【摘要】 目的：探讨新生大鼠心肌细胞的分离和培养方法。方法：应用0.0625%的胰蛋白酶重复消化出生第2 d乳鼠的心肌组织多次,收集的细胞用含10%胎牛血清的dmem培养基中和，用差速贴壁分离法分离，在以溴脱氧尿嘧啶（brdu）纯化心肌细胞后置co2培养箱孵育7 d。结果：分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为140万个，且有活力心肌细胞占90％以上；培养4～6h的乳鼠心肌细胞开始贴壁生长,12～24h明显增殖,3～4 d后细胞融合成片；心肌细胞由圆形变为梭形、星形、多角形,并出现自发性节律性搏动。结论：本研究应用的心肌细胞原代培养方法可获得高产量、高活力的心肌细胞，是一种可靠的心肌细胞培养方法。
【关键词】 心肌；细胞培养技术；大鼠
primary culture of neonate rattus cardiocyte/ma fang|fang，shen xiao|li，lin li|fang，han li|li//chinese journal of cardiovascular rehabilitation medicine,2009，18（2）:125
abstract：objective:to explore the primary cultures method of neonatal rat cardiomyocytes.methods:cardiac muscle of twoday neonate rattus was digested repeatedly by 0.0625% trypsin.the cardiocytes were collected in dmem medium,which contains 10% fetal bovine serum.myocardial cells were isolated with the technique of differential anchoring velocity with 90 min and were pured by brdu.the cardiocytes were placed into co2 incubator to incubate seven days after their purification.results:a total of 1.4 million cardiocytes can be obtained from one rat and the vital cell was over 90%；cardiocytes began to adhere and grow after 4～ 6 h，to obviously proliferation after 12～24 h，and to converge together after3～4 days.the cardiocytes showed spherical，fusiform and polygon shape in the visual field of inverted microscope.all cells stretched out parapodium and beated spontaneously and rhythmically.conclusion:a great quantity and high survival rate cardiocytes can be effectively and quickly cultured by this method.
author′s address：fujian provincial hospital，fujian medical university，fuzhou,fujian,350001，china
key words：myocardium;cell culture techniques;rat
自1960年haracy等[1]首次对乳鼠的心肌细胞进行培养以来，国内、外许多学者对心肌细胞原代培养方法进行了研究。wWw.133229.COM体外培养的心肌细胞能够保持其在体内原有的许多结构和功能，同时排除了神经、体液等因素的干扰，因此体外培养在心肌细胞的生长、发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要意义。然而心肌细胞在分离过程中易受损伤,活细胞也很少分裂，且不易传代,因此提高心肌细胞产量和活力是许多学者研究的目的。本实验参照simpson p等[2]心肌细胞的培养方法并作了改进，探讨了乳鼠心肌细胞培养的方法，对心肌细胞形态、搏动状况进行观察，并对其纯度进行了鉴定，从而获得高产量、高活力的心肌细胞。
1 资料与方法
1.1 材料
实验动物：选择出生第2 d的sd乳鼠,雌雄不拘（由福建省医学科学研究所实验动物中心提供）。主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，olympus倒置显微镜,超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器;dmem 培养基( hyclonc 公司)、胎牛血清( hyclonc 公司)、胰蛋白酶(gibco 公司)、d-hank′s 液( hyclonc 公司)、溴脱氧尿核苷(brdu，sigma公司) 、小鼠抗大鼠sarcomerie actin 单抗(博士德公司)；山羊抗小鼠igg(博士德公司)。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞的分离:取第2 d的sd乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的d-hank′s 液洗涤3遍，将心脏剪成约1mm3大小；用0.0625％的胰酶在37℃恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5min×5次,6min×5次,7min×5次,8min×5次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次分离的上清液加等量含10％胎牛血清的dmem培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，重复3次。
1.2.2 心肌细胞的培养:细胞悬液放co2培养箱培养90min后，采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞/ml，将单细胞悬液接种于培养板中，前3 d滴入brdu使其终浓度为0.1mmol/l，并继续培养；24h后换液,以后隔日换液。
1.2.3 心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第1 d至第7 d心肌细胞的生长状态、形态变化，并摄像记录自发搏动频率。随机计数培养至第4 d的心肌细胞的搏动率。细胞搏动率(％)=搏动细胞数／细胞总数×100％。
1.2.4 心肌细胞存活率的测定:取相同量的0.4％台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上，随机取10个高倍（20×）视野计数4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数，计数10次，取平均值。细胞存活率(％)=活细胞数／细胞总数×100％.
1.2.5 心肌细胞纯度的鉴定:取培养72 h后心肌细胞进行纯度鉴定，用横纹肌肌动蛋白(aactin)单克隆抗体作为一抗，用sabc法进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（pbs）作为一抗的阴性对照。随机取10个高倍（20×）视野计数阳性细胞及细胞总数。阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100％。
2 结 果
2.1 消化时间对心肌细胞活力和细胞产量的影响
实验结果显示,采用0.0625%胰蛋白酶、37℃恒温低速磁力搅拌及分次消化时间为8min时心肌细胞活力和细胞总数较理想，见图1，图2。并且随着总消化时间的延长，细胞活力程下降趋势,见图3。
2.2 培养心肌细胞的形态特征
培养4～6 h 后,在倒置显微镜下可观察到心肌细胞开始贴壁生长,初为圆形,后为梭形,偶见单个细胞开始搏动,继而细胞逐渐在瓶壁表面铺展；随后细胞不断分裂、增殖,数量逐渐增多,形成不规则的星形,细胞铺展状况更加明显,并伸出伪足；在培养第3～4 d,伪足可相互接触交织成网,形成细胞单层或细胞簇,呈放射状排列的同心圆状,其搏动同步化,形成所谓功能性合体细胞，见图4～图7（见封三）；至第4 d自发搏动达高峰，搏动率为85％～90％；至第7 d搏动率开始减少。
2.3 心肌细胞纯度的鉴定
横纹肌肌动蛋白(a|actin)单克隆抗体作为一抗，用sabc法进行免疫细胞化学染色，可见胞浆呈棕黄色染色；非心肌细胞染色呈阴性。结果显示几乎所有的细胞呈现阳性,说明此时培养的心肌细胞较纯，见图8（见封三）。
3 讨 论
心肌细胞培养能提供单个细胞的同源性集落，在可视、可控制的环境中对心肌细胞的特性、药理、病理、生理、代谢和分子生物学等方面进行基础研究，具有产量大，重复性好及不受神经、体液因素影响的特点，已成为心血管研究的基本方法和手段之一，有着广阔的应用前景。由于各实验室所需要解决的问题、实验材料的取舍、实验室具体条件不同等,所采用的细胞培养方法也不尽相同。本研究采用0.0625%低浓度胰蛋白酶、37℃恒温低速磁力搅拌及短时间多次消化的方法分离新生大鼠心肌组织,以获得高产量、高活力的心肌细胞。现对新生大鼠心肌细胞体外培养的影响因素进行总结,以提高心肌细胞培养的存活率。
消化酶种类的选择：分离心肌细胞通常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶［3］，也有在胰蛋白酶或胶原酶中加入脱氧核糖核酸酶（dnase ）［4］，目的是防止从损伤细胞中释放的dna积聚。而本实验室通过单独用胰蛋白酶消化得到较高质量的细胞，节省了实验成本。
消化酶浓度和消化时间的选择：新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感，因此消化酶的浓度和消化时间是实验成功的关键。不同的实验室采用胰酶的浓度从0.05％～0.25％不等，本实验室采用0.0625％的胰蛋白酶浓度能获得高产量、高活力的心肌细胞。胰蛋白酶浓度过高时,心肌组织中细胞及间质均受到影响,极易把组织消化成为透明粘稠状液体,使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；胰蛋白酶浓度过低时，心肌组织消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以进行形态学观测。不同实验室采用的分次消化时间从5～8 min不等，我们在试验中发现分次消化时间为8 min时，细胞产量和细胞活力较理想。有的实验室在心肌消化过程中将心肌消化到透明为止，而我们发现随着总消化时间的延长细胞活力呈下降趋势，本实验室将总的消化时间控制在20 min左右。
细胞培养过程中的无菌原则：在进行细胞培养时,组织材料来源、培养液、血清、消化酶、手术器械、培养板等,要严格按无菌实验要求准备,培养过程中具体操作的每一步都应严格遵循实验原则和无菌要求。心肌细胞的观察、拍照时间不可过长，频率不可太高，否则能增加污染概率。
心肌细胞生长适宜的ph 值：心肌细胞生长的最适ph 值为7.2～7.4，因此培养液、胰蛋白酶、d-hank′s液ph 值均应在此范围内。当ph 低于6.8时,对心肌细胞生长会有抑制作用；当ph值大于7.6时，心肌细胞生长亦会受到抑制，且搏动会减弱。
成纤维细胞对心肌细胞培养的影响：细胞培养中的非心肌细胞主要是成纤维细胞，成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，大量成纤维细胞的存在不仅限制心肌细胞的活动,而且其分泌物也影响心肌细胞的形态结构和生理功能[5]。本实验采用90min差速贴壁和brdu可得到较纯的心肌细胞。brdu可显著抑制心肌细胞中的成纤维细胞,并发现brdu对心肌细胞无毒性与抑制作用,可使培养细胞中心肌细胞所占比例从45％～50％提高到85％～90％[6]。
心肌细胞的接种密度：心肌细胞的接种密度不仅影响分离细胞的分化表型特征,而且影响心肌细胞的生存时间。心肌细胞之间联系可促进细胞自发活动的形成。如果心肌细胞接种密度太低,细胞间难进行信息交流,细胞生长不良、细胞难于生存；如果细胞密度太高,则易发生营养不良，且许多细胞难于贴壁生长,在更换培养液时容易被丢失[7]。本实验室的心肌细胞接种密度一般为5×105细胞/ml,此时细胞生长良好,收缩明显而有力,搏动频率多在70～120次/min。
综上所述，心肌细胞增殖能力低，大多实验来源于心肌细胞的原代培养，因此原代培养的成功与否直接关系到实验的进程，而提高心肌细胞的产量和活力是心肌细胞培养成功的关键。本研究介绍的心肌细胞原代培养方法，细胞贴壁快、搏动早、产量高，活力好而且操作简便、成本低，是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法。
【参考文献】
[1]harary l，farly b.in vitro studies of single isolated beating heart cells［j］.science,1960，131:1674-1675.
[2]simpson p，savion s.differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells[j].cirac res，1982，50：101-106.
[3]suzuki t，ohta m，hosh h.serum free，chemically defined medium to evaluate the direct effects of growth factors and inhibitors on proliferation and function of neonatal rat cardiac muscle cells in culture[j].in vitro，1989，25：601-606.
[4]boerma m，van der wees cg，wondergem j，et al.separation of neonatal rat ventricular myocytes and non|myocytes by centrifugal elutriation[j].eur j，phy，2002，444(3)：452-456.
[5]miragoli m，gaudesius g，rohr s.electrotonic modulation of cardiac impulse conduction by myofibroblasts[j].cirac res，2006，98(6)：801-810.
[6]sun h，chartier d，leblanc n，et al.intracellular calcium changes and tachycardia-induced contractile dysfunction in canine atrial myocytes[j].cardiovasc res，2001,49 (4):751.
[7]clark wa，decker ml，behnke m，et al.cell contact as an independent factor modulating cardiac myocyte hepertrophy and survival in long|term primary culture[j].mol cell cardiol,1998,30:139-142.
