【关键词】 钙卫蛋白;溃疡性结肠炎;elisa
research about the value of fecal calprotectin in the diagnosis of ulcerative colitis
yu jianbo. coloproctological department of wuyi tcm hospital, jiangmen city 529031, guandong province， china
[abstract] objective to research the value of fecal calprotectin as a non-invasive marker of disease activity in ulcerative colitis (uc).methods we recruited 60 control patients and 72 patients with uc. a11 the patients were asked to collect 10g fecal samples in 1 wk after colonoscopy. an elisa (enzyme linked immunosorbent assay) was used to determine fecal calprotectin. 19 patients whose uc activity at 3 grade after medical therepy were conduct follow-up visits, to guide clinical therapy and observe effects based by the level of fecal calprotectin.results there was no significant difference in fecal calprotectin level between the inactive uc and control groups. there are significant difference in fecal calprotectin level between patients with active and inactive uc(597.2μg/g vs 7.9μg/g， p
[key words] calprotectin;ulcerative colitis;elisa
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)是常见的慢性炎症性肠道疾病，其病因与发病机制尚不十分清楚[1]，普遍认为与机体免疫应答、肠黏膜免疫识别失调[2]及个体遗传易感性有关。WWw.133229.COm当前诊断uc活动性主要依靠结肠镜检查，有研究认为uc内镜下的活动性可反映疾病严重性[3,4]，但患者依从性较差。外周血wbc，plt, crp, igg，esr等虽可用于诊断uc的活动性，但敏感度不高。钙卫蛋白(calprotectin)是一种杂合性的钙结合蛋白，具有耐热性和抗蛋白酶活性，在肠腔和外界环境中可长期保持相对稳定而不被酶和细菌所破坏[5]，其主要生物学功能包括：抗微生物活性，免疫调节作用;参与细胞信号传递;抗增殖和诱导细胞凋亡，炎症反应中调节蛋白等。它是中性粒细胞和活化巨嗜细胞胞质中的重要蛋白质，可作为一种炎性标志物[6]。国外资料研究表明，粪便中钙卫蛋白的稳定性要好于其它粪便生物标记物，其浓度在uc活动期显著增加[7]。本试验中，我们检测uc患者不同时期的粪钙卫蛋白含量并与血液指标wbc，plt, crp, igg，esr相比较，研究是否可把它作为溃疡性结肠炎的诊断指标、疗效观察和治疗方案调整的依据。
1 材料和方法
1.1 材料2007年1月至2008年9月符合2000年成都会议标准[8]确诊的uc患者72例，男35例，女37例，平均年龄41(25～69)岁。随访活动期3级患者19例至缓解期后均重复结肠镜检查和粪便标本采集，一共进行结肠镜检查91次，组织活检91份，采集粪便标本91份。选用肠镜及活检正常的60例患者为对照组。肝、肾功能及血液指标wbc，plt, crp, igg，esr均正常，男23例，女37例，平均年龄42(18～70)岁。入选者均无明显上消化道症状及胃和小肠疾患，无严重心、肺、肝、胰、肾和神经、精神疾病，近1个月内未曾应用过糖皮质激素和免疫抑制剂，并排除孕妇、药瘾者、长期使用非甾体抗炎药及质子泵抑制剂者[9]、类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮患者、酗酒者等。uc患者依据truelove内镜分级标准被分为缓解期、活动1，2，3级，留取患者肠镜检查1周内的粪便，2 h内送至医院，密封后置于-20℃保存，以备钙卫蛋白检测。所有入选者在肠镜检查当日行肝、肾功能及wbc，pet,crp,igg，esr检测，肠镜检查时均取活检，病理诊断采用truelovewiffs标准[10]，人粪钙卫蛋白检测elisa试剂盒购自芬兰hycult公司，酶标仪为usa biorad 550型。
1.2 方法 将留存粪便在室温解冻后，用取样环取约50～150 mg，放入螺口试管中一并称其质量，计算出粪便的净含量，按照质量/容积(kg/l)=1∶50的比例加入萃取液，充分震荡20 min混匀后取1 ml匀浆离心10000 g 20 min，取上清液0.5 ml留存备用，-20℃保存,酶联免疫反应严格按照人粪钙卫蛋白检测elisa试剂盒说明书进行，将钙卫蛋白提取液室温解冻，以1∶10比例稀释，常规elisa操作程序(双抗体夹心法)。将酶标仪设置为450 nm进行测定，标准品包括7个质量浓度(100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56 μg/l)，最高浓度标准液的光密度值为2.373，以1∶10比例稀释的标本若超出标准曲线范围没有被测出，则需进一步扩大稀释比例直至测出为止。
1.3 统计学处理 计算样本的中位数和四分位间距。两组间比较用mannwhitney u检验，相关系数用spearman相关分析计算并进行检验。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 uc活动性与粪钙卫蛋白、血igg和crp 活动期粪钙卫蛋白水平显著高于缓解期和正常对照组(p<0.01)(表1)，缓解期和对照组之间差异无统计学意义(p>0.05)，活动期各级之间差异均有统计学义。19例活动期3级患者治疗后至缓解期，粪钙卫蛋白水平显著下降，其治疗前后差异有统计学意义(1378.5 μg/g vs 8.7 μg/g，p<0.01)。粪钙卫蛋白与肠镜分级显著相关(r=0.89，p<0.01)。缓解期igg，crp与对照组之间差异无统计学意义(0.05)，活动期igg和crp水平高于缓解期和正常对照组(p<0.01)。igg活动期各级之间差异均有统计学意义，crp活动期2、3级之间差异无统计学意义，igg，crp与肠镜分级相关(r=0.97，0.96，p<0.01，表2)。
2.2 uc活动性与血plt,esr和wbc 缓解期plt,esr，wbc和对照组之间差异无统计学意义(p>0.05)，活动期plt，esr，wbc水平高于缓解期和正常对照组(p<0.01)，plt活动期各级之间差异均有统计学意义，esr活动期1、2级之间差异无统计学意义，wbc活动期各级之间差异均无统计学意义，plt，esr，wbc与肠镜分级相关(r=0.98，0.99，0.97，p<0.01)(表3)。表1 粪钙卫蛋白测定结果表2 uc患者粪钙卫蛋白、血igg，crp的检测结果表3 uc患者血wbc，plt, esr检测结果
3 讨 论
钙卫蛋白最早在1980年从中性粒细胞和单核细胞中分离出来，广泛分布于人体组织、体液及细胞中，是一种重要的炎症反应性蛋白。uc为结肠慢性炎症，故粪便炎性标志物比血清标志物能更敏感地反映肠道炎症程度。粪钙卫蛋白是稳定而又活化的炎性生物标记物，故可以用来判断uc的活动性。在本实验中，患者肠道炎症程度按内镜分级标准进行分级。粪钙卫蛋白含量在活动期为597.2 μg/g，缓解期为7.9 μg/g，对照组为6.7 μg/g，这与国外研究基本吻合[11]，粪钙卫蛋白检测可准确地诊断uc的活动期和缓解期，并能反映病情动态变化。
目前，血液指标wbc、plt、crp、igg及esr常用于uc活动性的诊断。我们发现，活动期crp水平高于缓解期和正常对照，和以往研究结果相近[12]，诊断uc活动性的敏感度为64%，诊断uc活动期2，3级的敏感度优于1级。活动期igg水平与缓解期和正常对照均有差异，提示活动期uc患者体内免疫功能失调紊乱，诊断uc活动性的敏感度为46.6%，诊断uc活动期1，2级的敏感度较差。活动期plt水平高于缓解期和正常对照，与chiarantini [13]等的研究结果相一致，证明活动期uc患者体内血液呈高凝状态，易发生血管栓塞，诊断uc活动性的敏感度为45.3%，对活动期3级的敏感度较好。活动期esr水平与缓解期和正常对照均有差异，国外也有相同报道[14]，诊断uc活动性的敏感度为24%，对活动期1，2，3级的敏感度均不高，但相对于3级较敏感。活动期wbc水平与缓解期和正常对照存在差异[15]，诊断uc活动性的敏感度为13.3%，对活动期1，2，3级敏感度均差。上述血液指标易受全身因素的影响，对肠道病变的敏感度较低，升高时常见于重症患者，故诊断uc活动性的价值不高。与血液指标相比，粪钙卫蛋白在uc活动期显著高于缓解期和正常对照，活动期各级之间差异也均有统计学意义，与uc内镜分级标准的相关性极高[16]，明显高于上述各项指标;诊断uc活动性的敏感度为98.7%，对uc活动期各级均高度敏感，经χ2检验，粪钙卫蛋白诊断uc活动性的敏感度与其他血液指标差异均有统计学意义(p<0.01)，显著高于其他指标。
本研究表明，uc活动期3级患者及时调整治疗方案后，病情好转者，粪钙卫蛋白水平随之逐渐下降;若病情不缓解，粪钙卫蛋白水平仍持续偏高，进一步调整方案后，随着临床症状的改善，粪钙卫蛋白水平亦最终降至较低水平，此表现与肠镜复查结果高度一致。那些治疗后粪钙卫蛋白含量始终处在较低水平者，只需维持治疗，不调整治疗方案，其病情亦能长期保持相对稳定。可见，粪钙卫蛋白检测用于uc各期临床治疗用药指导，一方面有利于医生对疾病的动态变化进行监控，另一方面大大减轻患者痛苦和降低治疗费用，在一定程度上可替代结肠镜检查。但本研究所涉及的病例数尚少，有待于今后进一步深入研究。
我们认为，粪钙卫蛋白检测比结肠镜方便、更容易被患者接纳。急性发作期的重症uc患者，结肠镜检查往往视为禁忌，以免引起肠穿孔，此时粪钙卫蛋白检测显得尤为重要。粪钙卫蛋白检测可较准确地诊断uc的活动期和缓解期，正确反映病情动态变化，明显优于目前常用的血液指标。它可在短期内重复多次测定，通过它可及时监测疾病的缓解、加重和复发，从而正确调整治疗方案，指导临床治疗。
【参考文献】
[1]fiocchi c.inflammatory bowel disease：etiology and pathogenesis[j].gastroenterology,1998,115：182205.
[2]ameho ck，adjei aa，harrison ek prophylactic effect of dietary glutamine supplementation on interleukin 8 and tumour necrosis factor alpha production in trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis[j].gut,1997,41：487.493.
[3]powelltuck j，day dw，buckell na. correlations between defined sigmoidoscopic appearances and other measures of disease activity in ulcerative colitis[j].dig dis sci,1982,27：533537.
[4]seo m, okada m, yao t. evaluation of disease activitv in patients with moderately active ulcerative colitis：com parisons between a new activity index and truelove and witts classification[j]. am j，gastroenterol,1995,90：17591763.
[5]johne b，fagerhol m k，lyberg t functional and clinical aspects of the myelomonocyte protein calprotectin[j].mol pathol,1997,50：113123.
[6]kerkhoff c，klempt m ，sorg c.novel insights into structure and function of mrp8(s100a8)and mrp14 (s100a9)[j].biochim biophys acta,1998,1448：200211.
[7]sander j，fagerhol mk，bakken js.plasma levels of the leucocvte l1 protein in febrile conditions：relation to aetiology，number of leucocytes in blood，blood sedimentation reaction and creactive protein[j].scand j clin lab invest,1984,44：357362.
[8]欧阳钦，潘国宗，温忠慧.对炎症性肠病诊断治疗规范的建议[j].中华消化杂志,2001,21：236239.
[9]poullis a，foster r，mendall ma proton pump inhibitors are associated with elevation of faecal calprotectin an d may affect specificity[j].eur j gastroenterol hepatol, 2003,15：573574;author reply 574.
[10]江学良，权启镇，王志奎.溃疡性结肠炎的诊断、分型及疗效标准[j].世界华人消化杂志,2000,8：332334.
[11]amati l，passeri me，selicato f new insights into the biological and clinical significance of fecal calprotectin in infl am matory bowel disease[j].immunopharmacol immunotoxicol,2006;28：665681.
[12]solem ca，loftus ev jr，tremaine wj. correlation of creactive protein with clinical，endoscopic，histologic,and radiographic activity in inflammatory bowel disease[j].inflamm bowel dis,2005,11：707712.
[13]jaremo p,sandberggertzen h.platelet density and size in inflammatory bowel disease[j].thromb haemost,1996,75：560.561.
[14]ha js,lee js,kim hj. comparative usefulness of erythrocyte sedimentation rate and creactive protein in assessing the severity of ulcerative colitis[j].korean j gastroenterol,2006,48：313320.
[15]lampinen m，ronnblom a，amin k.eosinophil granulocytes are activated during the remission phase of ulcerative colitis[j].gut,2005,54：17141720.
[16]hanai h，takeuchi k，iida t， relationship between fecal calprotectin, intesfinal inflammation,and peripheral blood neutrophils in patients with active ulcerative colitis[j].dig dis sci,2004,49：14381443.
