microRNA是一类大小约22个核苷酸长度的内源性非编码小分子RNA[1],主要通过识别并结合靶基因 mRNA 的3’端非编码区,在转录后水平抑制蛋白的翻译或促进靶基因的降解[23]。有研究发现微小RNA参与肺内炎症反应的调控[4],miR146a是其中较有代表性的一个。本课题组前期研究发现,用LPS刺激肺泡巨噬细胞,miR146a的表达水平升高,并且升高程度与TNFα mRNA呈负相关[5];转染miR146a能下调LPS诱导肺泡巨噬细胞TNFα的表达[6],表明miR146a能抑制LPS诱导肺泡巨噬细胞的炎症反应。本实验拟进一步探讨miR146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制,为体内试验提供理论依据。
1 材料和方法
11 材料
大鼠肺泡巨噬细胞NR8383(上海中国科学院细胞库);LPS(E.coli 0111:B4);PremiRTM miR146a前体、CyTM3标记的PremiRTM阴性对照(美国ABI公司);大鼠 TNFα ELISA 检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司) ; PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR荧光染料试剂Ⅱ(SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ)PCR 检测试剂盒(大连宝生物工程有限公司);抗IRAK1 抗体,抗TRAF6 抗体、抗NFκB p65抗体(美国abcam公司)。
12实验分组及处理
将体外培养的 NR8383 细胞按每孔15×106个接种至6孔板,每孔2 mL,每组2个复孔。转染组转染50 nmol/L的PremiRTM miR146a前体,对照组转染50 nmol/L 的 CyTM3 标记的 PremiRTM 阴性对照,摇匀后继续培养24 h,随后加入1 μg/mL 终质量浓度的 LPS 处理细胞6 h,离心收集细胞和上清液,-80 ℃保存。
13检测指标及方法
131免疫荧光法观察 NFκB p65 核移位情况将细胞爬片放置于24孔板;甲醇丙酮固定细胞,05%TritonX100 PBS 透化细胞;再放入含10%驴血清的 PBS 中4 ℃封闭;孵育一抗:用05%TritonX100 PBS稀释兔抗 NFκB p65(1∶50),常温下孵育4 h后漂洗;孵育二抗:用10%驴血清的 PBS 稀释 Alexa Flour 488 驴抗兔绿色荧光标记二抗(1∶200),室温下孵育20 min后漂洗;用 Dapi 染核,滴加防荧光粹灭剂、固定封片,在Olympus IS71倒置荧光显微镜下拍照分析。
132ELISA 检测 TNFα 蛋白含量收集细胞上清液,按照 ELISA 试剂盒操作说明书步骤操作检测 TNFα 蛋白含量。
133RTqPCR 检测 IRAK1、TRAF6 及TNFα mRNA 表达采用 TRIzol 法提取细胞内总 RNA,通过紫外分光光度计测定总 RNA 浓度,琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 完整性及纯度。按照 PrimeScript逆转录试剂盒说明书操作,所有操作均在冰上完成。10 μL 的逆转录反应体系:PrimeScript 缓冲液 2μL,PrimeScript 逆转录酶复合物 105 μL,多聚胸腺嘧啶引物 05 μL,随机的6核苷酸引物 05 μL,总RNA 500 ng,加无核酶水至总体积10 μL。反应条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。20 μL 的 PCR反应体系包括:cDNA 2 μL,上游引物 08 μL,下游引物 08 μL,SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL,ROX Reference Dye 04 μL,无核酶水6 μL。反应条件:95 ℃ 30 min,40个扩增循环(95 ℃ 5 s,57 ℃ 20 s,72 ℃ 27 s)。选取βactin 作为内参,检测IRAK1 mRNA、TRAF6 mRNA及TNFα mRNA的表达,相对表达量采用2ΔΔCt计算。引物序列及长度见表1。
134IRAK1、TRAF6、NFκB p65 蛋白表达收集细胞,离心,弃上清,提取总蛋白或分别提取胞核蛋白、浆蛋白,用BCA法测定蛋白浓度。完成聚丙烯酰胺凝胶电泳(每孔加样20 μL)、转膜、封闭,孵育一抗,兔抗 IRAK1(1∶2000)、兔抗 TRAF6 (1∶1000)、兔抗 NFκB p65(1∶500)和鼠抗 βactin(1∶3000)/兔抗 Lamin B1(1∶1000),4 ℃孵育过夜,漂洗3次;孵育二抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 、山羊抗鼠 IgG(1∶4000),37 ℃孵育12 h,漂洗3次,暗室内曝光、显影并定影,行X胶片扫描,通过 Quantity One 软件进行数据分析,检测 IRAK1、TRAF6及胞浆NFκB p65蛋白以 βactin 作为内参,细胞核内NFκB p65蛋白以 Lamin B1作为内参。
14统计学方法 采用 SPSS 170 统计软件分析数据,数据以均数±标准差(x±s)表示,两样本比较采用独立样本t检验。以P<005为差异具有统计学意义。
2结果
21过表达 miR146a 对 LPS 诱导的 NR8383 细胞 NFκB p65 核移位的影响
211免疫荧光法观察细胞 NFκB p65 核移位的变化倒置荧光显微镜下观察到NFκB p65 呈绿色荧光,Dapi 染核后呈蓝色荧光。与对照组比较,观察到转染组 NFκB p65 胞核中表达减少,胞浆中增多。
23过表达 miR146a 对 LPS刺激的NR8383细胞 IRAK1和TRAF6蛋白表达的影响
与对照组比较,过表达miR146a后,转染组IRAK1 mRNA增加为(116± 01)倍,TRAF6 mRNA增加为(119± 016)倍,差异均无统计学意义(P>005);转染组IRAK1 蛋白下降为(073±005)倍,TRAF6 蛋白下降为(064±009)倍,差异均有统计学意义(P<005)。见图4。
3讨论
miR146a 是第一个被发现能够调节免疫系统的微小RNA,当机体存在有感染、肿瘤时miR146a 表达上调[79],上调人单核细胞白血病细胞(THP1细胞)的 miR146a 后将负性调控炎症因子的释放[10]。研究证实在 LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中 miR146a 表达上调;本研究发现过表达 miR146a 后,用 LPS 刺激肺泡巨噬细胞, NFκB 核移位受到抑制,TNFα mRNA 表达下降,上清液中 TNFα 蛋白含量也明显下降,提示 miR146a 能够抑制 LPS 诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应。
A:RTqPCR检测过表达miRNA146a后NR8383细胞中IRAK1和TRAF6 mRNA的表达变化;B:Western bloting 检测过表达miRNA146a后NR8383细胞中IRAK1和TRAF6蛋白的表达变化;C:Quantity One 软件对B图条带进行灰度值分析,与对照组比较, aP<005
笔者进一步实验发现,过表达 miR146a 后,IRAK1 mRNA 和 TRAF6 mRNA 表达量无明显变化,而 IRAK1 和 TRAF6 蛋白表达下降。Taganov 等[11]研究发现 LPS 刺激 THP1 细胞后,miR146a 表达上调,并通过突变试验和荧光素酶报道基因试验证实,miR146a 的靶基因是 TLRs/NF&kappa
;B 通路中的两个接头蛋白编码基因 IRAK1和TRAF6。TLRs/NFκB 是经典的炎症信号通路,当LPS 刺激肺泡巨噬细胞,可与细胞膜表面 TLR4 结合,导致 IRAK1 自身磷酸化,继而活化 TRAF6,使其与转化生长因子 β活化激酶1(TAKl)及 TAKl 的结合蛋白(TAB)形成复合物,导致 IκB 磷酸化和降解,最终使 NFκB 移位进入核内,启动相关基因转录翻译生成 TNFα 炎症因子[1213]。有研究表明过表达 IRAK1 能够使 HEK293 细胞和 THP1 细胞中NFκB 呈剂量依赖性增加,同时 TNFα 也增加,而敲除 IRAK1 基因能降低 LPS 诱导的 THP1 细胞[1415]炎症反应;同样过表达或者敲除 TRAF6 也产生相同的作用。
参考文献
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