【摘要】 目的 探讨tnfα基因308g>a和lta基因252a>g多态性对pd发病潜在影响。方法 利用pyrosequencing技术对114例我国汉族散发性帕金森病(parkinson’s disease，pd)患者和133例正常对照进行tnfα308g>a和lta 252a>g突变位点分析。结果 病例组tnfα308突变型(g/a+a/a)和野生型(g/g)阳性率与对照组相等，差异无统计学意义(χ2=3.46，p=0.062 7)。病例组lta 252突变型(a/g+g/g)阳性率稍高于对照组，差异无统计学意义(χ2=0.28，p=0.599 9)。单倍体型分析表明，tnfα308杂合突变型(g/a)患者lta 252位点均为突变型(a/g或g/g)。结论 tnfα308和lta 252位点可能不是我国散发性pd发病易感因素。
【关键词】 帕金森病; 肿瘤坏死因子α; 淋巴毒素; 多态性，单核苷酸
tumor necrosis factor alpha (tnfα) rs1800629 and lymphotoxin alpha (lta) rs909253 might not be potential susceptibility locus leading to chinese sporadic parkinson's disease du weidong1, tang xianfa1, tang huayang1, xu hongsheng2, sun zhongwu3, hao jiahu4, chen gang1, zhang xuejun1. 1.key lab of gene resource utilization for severe hereditary diseases of ministry of education and key lab of genome research of anhui province, anhui medical university, hefei 230032, china; 2.department of neurosurgery, the centre hospital of xuzhou, xuzhou 221009, china; 3.department of neurology, first affiliated hospital of anhui medical university, hefei 230022, china; 4.department of maternal and child health, school of public health, anhui medical university, hefei 230032, china
【abstract】 objective to inquire into the relevance of tumor necrosis factor alpha gene 308g>a and lymphotoxin alpha gene 252a>g to chinese sporadic parkinson’s disease (pd) susceptibility. methods 114 cases of sporadic pd patients and 133 ageand sexmatched controls were investigated with pyrosequencing technique. results comparing the frequencies of wild type (g/g) and mutation types (g/a + a/a) of tnfα308 between the cases and the controls revealed a minimal bordering but nonsignificant difference (χ2=3.46，p=0.062 7). genotype frequency of lta 252 (g/g) in the pd cases was lower than that of the controls (0.105 3 vs. 0.135 3). however, there was no significant difference between the cases and the controls. haplotype analysis showed that heterozygous (g/a) mutation of tnfα308 was always associated with mutated lta 252 a/g or g/g. conclusions tnfα308 g>a and lta 252a>g might not be potential susceptibility locus leading to chinese sporadic parkinson’s disease.
【key words】 parkinson disease; tumor necrosis factoralpha; lymphotoxin; polymorphism, single nucleotide
原发性帕金森病(primary parkinson’s disease，pd)是一种中老年常见的慢性进展性神经变性疾病，其发生可能是遗传和环境多因素共同作用的结果[1～3]。Www.133229.cOm近几年来发现小胶质细胞异常激活引起的炎症反应可能在许多神经变性疾病中发挥重要作用[4，5]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,tnf)分为肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,tnfα)和淋巴毒素(lymphotoxin alpha,lta/tnfβ)，前者由单核/巨噬细胞产生，后者由活化的t细胞产生。肿瘤坏死因子α基因位于第6号染色体短臂mhc iii类区域，该基因编码的tnfα是一种多效性的细胞因子。在tnfα启动区308位点(rs1800629)含有一个单碱基变异(g→a)取代，野生型和突变型基因分别命名为tnf1 和tnf2，tnf2基因可使tnfα转录水平升高6～7倍，进而影响其生物学功能[6]。tnfα作为免疫调节剂和炎性因子，参与自身免疫性、感染免疫性、内皮损伤、氧化应激和动脉粥样硬化等病理过程[7]。lta基因位于第6条染色体短臂上，处于hlab和hlac之间，该基因编码的lta有着与tnfα相似的生物学活性。其中lta第i内含子+252位点(rs909253)多态性可影响lta的转录水平[8]。研究表明，tnf和lta基因多态现象存在单倍型的连锁不平衡性，而不是二者多态现象的孤立[9]，现已发现tnfα308g>a和lta 252a>g多态性与弥漫性大b细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤和t细胞淋巴瘤存在遗传易感性[10]。
基因诊断技术如dna序列分析，限制性片段长度多态性(rflp)分析，pcr单链构象多态性(pcrsscp)分析，基因芯片和焦磷酸测序(pyrosequencing)[11～15]等已逐渐应用于诊断中。pyrosequencing技术是近年来发展起来的一种新的dna序列分析技术，适合较大样本的快速检测。pyrosequencing只需根据已知序列设计一对扩增含snp位点的pcr引物和一个测定snp类型的测序引物来检测snp。pyrosequencing是基于碱基逐个延伸的原理进行测序，产生的信号强度没有碱基种类上的差异，所以适合于比较等位基因频率和分析个体遗传差异以及疾病易感性间的关联性等[15～17]。
本文拟以pyrosequencing技术对散发性pd患者tnfα启动区308位点(rs1800629)和lta第i内含子252位点(rs909253)进行检测，并以健康人为对照，了解pd患者tnfα308和lta 252位点等位基因频率和基因型频率的变化，以期探讨其对pd发病的潜在影响。
1 材料与方法
1.1 对象 收集徐州市中心医院以及安徽医科大学附属医院2006年7月～2007年5月间门诊及住院散发pd患者114例，年龄为35～71岁，平均年龄为(58.2±8.1)岁。男性75例，女性39例。另取相同地区正常人133例作为对照，年龄为30～74岁，平均年龄为(56.0±9.7)岁。男性89例，女性44例。根据1985年全国锥体外系疾病讨论会的帕金森病和帕金森综合征诊断标准确诊。
1.2 方法
1.2.1 dna制备 收集外周静脉血。按照血液dna制备试剂盒要求抽提基因组dna。dna抽提试剂盒购自takara公司。纯化后dna置4 ℃贮存。
1.2.2 含有tnfα308g>a和lta 252a>g突变位点pcr片断的扩增 根据基因库tnfα基因和lta基因序列，按照pyrosequencing assay design sofeware 1.0(biotage 公司)设计tnfα基因308(rs1800629)、lta基因252位点突变体(rs909253)pcr引物和测序引物。tnfα308g>a pcr上游引物序列：cgcagggacccaaacaca，下游引物序列:biotinttctgggccactgactgat tt，测序引物序列: gttttgaggggcatg。lta 252a>g pcr上游引物序列：cgtgcttcgtgctttggacta，下游引物序列: biotinggggacaagatgcagt caga，测序引物序列: ttctctgtttctgccat。pcr及测序引物由上海生工公司合成。pcr试剂盒购自大连takara公司。pcr仪为 corbtt research cg196型(australia)。pcr扩增体系：1×pcr buffer,2.5 mm mgcl2,125 μm dntp，8pmol上下游pcr引物，100 ng模板dna,1u amplitaq gold(applied biosystems)，总体积为50 μl。扩增流程：95 ℃，5 min;95 ℃，15 sec,57 ℃，30 sec，72 ℃，15 sec，50个循环;72 ℃，5 min。含有tnfα基因308位点(rs1800629)和lta基因252位点(rs909253)的pcr产物长度分别为275 bp和277 bp。
1.2.3 tnfα308g>a和lta 252a>g位点pyrosenquencing检测 使用psqtm 96 ma仪对患者外周血dna tnfα 308g>a和lta 252a>g位点进行检测，方法参照以往文献报道[14～16]。pyro gold reagents(ref400044)，binding buffer(ref400033)，annealling buffer(ref 400036)和washing buffer(ref 400035)购自biotage公司(uppsala,sweden)。streptaviding sepharose(high performance)购自amersham biosciences(uppsala, sweden)。pyrosequencing检测操作步骤及试剂盒使用见仪器和产品说明。阴性对照：①阴性pcr反应产物;②测序引物;③annealling buffer。
1.2.4 数据分析 数据统计学处理采用spss 12.0分析软件。计量资料采用t检验，吻合度检验分析基因型分布是否符合hardyweinberg平衡定律;pd患者和正常对照两组间的tnfα和lta等位基因频率和基因型频率比较采用直接计数法计算，进行χ2显著性检验，并以p<0.05作为有统计学意义;相对风险用比数比(or)以及95%可信区间(95% ci)来评价。
2 结果
对114例散发原发性pd患者和133例正常对照人群的tnfα308g>a和lta 252 a>g突变位点进行pyrosequencing筛查(图1和图2)。结果表明，pd患者组和对照组符合hardyweinberg平衡定律，tnfα308g>a和lta 252 a>g基因型频率及等位基因频率见表1和表2。
比较病例组与对照组tnfα308g>a基因型频率的差异，发现病例组和对照组基因型a/a频率均为0.000 0，病例组和对照组间似有边缘性差异，但无统计学意义(χ2=3.46，p=0.062 7，表1)。将突变杂合型g/a和突变纯合型a/a阳性率两组合并，病例组tnfα308位点突变型(g/a+/a)阳性率与对照组相比，差异亦无统计学意义(χ2=3.46，p=0.062 7，表1)。同样，比较病例组与对照组lta 252a>g基因型频率，发现病例组基因型g/g频率(0.105 3)虽低于对照组(0.135 3)，但病例组和健康对照组间差异无统计学意义(χ2=1.06，p=0.588 5，表2)。将突变杂合型a/g和突变纯合型g/g阳性率两组合并，病例组lta 252位点突变型(a/g+g/g)阳性率稍高于对照组，差异亦无统计学意义(χ2=0.28，p=0.599 9，表2)。
比较病例组和对照组间tnfα308g>a等位基因频率，发现病例组等位基因g和a频率分别为0.973 7和0.026 3，对照组等位基因g和a频率分别为0.939 8和0.060 2，等位基因a频率两组间虽有边缘性差异，但无统计学意义(χ2=3.30，p=0.069 0，表1)。携带有g等位基因的个体与携带有a等位基因的个体间无明显差异(or=0.42,95% ci：0.14～1.17)。比较病例组和对照组间lta 252a>g等位基因频率，发现病例组等位基因a 和g频率分别为0.600 9和0.399 1，对照组等位基因a和g频率分别为0.601 5和0.398 5，差异无统计学意义(χ2=0.00，p=0.988 7，表2)。携带有a等位基因的个体与携带有g等位基因的个体间无明显差异(or=1.00,95% ci：0.68～1.46)。
比较患者与对照组tnfα308g>a和lta 252a>g单倍体型分布，发现tnfα308杂合突变型(g/a)患者lta 252均为突变型(a/g或者g/g)。病例组tnfα308lta 252单倍体ggag和gggg均高于对照组，单倍体gagg对照组高于病例组(6.8% vs. 0.0%)，但两组间差异无统计学意义(χ2=9.328，p=0.052 2，表3)。
3 讨论
snp是基因组水平上由单个核苷酸变异引起的一种dna序列多态性，在人类基因组中广泛存在，具有很高的遗传信息，影响着不同群体和个体对疾病的易感性以及对环境因素的反应性。它已被作为第3代遗传标记，基本上满足对疾病相关基因定位研究的需要[17]。
通常脑内单核吞噬细胞系统基本处于静息状态。当小胶质细胞被激活后能释放多种细胞因子及神经营养因子，在脑局部起到维系或损伤神经系统功能的作用[18]。细胞因子不仅对神经元产生毒性作用，也可刺激静息小胶质细胞活化，扩大胶质细胞的增殖反应，形成正反馈网络放大效应使炎症反应持续存在。近年来研究证明，原发性和家族性pd患者黑质纹状体内存在大量反应性小胶质细胞[19，20]，认为小胶质细胞过度应答以及炎性反应可以加重da神经元变性、凋亡，并使pd病变进行性加重[21～23]。pd时黑质纹状体区富集的细胞因子主要有tnfα，il1β和干扰素γ等。pd时患者基底节和脑脊液中tnf水平显著升高[19,24]。tnf对多巴胺神经元具有潜在的毒性作用，这种效应可能是通过激活半胱天冬酶途径和激活神经酰胺途径以及核因子κb，诱导多种炎症相关基因的表达以加重炎症反应而发挥的[23]。
等位基因分布存在人种以及地区上的差异。tnfα308等位基因g频率和a频率欧洲正常人群为0.782～0.818和0.182～0.218;非洲正常人群为0.795～0.877和0.123～0.205;亚洲正常人群则为0.956～0.978和0.022～0.044[25]。欧洲正常人群tnfα308基因型频率g/g为0.564～0.717，g/a为0.243～0.436和a/a为0.000～0.040;非洲正常人群分别为0.636～0.772，0.211～0.318和0.016～0.045;亚洲正常人群则分别为0.911～0.956，0.044～0.089和0.000[25]。nishimuar等[26]检测172例日本散发性pd患者tnf1031，863和857位点变化，发现早发pd病例与1031有关。wahner等[27]在对289例美国pd患者的研究中发现，tnfα308杂合及纯合突变可以增加pd的发病风险。kruger等对316例波兰pd及264例德国散发性pd患者tnfα308位点进行筛查，认为杂合tnfα308(g/a)的出现可能会增加pd发病的易感性[28]。本研究发现pd患者tnfα308等位基因a频率(0.026 3)和基因型频率g/a(0.052 6)均低于对照组，但差异无统计学意义(p>0.05)。单倍体型分析发现，tnfα308杂合突变型(g/a)携带者lta 252均为突变型(a/g或者g/g)。病例组tnfα308lta 252单倍体型ggag和gggg均高于对照组，但单倍体型gagg低于对照组(0.0% vs. 6.8%)。造成这一现象的原因目前尚未清楚，可能与不同人种基因间差异有关。本研究推测tnfα308(rs1800629)多态性改变可能不是我国散发性pd患者发病的易感性因素。
lta 252等位基因a频率欧洲正常人群为0.659～0.714，g频率为0.286～0.341;非洲正常人群分别为0.452～0.479和0.521～0.548;亚洲正常人群分别为0.565～0.568和0.432～0.435[29]。欧洲正常人群lta 252基因型频率a/a为0.409～0.476，a/g为0.476～0.500，g/g为0.048～0.091;非洲正常人群分别为0.190～0.208，0.524～0.542和0.250～0.286;亚洲正常人群分别为0.261～0.388，0.500～0.609和0.130～0.182[29]。lta也属于致炎细胞因子。关于lta 252a>g多态性与动脉粥样硬化[30]和哮喘[31]等疾病遗传易感性的研究虽有不少报道，但众说纷纭。ozaki等通过snp标记、ld定位及单倍体结构分析，发现lta 252a>g多态性可以增加心肌梗死的发病风险(p=3.3×10-7)[30]。然而关于lta 252a>g多态性与pd遗传易感性的研究迄今尚未见报道。本研究发现pd病例组和对照组lta 252等位基因(rs909253)频率以及基因型频率间差异无统计学意义，提示lta 252等位基因多态性与pd易感性无关。
综上所述，tnfα基因308(rs1800629)和lta基因252(rs909253)可能不是我国散发原发性帕金森病发病的潜在易感位点。虽有报道这2种细胞因子的表达可能参与了pd的发生、发展过程[32]，但从遗传临床流行病学角度探究tnf和lta基因突变对pd发病、发展以及预后的影响，尚需要通过大样本量对上述基因型与pd临床表型间关系进行综合对比可能具有更实际的意义。
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