法、液质联用法（LC-MS)、酶免疫法（EIA)、荧光偏振免疫法（FPIA)等，每种方法都有各自的特点。免疫测定法的试剂盒简单、方便且快速，但在药物种类上存在局限性，试剂盒中使用的酶、抗体等价格较昂贵且储存条件要求较高、有效期较短。GC的最大限制因素是只适用于相对分子质量较低的挥发性物质。而HPLC可用于极性与非极性分子的分离，灵敏度高、分离度好，在临床实验室中应用较为广泛，然而寻找合适的内标物质及样品处理复杂是其面临的最大问题。
近年来，电化学分析技术与生物化学、材料科学、生物医学等学科的交叉融合，带动了电化学传感技术在生命科学领域的蓬勃发展。电化学传感器具有仪器设备简单、特异性好、灵敏度高、经济便捷等特点，目前已成为特定基因序列定性定量分析、体内药物分析、环境检测、食品安全等领域的研究热点，具有广阔的应用前景。作为一门新兴崛起的技术，电化学传感技术在体内药物分析的应用越来越广泛。
2电化学传感技术用于体内药物分析的主要方法
根据检测原理的不同，用于体内药物分析的电化学传感技术可分为直接检测法、基于纳米材料的检测法及基于核酸适配体的检测法。
2.1直接检测法该方法主要利用药物自身在电极界面上的电化学行为进行分析，即在一定的电压下，具有电活性的药物分子在电极界面发生氧化还原反应，电子传递产生电流，通过检测电流值的变化获得检测体系中耙分子的浓度。在进行体内药物分析的过程中，由于体内药物与大量内源性基质共存，耙分子自身电活性较弱及生物样品中其他物质的干扰作用，导致直接检测法存在灵敏度低且易受干扰的缺陷，非分离后的检测方法可能存在测定结果的准确性问题。因此，样品的前处理技术是直接检测手段的重要支撑。
2.2基于纳米材料的检测法纳米材料，包括新型纳米生物材料和纳米复合材料，具有优异的物理、化学、电催化等性能，同时具有量子尺寸效应和表面效应，具有较强的吸附能力、良好的定向能力及生物兼容性，能固定更多生物分子并长久保持其生物活性，因此可以提高传感器中活性生物分子的固载量，使得基于纳米材料的电化学传感器呈现出体积更小、速度更快、灵敏度更高和更可靠等优异性能。采用纳米材料与电化学传感器相结合的方法能更有效地抵抗其他物质的干扰，在保证高灵敏度的同时提高选择性。
其作用主要体现在：加速电子传递、电催化作用、固定生物分子、标记生物分子及作为反应物等。例如，柔红霉素（daunorubicin，DNR)的电活性较弱，直接测定其在界面上电化学行为的效果并不理想。Jang课题组9应用碳纳米管（CNT)显着提高DNR在玻碳电极上的电子传递速率，用于DNR的分离与检测，结果表明该方法简单快速、成本低，具有较高的灵敏度和特异性。根据该原理构建的电化学传感器，还可高灵敏地检测其他蒽环类药物。
多巴胺（dopamine,DA)是中枢神经系统中最重要的儿茶酚胺类神经递质之一，当大脑中DA浓度异常时，可能会导致严重的疾病，如帕金森综合征等；当血液透析过程中DA浓度偏低时，可能会导致低血压。监测生物样品中DA浓度对指导临床调整给药剂量具有重大意义。电化学传感技术结合石墨烯用于检测DA浓度已被报道[10-11]，Wu课题组[11]利用带负电荷的卟啉化功能型石墨烯能与带正电荷的DA形成n-n共鈪体系，石墨烯的堆叠作用加快DA与界面之间的电子传递，且可以弱化抗坏血酸(AA)、尿酸（UA)氧化时的电子转移，采用差分脉冲伏安法（DPV)进行检测。与HPLC-MS、毛细管电泳等高成本且需特殊设备的方法比较，该方法操作更便捷，同时也能抗AA与UA的干扰，具有较好的特异性。
2.3基于核酸适配体的检测法核酸适配体是指人工合成的一小段经体外筛选获得的寡核苷酸片段，能与配体特异性结合，当适配体与目标物特异性结合时，适配体的构型会发生变化。
核酸适配体可作为反应开关或信号标志物，用于电化学传感器的构建。利用核酸适配体能高特异性、高选择性结合耙分子的特点，将其作为探针固定在界面上，用于捕获目标物质，构建基于核酸适配体的电化学生物传感器。目标小分子与核酸适配体的结合部位主要是碱基、核糖和磷酸骨架。目前，核酸适配体主要有DNA和RNA小片段。
适配体许多抗病毒、抗肿瘤药物的作用耙点为DNA，通过与病毒或肿瘤细胞DNA结合，破坏其DNA结构，影响基因调控或表达而发挥作用。基于药物小分子与DNA相互作用构建的电化学生物传感器已成为研究热点。DNA双螺旋结构中平行堆积的碱基、阴离子磷酸骨架及双螺旋结构形成的大沟槽与小沟槽均可作为药物分子的识别位点，主要作用方式包括：（1)具有电活性的药物分子嵌入DNA双螺旋的碱基之间；（2)药物与DNA带负电荷的核糖或磷酸骨架之间产生的静电作用；(3)药物与DNA的沟槽相互作用。
醋酸亮丙瑞林（leuprolide，LPR)是促性腺激素释放激素（GnRH)类似物，临床主要用于前列腺癌及子宫内膜异位症。LPR的研究及药理学研究均需要灵敏快速的分析手段，目前主要采用色谱技术进行分析，如HPLC和LC-MS。已被报道的LC-MS方法准确度高，但存在样品制备回收率不高、检测耗时长等缺陷。Dogan-Topal课题组[12]根据LPR能与双链鱼精子DNA结合的特性，构建一种新型电化学传感器，采用溶出伏安法检测鸟嘌昤氧化峰电流的变化，获得LPR的浓度。与液相色谱法比较，其优点是无需寻找内标物，具有特异性好、灵敏度高和检测快速准确等特点。
可卡因（cocaine),为局部麻醉药或血管收缩剂，是强烈的天然中枢兴奋剂，对消化系统、免疫系统、心血管系统和泌尿生殖系统都有损伤作用。可卡因的检测方法主要有HPLC、LC-MS及等，这些方法主要存在检测过程较复杂、仪器较昂贵、耗时长等缺点。Rousham课题组[13]开发出一种具有高灵敏度和高选择性的电化学适配体传感器，用于检测血清中的可卡因，即在修饰有多壁碳纳米管/离子液体/壳聚糖（MWCNTs/IL/Chit)的玻碳电极上偶联末端标记金纳米粒子（AuNPs)的DNA适配体，当目标物中含有可卡因时，适配体与可卡因特异性结合，折叠形成复合物，AuNPs靠近电极界面，使得铁氰电对氧化还原反应过程中的电子无法传递，电流减小，电流大小与检测体系中的可卡因浓度呈负相关。与其他方法比较，该方法简单、操作便捷、特异性好且灵敏度高。
适配体基于RNA适配体构建电化学传感器检测耙分子，利用RNA分子功能的通用性及其在体外能特异性筛选高亲和性配体的功能，当检测物质中含有RNA适配体的配体时，RNA能识别并结合配体，形成三维高次结构，通过结构的变化指示是否存在耙分子。根据耙分子结构的不同，可设计出不同序列的RNA适配体用于检测。
茶碱（theophyline)，有效血药浓度的安全范围窄，超过20pg*mL-1即引起毒性反应，严重时可引起永久性神经损伤，甚至危及生命。由于茶碱口服吸收不稳定，受机体因素和其他药物代谢的影响，个体差异大，血药浓度较难控制，需定期进行血药浓度测定。目前国内医院开展的血清或血浆中茶碱浓度监测主要采用GC、HPLC和免疫分析技术，这几种方法均能有效抵抗咖啡因和可可碱的干扰，特异性较高，但检测结果易受茶碱氧化酶稳定性的影响。课题组构建的基于RNA适配体的无标记型电化学传感器，可用于茶碱血药浓度监测。
其原理是在平面金电极上固定末端连接二茂铁的具有特定序列的RNA探针（Fc-RNA)，探针能识别并结合茶碱，由原先的伸展状态折叠成三维结构，末端连接的二茂铁靠近界面，电势发生改变，从而指示检测体系中茶碱浓度的变化。该方法的优点是特异性好，灵敏度高，成本低。但是，由于RNA可被空气中的RNA核酶降解，基于RNA适配体的电化学传感器对检测环境要求较高，导致应用范围受到限制。
3电化学传感器在体内药物分析的应用
电化学传感技术作为当前国内外的研究热点之—，已用于生物样品中多种药物的检测。笔者对这类型的电化学传感器进行简单归纳，发现目前该技术主要用于体内抗生素、抗肿瘤药物、抗癫痫药物等药物浓度分析。
电化学传感技术已用于多种体内药物的分析，覆盖范围很广，且部分传感器可同时检测多个药物，这样的分析手段正是临床上所需要的。
比较各个传感器的分析特点，可见：（1)直接利用药物自身电活性进行检测的电化学传感器所占比例不高，而利用功能化纳米材料进行药物分析是目前的研究热点；（2)涉及的基质主要集中在血清和尿液，血浆较少，可能是因为血浆中的高离子状态对传感器存在一定的影响；（3)电化学传感器具有灵敏度高、检测限低及选择性好等优越性。
4结语
电化学传感技术在体内药物分析中具有其他方法所不具备的灵敏度高、检测限低、操作简便等优点，但一些传感器还存在某些技术问题，如：血药浓度监测中实际样品存在较多的干扰因素（内源性基质及并用药物的干扰）多通道检测的方法条件还需进一步优化；检测标准的建立等。随着研究的不断深入，新的检测方法、纳米材料、生物分子的应用使得电化学技术在体内药物分析领域取得了一定的进展，并促进了电化学传感技术的发展。作为前沿技术，电化学传感技术在体内药物分析中具有潜在的应用价值，尤其是新型纳米材料的出现，将会极大地推动电化学传感技术在体内药物分析中的发展。
作者：李红娜，林小凤，林雪玉，陈锦珊（中国人民解放军第一七五医院/厦门大学附属东南医院药学科，福建漳州363000）
第2篇：体内药物分析中免疫分析法的应用
自1954年Yallo与Berom是出放射性标记免疫分析法以来，免疫分析己成为生物化学、临床医学等领域中一个非常重要的方法。免疫分析法不仅可用于测定蛋白质、酶等大分子物质，而且还广泛用于测定小分子量的药物，特别适用于那些色谱法难以分些色谱法难以分析的药物，该法已成为体内药物分析中一种必不可少的基本检测技术。
1免疫分析法的基本原理
免疫分析法的原理是被分析药物（Ag）和标记后的该药物（Ag#)与该药物的特异性抗体（Ab)竞争有限的结合部位，未标记药物（Ag）的浓度决定于标记药物（Ag)与特异性抗体（Ab)结合的量。标记物可能是放射性同位素、酶、荧光物质或化学发光物质，依据标记物的属性，测定其放射性、酶反应后的UV吸收和荧光强度。
2免疫分析法的分类及应用
2.1放射免疫分析（adommumasayRA)放射免疫分析法是最早建立的一种免疫分析法，是放射性同位素测定法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。该法具有灵敏度高、特异性强、标记物容易制备以及放射性强度容易检测等优点，特别适合复杂样品中微量或痕量物质的分析，在体内药物分析中占有独特的地位。随着单克隆抗体的出现及固相化技术的巩固和发展，出现了以标记过量抗体与被测抗原或被测物的非竞争结合为基础的免疫放射分析（R2MA)是免疫分析技术的重大进展宋朝锦等使用放射免疫分析方法检测13例经过吗啡单克隆抗体试纸尿液筛选阳性的吸毒嫌疑人的尿液、血液和唾液，灵敏度为16邱。mL1，r=09998回收率为93~97%，结果符合放射免疫分析行业要求。暨南大学第五附属医院W采用放射免疫分析法监测了229例地高辛病人的血药浓度，结果表明，地高辛吸收个体差异大，治疗指数低，安全范围窄。放射免疫技术监测地高辛的血药浓度具有特异性强，灵敏度高，稳定性好的特点，且操作方便简单，尤其适应于基层医疗单位开展地高辛血药浓度的监测工作。用放射免疫分析法对左甲状腺素钠2种配方片剂人体生物利用度进行比较所得药动学参数与国内外文献报道基本一致。
放射免疫分析法优点突出：低本底和高灵敏度；不受周围环境和样本内干扰物质的影响；与小分子量同位素的结合不影响免疫反应；完善的放射测量体系等。但其缺点也是显而易见的：同位素的半衰期使货架期短，试剂盒不宜储存；结合于抗原或抗体分子上的125I分子有限，过高会引起结合物的自照射分解；试剂的使用，购买以及废物处理等均引起一定的辐射安全问题。
2.2酶免疫分析法（enzynemmunoasyEA)1966年和Uil首先将酶偶联于抗原和抗体，1974年Svco首先报道了均相酶测免疫分析（，开创了酶免疫分析的临床应用〔7〕酶免疫分析的基本原理是在抗体或抗原分子上连接酶分子，进行免疫反应，免疫复合物上的酶将特定的底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，由颜色的深浅确定待测物的量，其催化底物可与核素一样起到信息放大作用，具有很高的灵敏度，检测下限可达到n甚至pg水平，有效期大大超过了标记物，而且能减少放射性废物2陈洪渊〔910〕用邻苯二胺（(：)PD)-H2(：)2-HRP酶联免疫示差脉冲伏安法测定人血清风湿因子抗体和AFP及33’，55’-四甲基联苯胺（TMB)-^〇2-HRP伏安酶联免疫分析法测定人血清免疫球蛋白E(gE)。郭绍丽应用克隆酶免疫分析技术测定地高辛浓度，指导临床科学用药。张书圣提出了对氨基酚（PAP)-H(棘根过氧化物酶（HRP)伏安酶联免疫分析新体系，并成功地应用于人血清中总甲状腺素的测定，检测下限比邻苯二胺显色光度法低5倍.郭大智用自制的试剂建立了检测睾酮、孕酮、雌酮和雌三醇的双抗体酶免疫分析法，初测人和动物的血、奶、尿样品表明所建立的4种测定方法可分别用于人和动物体液中睾酮、孕酮、雌酮和雌三醇的定量检测。他克莫司是一种新的大环内酷类抗生素，具有极强的免疫抑制作用，但其毒副作用也不可忽视。它的药物动力学受多种因素影响，显示广泛的变异性。Wary等将HPC与EL1SA联用，评估以前SePiakELLSA法测定血浆中他克莫司母体药物的专属性。对正常肝功能病人及肾功能变化病人，两法测定的他克莫司血浆谷浓度（或全血谷浓度）相近，表明在这些病人血中与分析方法起交叉反应的代谢物蓄积小。
酶免疫分析法曾被认为可以完全取代放射免疫分析。但是，这种依靠比色法或偏振光法的检测技术所受的干扰因素太多，其灵敏度和稳定性未能高于放射免疫分析。目前发展的最新技术是将酶免疫分析与荧光技术或化学发光技术结合，形成荧光酶免疫分析及化学发光酶免疫分析，从而大大提高灵敏度，增大检测范围。如英国Amesham公司的免疫分析试剂盒和美国DPC公司的mmulite免疫分析试剂盒都是应用增强发光酶免疫分析。
2.3化学发光免疫分析（化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器光量子产率。免疫反应系统是将标记物质直接标记在抗原或抗体上，经过特异性反应后，形成抗原一抗体复合物。然后采用相应标记物的检测方法进行检测。
化学发光免疫分析法根据其标记物的不同可分为三大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
龙宪和选用美国德普公司MMULITEI型酶放大化学发光分析法与RA进行了对比分析，并对患者血清样品若干批次的AFP进行了检测，发现酶放大化学发光分析法灵敏、夬速.简便.测定范围宽.自动化程度高.比手工操作的RA法系统误差小.批内和批间变异系数小.回收率好，因此，发光法能更好地为临床诊断、治疗服务。修雁用化学发光免疫分析法和放射免疫分析法同时测定血清中CA19-9的含量并比较实验结果，发现化学发光反应为完全自动，排除了手工加样中人为造成的误差，且无需做标准曲线，既操作方便，又避免了试剂浪费。
化学发光仪价格昂贵，一般为60万元一台，其他的分析项目试剂成本更高。但化学发光免疫分析法所需时间短、灵敏度高、线性范围宽、对环境无污染，特别是近十年来，各种CIEA自动化分析仪的相继问世，使得化学发光免疫分析法在临床检测方面具有广阔的发展前景。
24荧光免疫分析（fU〇ecencemmunoassayFA)荧光免疫分析是以荧光物质作为标记物与待测药物结合，所形成的一蓝光将继续经过一个液相水晶偏振光，成为单一方向的蓝色偏振光，经荧光标记的药物，被这一单向蓝色偏振光照射后，反射出绿色的偏振荧光。这种荧光偏振程度的大小与荧光物质分子的转速成反比。荧光标记的小分子抗原在溶液中旋转速度快，荧光偏振光强度小。当荧光标记的小分子抗原与其相应抗体结合后，所形成的大分子在溶液中旋转速度变慢，荧光偏振光强度增大。依据荧光标记抗原和其抗原抗体结合物之间荧光偏振程度的差异，用竞争性方法直接测量溶液中小分子的含量临床用荧光偏振免疫分析对血清中的倍他乐克阿米卡星克拉霉素非洛地平环孢素A26〕卡马西平等多种药物进行检测。如在研究阿米卡星（AMK)在呼吸系统感染患者中的临床药动学.体内抗生素后效应及两者间的关系时，AMK在7例呼吸系统感染患者体内的消除半衰期.清除率及药一时曲线（AUC)下面积分别和对6株受试菌具有明显的体内PAE给药后125h体内累加PAE值最大为32h平均为与PAE呈良好的线性关系。
此外，荧光偏振免疫分析法在毒品检验方面也得到了应用。Kaeie等〔28〕测定了尿液中的安菲太明及其代谢物的含量，安菲太明的检出限为5〇igL1测定结果与GCMS方法基本一致。
3免疫分析法和色谱法的比较
免疫分析法与色谱法相比，在快速和简单操作方面具有优势，适合于自动化，因而它适合于常规药物监测；免疫分析法特别适用于色谱法难以分析的药物，如蛋白质、多肽等分子量大的药物，又如地高辛、环孢素和氨基糖苷类呈强极性，缺乏强的UV吸收，使用色谱法测定较为繁琐的药物；免疫分析法一般可直接分析小样品量（50/iL)的生物体液，样品不需制备，而GC或HPIC至少需〇5~1mL样品量，分析前还需纯化样品。现己有自动化免疫分析仪出售，此设备集加样、测定和数据处理于一身，减轻了工作人员的劳动强度，缩短了分析流程，提高了实验结果的精确度和准确性。另外，许多药物试剂盒也相应上市，大大拓宽了免疫分析法的使用范围。
但是，免疫分析法也有其不足之处。首先，免疫分析法的灵敏度和选择性不及色谱技术，药物的抗体可能与其结构相近的代谢产物、内源性物质等有交叉反应，使结果偏高。其次，免疫分析法的适用范围在很大程度上受到试剂盒种类的限制。到目前为止，可用的商品免疫分析试剂盒仅有以下几类药：抗癫痫药、氨基糖苷类、心血管类药和一些单个药物，如茶碱、甲氨蝶呤。这意味着若选用免疫分析法同时测定几个药物时，必需分别单独测定每一个药物，而且多数试剂盒需从国外购买，所以使用免疫分析法的代价较高。而与之相比，色谱法可同时测定样品中的几个药物，且色谱法对新化合物更易快速设计出新的测定方法。再者，由于需在实验室标记药物并制备药物的特异性抗体，免疫分析法难度要高于色谱法。
4结语
从药物生产到临床应用，药物质量的正确评价尺度是有效性和安全性，及根据药物的体内表现作出评价。如果没有体内药物分析提供数据和有关信息，进行临床药学研究是不可想象的。而免疫分析法快速、有合适的灵敏度和专一性，很适合于临床常规用药监测，是体内药物分析不可或缺的有力工具之一。
目前，多种免疫分析方法并存，相互竞争，互为补充。从总体上看，非放免分析相对RA更具有综合优势和潜力，发展速度更快。其中酶免疫分析和荧光免疫分析是非放免分析的两大主流，但从发展速度和市场应用推广来看，化学发光免疫分析更具有竞争力。不管怎样，没有一种免疫分析技术是完美无缺的，各种技术还需要不断发展和完善，因此人们还在不断研究，以开发出更新更理想的免疫分析技术。
作者：毛茅，钱晓萍（江苏省苏州市立医院北区苏州215008)
