目录
中文摘要........................................................... I
英文摘要...........................................................II
目录............................................................. III
1. 绪论.............................................................1
1.1 前言.........................................................1
1.2 黄酮类化合物的结构...........................................1
1.3 背景.........................................................1
2. 实验部分.........................................................4
2.1 主要材料和试剂...............................................4
2.1.1 原材料.................................................4
2.1.2 实验仪器...............................................4
2.1.3 材料与试剂.............................................4
2.2 实验方法.....................................................4
2.2.1 桑葚中总黄酮的提取.....................................4
2.2.2 总黄酮含量的测定.......................................5
2.2.2.1 芦丁标准曲线的制备.............................5
2.2.2.2 样品含量测定...................................6
3. 结果与讨论.......................................................7
3.1 单因素实验...................................................7
3.1.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响...........................7
3.1.2 提取温度对总黄酮提取率的影响...........................8
3.1.3 料液比对总黄酮提取率的影响.............................9
3.1.4 提取时间对总黄酮提取率的影响..........................10
3.2 总黄酮提取正交实验结果与分析................................11
3.3 四种树脂静态吸附与解吸......................................13
3.3.1 四种树脂静态吸附......................................13
3.3.2 四种树脂静态解吸......................................14
3.3.3 四种大孔吸附树脂的相关参数............................15
3.4 大孔吸附树脂分离纯化实验分析................................15
3.4.1 pH值对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响...............15
3.4.2 无机盐对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响............16
3.4.3 温度对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响..............17
3.4.4 乙醇洗脱剂浓度对解吸率的影响..........................18
3.4.5 乙醇洗脱速率对解吸率的影响............................20
3.4.6 乙醇洗脱用量对解吸率的影响............................21
3.5 大孔树脂的预处理与强化再生..................................22
3.5.1 大孔树脂的预处理.....................................22
3.5.2 大孔树脂的强化再生...................................22
3.6 小结........................................................22
4. 总结与展望......................................................23
致谢...............................................................25
参考文献...........................................................26
1 绪论
1.1 前言
黄酮类化合物（flavonoids），又名生物类黄酮化合物（bioflavoinoids），是色原酮或色原烷的衍生物。黄酮类化合物多存在于高等植物及羊齿类植物中。苔类中含有的黄酮类化合物为数不多，而藻类、微生物、细菌中没有发现黄酮类化合物[1]。黄酮类化合物又大多存在于一些有色植物中，如在松树皮提取物、绿茶提取物、银杏叶提取物、红花提取物中，都发现黄酮类化合物的存在。而在植物的各个部分包括根、茎、心材、树皮、叶、花、果实中，也都发现了黄酮类化合物而植物叶中大部分黄酮类化合物一般是以苷的形式存在，而在很多个种的叶子角质中明显地存在有微量的配基[2]。
1.2 黄酮化合物的结构
黄酮类化合物具有强大的抗氧化性，自由基清除性和金属螯合性，有强大的抗氧化活性和脂质过氧化过程的活性[3]。以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物 ，也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物。黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。又由于分子中γ-吡酮环上的氧原子能与强酸成盐而表现为弱碱性，因此曾称为黄碱素类化合物。
根据三碳键（C3）结构的氧化程度和B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可分为下列几类：黄酮和黄酮醇；黄烷酮（又称二氢黄酮）和黄烷酮醇（又称二氢黄酮醇）；异黄酮；异黄烷酮（又称二氢异黄酮）；查耳酮；二氢查耳酮；橙酮（又称澳咔）；黄烷和黄烷醇；黄烷二醇（3，4）（又称白花色苷元）；花（色）［又称2-苯基苯并吡（喃）］。
1.3 背景
桑葚，别名：桑实、桑果，为桑叶落叶乔木桑树的成熟果穗。全国大部分地区均产，以南方育蚕区产量较大。4-6月份果穗成熟呈红紫色时采收。洗净，捻去杂质，晒干或略蒸后备用。生食以个大肉厚，糖性足者为佳，味微酸而甜。也可加蜜熬膏用。桑葚味甘、寒《滇南本草》：“益肾脏而固精，久服黑发明目”。桑葚中含有丰富的黄酮类化合物，其中又以药桑椹中黄酮含量最高，黑桑椹次之，白桑椹较低[4]。由于桑葚中富含黄酮化合物和维生素，具有良好的保健作用，可作为优良的维生素类补充食品。桑椹治疗咽炎效果好，无毒副作用，是值得推广使用治疗急慢性咽炎的“珍贵食品”，尤其是对中老年病和延缓衰老有重要意义。有关桑椹延缓衰老的实验表明，机体衰老与氧自由基引发的脂质过氧化作用密切相关。药桑能有效清除自由基，抗脂质过氧化，这可能与药桑果含有丰富的天然抗氧化成分VC、
β-胡萝卜素、硒、黄酮等有关。桑果可通过改善免疫机能而起到抗氧化、延缓衰老及润肤美容的功效[5]。
桑葚中生物类总黄酮主要为芦丁、槲皮素、花青素等黄酮类化合物，芦丁与乌发成分有关，能使头发变的黑而亮泽。花青素等黄酮类化合物作为一种强有力的抗氧化剂，它能够保护人体免受一种叫做自由基的有害物质的损伤。有助于预防多种与自由基有关的疾病，包括癌症、心脏病、过早衰老和关节炎，花青素还能够增强血管弹性，改善循环系统和增进皮肤的光滑度，抑制炎症和过敏，改善关节的柔韧性。大量研究表明槲皮素具有扩张血管降血压、防治冠心病、减轻心肌肥厚、抑制血管平滑肌细胞增生肥大、抗血栓形成等多种心血管保护作用。
现代市场上无论是国内还是国外对生物类黄酮的提取的原料主要是大豆类与蔬菜类物质，但到目前为止，从桑葚中提取生物类总黄酮的研究还没有报导。研究表明，现在农村对桑葚浪费比较严重，一般都作废弃处理，或者到市区以水果类廉价卖出，但是如果把这部分资源利用起来，市场前景是广阔的，同时也为黄酮的提取提供了一个新的途径。据调查，桑葚中含黄酮量为0.41%，主要为芦丁，槲皮素与花青素，桑葚中含有丰富的生物类黄酮，因而从桑葚中提取生物类黄酮可能会具有广阔的市场前景，同时也是制备与提取生物类黄酮的又一种方法。由于生物类黄酮在特定方面有着显著的作用与疗效，黄酮受到越来越多人的重视与发展生产。而且，现在的黄酮提取主要是大豆类物质与蔬菜类物质，且形式比较单一。桑葚在江浙地区及南方都有生长，这部分资源一直都没很好利用起来，如果利用起来，可节省生产成本所以开发这个项目具有较好的产业化市场前景。
目前，无论是国际还是国内市场上对生物类黄酮需求量巨大，据统计，目前市场上黄酮生产总量远远低于需求量，市场缺口庞大。一些企业生产的量较小，而且价格昂贵，价格之所以贵，主要的原因：一是生产原料不足和原料价格的昂贵；二是含有足够生物类黄酮含量的原料资源的有限。
我们提供的原料与研究的技术,可以弥补以上的不足,首先,我们用于生产生物类黄酮的原料为我国南方的桑树林(桑葚) 资源丰富，分布很广，桑葚的开发利用前景十分广阔。这种桑葚,利用的资源巨大,将低价的桑葚迅速转化为系列产品，潜力是巨大的。这样不仅能为桑农增加经济收入，为国家创造更多的财富，而且能满足市场对桑葚保健食品的需求，取得很好的经济效益和社会效益。桑葚及其制品已在我国南京、上海、杭州等大城市上市，很受消费者欢迎。由此可见,不存在原料不足和原料价格昂贵的问题;其次,如果工艺全自动化,实现产品工业化生产,可以说,未来的产品不仅具有非常理想的市场而且更具有令人满意的利润空间。传统的生物类黄酮制取工艺生产周期长,生产成本重,从原料成本分析,大大加重企业负担,桑葚本身就是一种药材,而且营养价值很高,含维生素,氨基酸,矿质元素等含量丰富.采用桑葚,节省成本,另一方面,也给农民带来一定的经济收入。
2 实验部分
2.1 主要材料和试剂
2.1.1 原材料
桑葚（摘自浙江科技学院小和山南麓）
2.1.2 实验仪器
压榨机 （上海赛康电器有限公司）
电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）
集热式恒温加热磁力水浴锅 DF-101S （巩义市予华仪器有限责任公司）
数显恒温水浴锅 HH-6 （常州澳华仪器有限公司）
玻璃层析柱 （3.0*30cm）
UV-7504C紫外可见分光光度计 （上海欣茂仪器有限公司）
旋转蒸发器RE-52（上海亚荣生化仪器厂）
2.1.3 材料与试剂
芦丁标准品 (南京替斯艾么中药研究所)
D-101,DM130,DM301大孔吸附树脂（上海摩速科学器材有限公司）
D-101-I大孔吸附树脂 （杭州汇华树脂有限公司）
氢氧化钠（浙江中星化工试剂有限公司）分析纯
无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂）分析纯
石油醚（60-90目）（杭州大华化学试剂厂）分析纯
亚硝酸钠（杭州高晶精细化工有限公司）分析纯
硝酸铝均（杭州高晶精细化工有限公司）分析纯
2.2 实验方法
2.2.1 桑葚中总黄酮的提取[6]-[9]
将桑葚原料用压榨机压榨，用石油醚提取，静置，去除石油醚部分；将上述剩余部分用50-90%的乙醇作为提取剂，55℃-75℃水浴回流提取3次，提取液静置，过滤，滤液经减压回收乙醇得浓缩液；浓缩液用酸调节pH值到微酸性；加入无机盐使溶液的无机盐含量为3%-6%左右；上样液过非极性大孔吸附树脂柱层析进行吸附；先用去离子水淋洗柱体积，再用50%-80%的乙醇淋洗大孔树脂，进行解吸附，淋洗液经减压回收乙醇，真空干燥即得产品。
2.2.2 总黄酮含量测定
2.2.2.1 芦丁标准曲线的制备[10]:
精密称取芦丁标准品20.0mg，加无水乙醇溶解后定容到100.0ml。分别准确移取上述溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml；然后各加5%的NaNO2 1.0ml，静置6min；再各加10%Al(NO3)3溶液1.0ml，静置6min；最后各加1mol/LNaOH溶液10.0ml，并以水定容至刻度。在510nm 波长下，以试剂空白为参比，测定不同浓度芦丁溶液的吸光度A。对A与芦丁浓度C（ug/ml）进行线性回归处理，当芦丁浓度在8-48 ug/ml范围内时，线性回归方程为：A=0.0121C-0.0019，R2=0.9999。以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标进行回归，绘制标准曲线。如下图1
表1 标准芦丁溶液—吸光度
标样编号 1 2 3 4 5 6 7
芦丁浓度(g/ml) 0.0000 0.008 0.016 0.024 0.032 0.040 0.048
吸光度(A) 0.000 0.094 0.194 0.289 0.386 0.487 0.579
图1 芦丁标准曲线图
2.2.2.2 样品含量测定
取待测品2份，减压浓缩至干，用乙醇溶解，按“标准曲线的制备”项下测定样品络合前后的差示吸光度值，平行测定三次，取平均值，然后用标准曲线方程计算样品中总黄酮类成分的含量[11]。
3 结果与讨论
3.1 单因素实验
3.1.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
在20g样品中，分别加入200ml不同浓度的乙醇，60℃恒温水浴中，提取2小时后，抽虑，旋转蒸发，最后将溶液定容至50ml，在510nm下测其吸光度A值。得出图2，总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系。
表2总黄酮提取率与乙醇浓度之间的关系
乙醇浓度(%) 提取率(g/kg)
0 1.14
20 1.92
40 2.12
60 2.37
80 2.45
100 2.38
图2.乙醇浓度对提取率的影响
从图中的曲线趋势可以明显看出乙醇的提取效果以80％左右的浓
度最好，随着乙醇浓度的增加，总黄酮的提取率先上升然后在80％左右达到最高，而后下降。结合图2，因此确定乙醇浓度在60％-90％之间比较合适。
3.1.2 提取温度对总黄酮提取率的影响
在20g的样品中，加入200ml的80％乙醇，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴中，提取2小时后，抽虑，旋转蒸发，最后将溶液定容至50ml，在510nm下测其吸光度A值，得出图3，总黄酮提取率与提取水浴温度的关系。
表3 总黄酮提取率与水浴提取温度之间的关系
提取温度(℃) 提取率(g/kg)
30 2.19
40 2.26
50 2.38
60 2.45
70 2.53
80 2.5
图3.提取温度对总黄酮提取率的影响
从图中的曲线趋势可以明显看出提取率随着提取温度的增加也不断的提高，然后也随之下降，但是温度过高会将其中的活性成分易被破坏，杂质的溶出量增加，给提纯带来不便，成本加大，也造成溶剂损失。所以综合各方面因素考虑，提取温度在50℃-80℃之间会比较适合。
3.1.3 料液比对总黄酮提取率的影响
在20g样品中，分别加入100ml、150ml、 200ml、300ml 80％乙醇，60℃恒温水浴中，取2小时后，抽虑，旋转蒸发，最后将，溶液定容至50ml，在510nm下测其吸光度A值，得出图4，总黄酮提取率与料液比的关系。
表4 总黄酮提取率与料液比之间的关系
料液比 提取率(g/kg)
10 2.33
15 2.4
20 2.45
30 2.47
图4 料液比对总黄酮提取率的影响
从图中的曲线趋势可以明显看出提取率在料液比1:10～1:20时，随着料液比的增加，提取率也较快得增加，但当料液比大于1:20后，提取率增加不大。因此将料液比控制在1:10～1:20之间提取结果会比较理想。从提取效果，减少溶剂用量等方面综合考虑，用量不宜过大，所以最好是将料液比控制在1:10～1:20之间较合适。
3.1.4 提取时间对总黄酮提取率的影响
在20g样品中，加入200ml的80％乙醇，60℃恒温水浴中，分别提取1小时，1.5小时，2小时，3小时后，抽虑，旋转蒸发，最后将溶液定容至50ml，在510nm下测其吸光度A值，得出图5，总黄酮提取率与提取时间的关系。
表5 总黄酮提取率与提取时间之间的关系
提取时间(h) 提取率(g/kg)
1 2.35
1.5 2.41
2 2.45
3 2.48
图5.提取时间对总黄酮提取率的影响
从图中的曲线趋势可以明显看出提取率随着提取时间的增加也不断的提高，增幅不大，但是随着提取时间的增加，料液中的杂质也不断的分解出来，这样就会影响提取的效果，因此也不是提取时间越长对提取效果越好，通过实验分析及考虑时间效益，可以将提取时间确定为1小时～2小时之间。
3.2 总黄酮提取正交实验结果与分析[12]-[13]
提取工艺条件的正交试验设计以及桑葚中生物类总黄酮含量的提取采用乙醇提取法提取桑葚中总黄酮效果较好，为了进一步找出乙醇提取法提取的最佳试验条件，根据前人的实验结果和文献分析，我们选择了水浴提取温度、提取时间、乙醇浓度、料液比四个因素进行正交实验设计。根据前面的单因素实验结果分析，水浴提取温度定在50℃-80℃为较佳的条件，提取时间在1h-2h为佳,乙醇浓度在60%-90%为较佳的条件，定料液比1:10-1:20为较佳的条件，实验因素水平见下表6：
表6 实验因素水平表
水平\因素 提取温度(℃) 提取时间(h) 乙醇浓度(%) 料液比
1 55 1 60 1:10
2 65 1.5 75 1:15
3 75 2 90 1:20
采用正交表进行实验，以总黄酮得率为考察指标，测定总黄酮含量。
表7 正交实验结果
序号 提取温度(℃) 提取时间(h) 乙醇浓度(%) 料液比 吸光度（A） 提取率(g/kg)
1 55 1 60 1:10 0.298 2.25
2 55 1.5 75 1:15 0.315 2.38
3 55 2 90 1:20 0.312 2.35
4 65 1 75 1:20 0.323 2.44
5 65 1.5 90 1:10 0.317 2.39
6 65 2 60 1:15 0.314 2.37
7 75 1 90 1:15 0.330 2.5
8 75 1.5 60 1:20 0.321 2.42
9 75 2 75 1:10 0.339 2.56
K1 6.98 7.19 7.04 7.20
K2 7.20 7.19 7.38 7.25
K3 7.48 7.280 7.24 7.21
k1 2.327 2.397 2.347 2.400
k2 2.400 2.397 2.460 2.417
k3 2.493 2.427 2.413 2.403
极差 0.166 0.030 0.113 0.017
最佳条件 A3 B3 C2 D2
正交实验效应曲线图
由表7可知，在正交实验设计的范围内，最佳的实验方案为A3B3C2D2,即水浴提取温度为75℃，乙醇浓度为75％，提取时间为2h，料液比为l:15。由表7极差分析可以得出，影响总黄酮提取得率因素的主次顺序为ACBD，即水浴温度>乙醇浓度>提取时间>料液比。提取桑葚总黄酮的最佳工艺条件为A3C2B3D2，即水浴温度为75℃，乙醇浓度为75％，提取时间为2h，料液比为l:15。此条件下测得桑葚总黄酮的提取率约为2600mg/kg。
3.3 四种树脂静态吸附与解吸
3.3.1 四种树脂静态吸附
分别量取大孔吸附树脂D-101、D-101-I,DM130，DM301各5g经过（预处理、水溶胀体积)置锥形瓶中，各加入上述制备的提取液80mL，每份树脂加20ml提取液，浸泡24 h，充分吸附后，过滤，用少量蒸馏水淋洗树脂，将滤液与淋洗液合并，作为吸附残液。分别测定各树脂吸附残液以及树脂吸附前样品的差示吸收光谱，树脂吸附量由下式计算[14]-[15]:
吸附量 =
3.3.2 四种树脂静态解吸
将静态吸附后滤出的树脂分别用80％的乙醇60 mL浸泡24 h，充分解吸后过滤，用少量80％的乙醇冲洗树脂，合并人滤液中。测定滤液的吸收光谱，树脂解吸量、解吸率[16]由下式计算：
解吸量
解吸率=
不同型号树脂对桑葚总黄酮的吸附—解吸性能
大孔吸附树脂D-101、D-101-I、DM130、DM301对桑葚总黄酮的静态吸附和静态解吸效果见表8。
表8 不同型号树脂吸附—解吸性能的结果比较
树脂型号 吸附量（mg/g） 解吸量（mg/g） 解吸率（%）
D-101 6.90 6.32 91.6
D-101-I 6.77 5.92 87.4
DM130 6.866 5.56 80.9
DM301 6.65 6.07 91.2
从表8中数据可以看出，三种树脂的吸附量D-101> DM130> D-101-I> DM301，但是解吸量和解吸率是：D-101> DM301> D-101-I> DM130，经综合考虑D-101树脂的吸附—解吸性能较好，故以下对吸附条件优化选择D-101树脂。
3.3.3 四种大孔吸附树脂的相关参数
表9 四种大孔树脂的相关参数
型号 直径/mm 表面积/ m2*g-1 平均孔径/A 外观 极性
D-101 0.3-1.25 ≥400 90-100 乳白色 非极性
D-101-I 0.3-1.25 ≥600 90-120 乳白色 极性
DM130 0.3-1.25 ≥500 130-140 乳白色 弱
极性
DM301 0.3-1.25 ≥330 90-100 乳白色 中极性
3.4 大孔吸附树脂分离纯化实验分析
3.4.1 pH值对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响
准确量取60mL提取液5份，每份树脂加12ml提取液，一份不凋pH值，另外4份分别调pH值至3.0，4.0、6.0，7.0，制成pH值为3.0、4.0、5.5(原液)、6.0、7.0的5份溶液，温度都为室温（25℃），加入14 mL D-101树脂，静态吸附24 h，过滤，并用少量水淋洗树脂，合并滤液及淋洗液，得到不同pH值的吸附残液，测定吸收光谱，按以上方法计算吸附量[11]。
表10 pH值对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响
序号 上样液pH值 吸附量(mg/g)
1 3.0 3.370
2 4.0 3.365
3 5.5(原液) 3.326
4 6.0 3.075
5 7.0 2.956
图6 pH值对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响
图6显示pH约为3.0-4.0时，D-101树脂吸附黄酮类化合物能力可被显著提高。吸附能力提高的原因可能是由于在pH约为3.0-4.0时，黄酮类化合物主要以游离分子状态存在，在此分子状态下非极性大孔吸附树脂D-101可有效地吸附溶质分子。
3.4.2 无机盐浓度对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响
准确量取48 mL提取液4份，每份树脂加12ml提取液，一份不加无机盐（NaCl），另一份加NaCl,使溶液中NaCl浓度为3%，一份浓度为6%，一份浓度为10%，四份份pH都调到4.0，温度都为室温（25℃），静态吸附24 h，过滤，并用少量水淋洗树脂，合并滤液及淋洗液，测定吸收光谱，按以上方法计算吸附量。
表11 无机盐浓度对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响
序号 （NaCl)浓度（%） 吸附量(mg/g)
1 原液（不加 (NaCl）) 3.365
2 3（%） 3.564
3 6（%） 3.573
4 10（%） 3.578
图7 无机盐浓度对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响
图7显示加入无机盐NaCl浓度时，D-101树脂吸附总黄酮类化合物能力可被显著提高。但随着NaCl浓度的增长，总黄酮吸附量增长速度相差不大。综合各方面分析，因此选取无机盐NaCl浓度为3%-6%比较合适。
3.4.3 温度对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响
准确量取60mL提取液5份，每份树脂加12ml提取液，一份为室温25℃，另外三份分别使水浴温度为40℃，50℃，60℃，70℃，五份pH都调到4.0，静态吸附24 h，过滤，并用少量水淋洗树脂，合并滤液及淋洗液，测定吸收光谱，按以上方法计算吸附量[17]。
表12 温度对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响
序号 温度（℃） 吸附量(mg/g)
1 室温（25℃） 3.365
2 40 3.452
3 50 3.503
4 60 3.396
5 70 3.388
图8 温度对D-101树脂吸附桑葚总黄酮能力的影响
图8显示，吸附量随着温度的提高也随之增加，然后下降，以上数据显示，50℃时，D-101树脂吸附的产量最多，所以吸附效果较佳的吸附水浴温度为50℃。
3.4.4 乙醇洗脱剂浓度对解吸率的影响
一般地，对于非极性树脂，洗脱剂的极性越小，洗脱力越强。本实验选择了乙醇水溶液作为洗脱剂，比较不同浓度的乙醇水溶液的洗脱效果，通过考察解吸量来确定洗脱溶剂[18]。
表13 乙醇洗脱剂浓度对D-101树脂解吸桑葚总黄酮能力的影响
序号 乙醇浓度（%） 解吸量(mg/g)
1 20 2.568
2 30 2.625
3 40 2.686
4 50 2.954
5 60 2.841
6 70 2.827
7 80 2.850
8 90 2.833
图9 乙醇洗脱剂浓度对D-101树脂解吸桑葚总黄酮能力的影响
图9显示，解吸量随着乙醇浓度的提高也随之增加，然后下降，以上数据显示，50％的乙醇水溶液洗脱的总黄酮产量最多，所以洗脱效果较佳的乙醇浓度是50％。
3.4.5 乙醇的洗脱速率对解吸率的影响[19]
将总黄酮的样品溶液100ml 5份，分别上柱，完全吸附后，先用去离子水进行洗柱，然后分别用3倍柱体积50%的乙醇分别以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml/min的速率进行洗脱，收集洗脱液测定总黄酮含量，计算解吸出的总黄酮的解吸率，结果见图10
表14 乙醇洗脱速率对解吸率的影响
序号 乙醇洗脱速率（ml/min） 解吸率 (%)
1 0.5 88.65
2 1 86.37
3 2 78.39
4 3 70.88
5 4 65.72
图10 乙醇的洗脱速率对解吸率的影响
乙醇的洗脱速率越快解吸率越低，因此洗脱时宜慢不宜快，当考虑洗脱速率小则洗脱时间长，故选择洗脱速率则要根据解吸率及时间综合考虑，图10中可以看出，当洗脱速率为0.5ml/min时洗脱效果较好，而洗脱速率为1.0ml/min时洗脱效果也相差不大，因此洗脱速率以0.5-1.0ml/min为最佳洗脱速率。
3.4.6 乙醇洗脱用量对解吸率的影响
将总黄酮样品的溶液100ml 5份，分别上柱，完全吸附后，再用去离子水进行洗柱，然后分别用1倍柱体积、2倍柱体积、3倍柱体积、4倍柱体积、5倍柱体积50%的乙醇以1.0ml/min的速率进行洗脱，收集洗脱液测定黄酮含量，计算解吸出的总黄酮的解吸率，结果见图11
表15 乙醇洗脱用量对解吸率的影响
序号 乙醇洗脱用量（柱体积数） 解吸率 (%)
1 1 65.78
2 2 80.29
3 3 86.37
4 4 87.55
5 5 88.48
图11 乙醇洗脱用量对解吸率的影响
从图11中可以看出，当乙醇的洗脱用量达到3倍柱体积数时，解吸率接近90%，超过3倍柱体积时，解吸率基本不增加。因此，乙醇的最佳洗脱用量为3倍柱体积数。
3.5 大孔树脂的预处理与强化再生
3.5.1 大孔树脂的预处理
商品树脂均残留惰性溶剂，故使用前根据应用需要，必须进行不同深度的预处理，在提取器内。加入高于树脂层10-20厘米的无水乙醇浸泡3-4小时，然后放净洗涤液，为一次提取过程。用同样方法反复洗涤至出口洗涤液在试管中加3倍量水不显浑浊为止，后用清水充分淋洗至无明显乙醇气味，即可进行一般使用。净品树脂已作深度处理，可直接使用，或按前款3项执行。
3.5.2 大孔树脂的强化再生
当大孔树脂正常使用一定周期后，吸附能力降低或受急性严重污染时，需要强化再生处理，其方法是加入高于树脂层10-20厘米的3%-5%盐酸溶液浸泡2-4小时后，用同样浓度5-7倍体积量盐酸溶液淋洗，再用纯水充分淋洗，直至出口洗涤液PH值呈中型，然后以5%氢氧化钠溶液按以上方法浸泡2-4小时，并用同样方法淋洗至通 完5-7倍体积量氢氧化钠溶液，再用水充分淋洗直至出水PH值呈中型，即可再次投入使用。树脂强化再生还需根据污染程度，酌情加减酸、碱浓度及用量[20]。
3.6 小结
选用D-101大孔吸附树脂可有效地从桑葚中提取生物类总黄酮类有效成分，提取的最优
条件，即：以75%乙醇为提取剂，提取水浴温度75℃，提取料液比为1:15 ，提取时间为2 h；较优的分离纯化条件为：待分离样品溶液pH值调至3.0-4.0左右，无机盐（Nacl）的浓度为3%-6%，吸附水浴温度为50℃，洗脱最佳溶剂为50％的乙醇溶液，洗脱最佳速率0.5-1.0ml/min，洗脱最佳用量为3倍柱体积。用上述提取，吸附、分离纯化条件后得到生物类总黄酮的提取率可以达到 2600mg/kg（以芦丁计）,生物类总黄酮的含量接近50％。方法对桑葚中总黄酮工业化生产具有一定的应用价值。总的说来，本文在实验方法上简单易操作，提取率高，实验的重复性好。如果能将这些实验应用到生产实践中，使桑葚能够得到更好的利用，具有一定的实际意义。但在实际应用中还有许多实际问题，还需进一步扩大实验水平，对工艺条件进一步细化优化，进一步提高提取率，简化生产工艺，使得人们能够更有限的利用一些资源。
4 总结与展望
全球对植物提取物制品的需求量日益增多，全球植物药市场2006年产值将突破350亿美元，近年来上市的保健产品中，很大一部分其主要功效成分都属于黄酮类化合物，涉及功能食品的许多方面，如防衰、防癌、提高免疫力、降脂、降压食品等，由于黄酮具有防治心脑血管疾病、防癌抗癌等药理作用，许多国家正在开发相关产品，前景十分看好。本实验所采用的方法简单，能建立实验室小型工艺，药品，试剂等也容易购得，当然本实验也存在一些问题，但通过以后的研究一定可以得以改善，得出更优良的方案。另外在黄酮新产品开发和利用中，前景十分看好。现代市场上无论是国内还是国外对生物类黄酮的提取的原料主要是大豆类与蔬菜类物质，但到目前为止，从桑葚中提取生物类总黄酮的研究还没有报导，。研究表明，现在农村对桑葚浪费比较严重，一般都作废弃处理，或者到市区以水果类廉价卖出，但是如果把这部分资源利用起来，市场前景是广阔的，同时也为黄酮的提取提供了一个新的途径。据调查，桑葚中含黄酮量为0.41%，主要为芦丁，槲皮素与花青素，桑葚中含有丰富的生物类黄酮，因而从桑葚中提取生物类黄酮可能会具有广阔的市场前景，同时也是制备与提取生物类黄酮的又一种方法。由于生物类黄酮在特定方面有着显著的作用与疗效，黄酮受到越来越多人的重视与发展生产。而且，现在的黄酮提取主要是大豆类物质与蔬菜类物质，且形式比较单一。桑葚在江浙地区及南方都有生长，这部分资源一直都没很好利用起来，如果利用起来，可节省生产成本所以开发这个项目具有较好的产业化市场前景。我们用于生产生物类黄酮的原料为我国南方的桑树林(桑葚) 资源丰富，分布很广，桑葚的开发利用前景十分广阔。,这种桑葚,利用的资源巨大,将低价的桑葚迅速转化为系列产品，潜力是巨大的。这样不仅能为桑农增加经济收入，为国家创造更多的财富，而且能满足市场对桑葚保健食品的需求，取得很好的经济效益和社会效益。桑葚及其制品已在我国南京、上海、杭州等大城市上市，很受消费者欢迎。由此可见,不存在原料不足和原料价格昂贵的问题;其次,如果工艺全自动化,实现产品工业化生产,可以说,未来的产品不仅具有非常理想的市场而且更具有令人满意的利润空间。传统的生物类黄酮制取工艺生产周期长,生产成本重,从原料成本分析,大大加重企业负担,桑葚本身就是一种药材,而且营养价值很高,含维生素,氨基酸,矿质元素等含量丰富.采用桑葚,节省成本,另一方面,也给农民带来一定的经济收入。
致谢
首先感谢我的导师黄俊老师，首先我觉得他是一个很亲近的人，平易近人，很乐于和学生谈心，对工作严谨细致、一丝不苟，我的毕业设计刚上去，他就晚上修改了一下，第二天把一些错误的跟我详细讲解，也教了我做事的态度和做人的态度，在此我再次深表感谢。虽然充分考虑到了实验过程中困难以及失败，但是不免因此而沮丧和失落，感谢指导老师黄俊老师帮助及时纠正错误与调整研究方法，解决各种困惑；感谢我的同学在精神和物质上的帮助，实验的进度和各位的关心帮助是分不开的。再次感谢我的导师黄俊老师，回首四年，转瞬即过，以后将要踏上社会岗位，同学们都要各奔东西了，真的希望大家一路走好，记住我们在一起的日子。最后感谢我的母校浙江科技学院，还有所有帮助我的朋友们，谢谢！
沈智翔
二OO九年六月四日
于杭州
参考文献
[1] 胡静丽,陈健初.杨梅叶黄酮类化合物最佳提取工艺研究[J].食品科学,2003,24(1):96-99
[2] 刘成梅,游海.天然产物有效成分的分离与应用[M].北京:化学工业出版社.2003
[3] Common cosmetic hydrophilic ingredients as penetration modifiers of flavonids .International Journal of Cosmetic Science,2002,24:357-366
[4] 茉莉.甜润桑葚酒[J].中外食品工业,贝太厨房,2008,5(6):94-95
[5] 亦非.桑葚探秘[J].食品与药品学报,2007,7(10):8-9
[6] 许琦.芹菜总黄酮的提取及含量测定[J].食品科技学报, 2006,31(7):241-243
[7] 高中松,彭密军,高亮,曾吉恒,朱华文.桑叶黄酮的提取分离纯化研究[J]. 安徽农学通报,2005,11(6):48-50
[8] 山楂叶和山楂果中总黄酮的提取与检测方法[J].《职业与健康》,2007,23(10):815-816
[9] 李红,张元湖.苹果果实中总黄酮的提取方法优化研究[J].山东农业大学学报(自然科学版),2003,34(4):471-474
[10] 柳伟,韩凤梅.大孔树脂对金莲花总黄酮的分离纯化研究[J].中药研究, 2007,35(2):42-44
[11] 薛淑萍,张立伟.大孔吸附树脂提取,分离桑叶总黄酮的条件优化[J].山西中医学院学报,2006,7(1):51-52
[12] 周晓丽,邵震,逯家辉.木瓜黄酮的提取及抗氧化性研究[J].食品工业科技, 2007,28(8):170-172
[13] 王立娟.桔皮总黄酮的提取条件[J].东北林业大学报,2006,34(5):70-72
[14] 李志洲,刘军海.草莓中黄酮的提取及其抗氧化性研究[J].食品研究与开发,2007,28(7):31-34
[15] 倪学文,吴谋成.大孔吸附树脂提取纯化银杏酚酸的研究[J]中草药,2003，34(3):231-233
[16] 邹节明,陆浩,何斌.苦玄参,黄芩与黄柏的大孔树脂提取研究[J].中草药,2003,34(3):222-226
[17] 叶玉萍,郁建平,都国栋.桑叶黄酮化合物的大孔树脂的纯化工艺[J].(贵州师范大学)自然科学报,2007,25(2):95-99
[18] 陈乃富,陈科,张莉,杨怀志.大孔树脂柱层析法纯化金樱子总黄酮的初步研究[J].中药材学报,2007,30(8):1013-1016
[19] 陈乃富,张莉,韩邦兴,谷仿丽,何永松.大孔树脂柱层析法纯化蕨菜总黄酮的工艺条件研究[J].食品与发酵工业,2007,34(4):141-144
[20] 李源君,姜成忠,吴宝财.中药纯化过程中大孔树脂的预处理与再生[J].黑龙江科技信息,2004,11(1):200
