【摘要】 目的： 研究超声法提取桑黄中总黄酮的最佳工艺。方法： 设计正交试验，采用超声辅助提取，对桑黄中总黄酮的提取工艺进行研究。结果： 以总黄酮提取率为指标，得出超声法提取桑黄总黄酮的最佳工艺为乙醇浓度70%，提取温度45℃，料液比1∶30，提取时间45 min。结论： 该工艺提取桑黄中总黄酮，方法简单，耗时短，提取率高。
【关键词】 桑黄; 总黄酮; 超声提取; 正交设计
research on the extraction of total flavonoids fromphellinus vaninii with ultrasonicassisted technique
xia guohua, ge yanru, fu haizhen, qi xueyong
(school of pharmacy, jiangsu university, zhenjiang jiangsu 212013, china)
[abstract] objective: the best extraction technique of total flavonoids from phellinus vaninii with ultrasonicassisted technique was explored.methods： the orthogonal design was used in the research on the ultrasonicassisted technique extraction technique. results： the optimum conditions of the extraction were as follows: ethanol 70%; extracting temp 45℃; the ratio of solid to liquid 1∶30; extracting time 45 min. conclusion： this process was featured by higher extraction rate and shorter extraction time.
[key words] phellinus vaninii; total flavonoids; ultrasonic; orthogonal design
桑黄属担子菌亚门、多孔菌科, 又称桑臣、桑耳、胡孙眼、孔菌等, 是一种珍贵的药用真菌，在我国传统中药中用于治疗痢疾、盗汗、血崩等[1]。wwW.133229.COM目前主要应用于肝炎及癌症的治疗，其特有的抗肿瘤活性及低毒性使其成为研究热点[2,3]。桑黄主要化学成分为多糖和黄酮。现有的关于桑黄的文献报道中，提取桑黄总黄酮多采用乙醇浸提或回流提取，试验耗费时间长，且提取率不理想[4]。
本研究采用超声辅助提取，并对提取条件进行优化。
1 仪器与试剂
1.1 仪 器
kq250b型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);rotavapor r200旋转蒸发仪(德国buchi公司);fd1c50冷冻干燥机(北京博医康技术公司);uv2401型紫外分光光度仪(日本岛津公司)。
1.2 试 剂
芦丁标准品(南京泽朗，经高效液相色谱法检测纯度大于99%);桑黄子实体(phellinus vaninii，长白山区杨树野生桑黄，购自延吉长白山特产经营部，本院张朝辉教授鉴定);水为实验室自制去离子水，提取乙醇(广源医药，药用规格)，其余试剂为分析纯。
2 提取工艺
2.1 提取方案
准确称取60目桑黄子实体粉末15 g，加入一定体积的乙醇，室温下浸泡12 h后超声提取，残渣用相同浓度和体积的乙醇再超声提取一次，合并两次提取液，回收乙醇，浓缩液冷冻干燥，得到桑黄提取物。
2.2 黄酮的定性反应
2.2.1 盐酸-镁粉反应 少量提取物用乙醇溶解，加少许镁粉，浓盐酸3～4滴。加入镁粉前溶液呈暗黄色，滴加浓盐酸后有泡沫产生，且升腾的泡沫呈橙红色。
2.2.2 浓氨水反应 提取物乙醇溶液点在滤纸上，置于浓氨水上方30 s，紫外灯下观察，显黄色荧光斑点。
2.2.3 薄板层析 提取物乙醇溶液点于硅胶板上，展开剂(正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5)中展开，置于紫外灯下观察，显黄色荧光斑点。
2.3 uv法测定桑黄总黄酮的含量[5]
2.3.1 溶液的配制 准确称取芦丁标准品23.2 mg，用70%乙醇溶解并定容至50 ml，作为标准液备用。称取0.8 g硼酸和1.0 g乙酸钠，用70%乙醇溶解并定容至100 ml，作为络合试剂。
2.3.2 标准曲线 准确吸取标准芦丁溶液0.5,1.5,2.0,2.5,3.0 ml ,加70%乙醇定容至25 ml。分别精密吸取上述溶液5 ml，加5 ml络合试剂混匀后，384 nm处测光密度。
以光密度d为纵坐标，芦丁浓度c(μg·ml-1)为横坐标，绘制标准曲线，得芦丁浓度(c)与光密度(d)关系曲线的回归方程式：d=0.03c-0.0182，r2=0.9992。
2.4 正交试验
2.4.1 正交试验设计 选取乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间作为4个影响提取的因素，设计l9(34)的4因素3水平正交试验。如表1所示。表1 正交试验因素与水平表
2.4.2 总黄酮提取率 分别准确称取各提取条件下的提取物约17.3 mg，加70%乙醇定容至25 ml。精密吸取各样品液1.5 ml，加70%乙醇定容至25 ml。分别精密吸取5 ml与5 ml络合试剂充分混合，384 nm处分别测光密度，按照下列公式计算总黄酮提取率。
总黄酮提取率=提取物总黄酮黄酮量原药材量×100%
2.4.3 正交试验结果 以桑黄总黄酮提取率为指标，根据上述正交试验因素水平表，采用l9(34)来确定最佳提取条件，正交试验结果见表2。
由表2正交试验结果可以看出，影响总黄酮提取率的反应条件中各因素主次为b>c>a>d，即提取时间>料液比>乙醇浓度>提取温度;最优的提取工艺应为a2b2c3d2，即：乙醇浓度70%，料液比1∶30，提取温度为45℃，时间为45 min。表2 超声提取桑黄中总黄酮正交试验结果
2.5 验证试验
最优的提取工艺为a2b2c3d2，并未在正交试验中进行，需进行验证试验。准确称取15 g的桑黄子实体粉末，加入70%乙醇450 ml，室温下浸泡12 h后超声45 min，控制温度45℃，残渣以相同方法再超声提取一次，合并两次提取液，回收乙醇，浓缩液冷冻干燥后按“2.4.2”项下测得总黄酮含量为76.6%,提取率为7.07%，结果与正交结论一致。
最大料液比1∶30时并未出现提取效应的下降，因此对该条件进行验证，45℃时用70%乙醇提取45 min的条件，选取料液比1∶40与1∶50进行提取，测得其总黄酮提取率分别为6.44%与6.73%，与同等条件下料液比1∶30的验证试验相比没有提高，因此1∶30可认为是最佳料液比。2.6 加热回流提取
准确称取60目桑黄子实体粉末15 g，加入70%乙醇450 ml，室温下浸泡12 h后加热回流提取3 h，残渣加70%乙醇450 ml再回流提取3 h，合并两次提取液，回收乙醇，浓缩液冷冻干燥后按“2.4.2”项下测得总黄酮含量为33.0%,提取率为2.72%。
3 讨 论
相对于加热回流提取，超声辅助提取方法提高了桑黄总黄酮的提取率，缩短了提取时间，操作简单。
最优提取条件下总黄酮提取率高，但是其杂质含量也较高，可能会对进一步的分离纯化带来困难。
目前市场商品性 “桑黄”物种混乱，由于寄主不同、菌株来源不同等因素，其黄酮含量差异也较大，用上述工艺考察测定市面常见的几个品种，结果表明，杨树桑黄中总黄酮的含量最高，其次是白桦桑黄和黑桦桑黄，落叶松桑黄中含量最低。
【参考文献】
[1] 江苏新医学院. 中药大词典[m]. 上海：上海科学技术出版社，1995.
[2] shon yh, nam ks. inhibition of cytochrome p450 isozymes and ornithine decarboxylase activities by polysaccharides from soybeans fermented with phellinus igniarius or agrocybe cylindracea[j]. biotechnol lett, 2004，26(2)： 159-163.
[3] song ty, lin hc, yang nc, et. antiproliferative and antimetastatic effects of the ethanolic extract of phellinus igniarius(linnearus: fries) quelet[j]. j ethnopharmacol, 2008，115(1)：50-56.
[4] 宋 铂，周培根，王 艳，等. 利用大孔树脂吸附提取桑黄总黄酮[j]. 上海水产大学学报，2007，16(1)：60-63.
[5] 刘艳芳，杨 焱，贾 薇，等. 药用真菌桑黄总黄酮测定方法研究[j]. 食用菌学报，2006，13(2)：45-48.
