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培哚普利对U937泡沫细胞血管内皮生长因子表达的

2015-07-04 10:00 来源:学术参考网 作者:未知

【摘要】 目的:研究培哚普利对氧化修饰的低密度脂蛋白(oxldl)诱导的u937泡沫细胞血管内皮生长因子(vegf)mrna、蛋白表达的影响。方法: u937细胞与80 μg/ml oxldl孵育48 h,建立u937泡沫细胞模型,以不同浓度的培哚普利(0.01、0.10、1.00 μmol/l)预处理u937细胞24 h再加入80 μg/ml 的oxldl孵育48 h,通过逆转录聚合酶链式扩增反应(rtpcr)和酶联免疫吸附试验(elisa)分别检测u937细胞vegf mrna和蛋白的表达情况。 结果: u937泡沫细胞组vegf mrna的表达较u937细胞对照组明显增加[(2.371±0.253)vs(0.954±0.245)(p<0.01)],培哚普利干预后,随着浓度(0.01、0.10、1.00 μmol/l)的增加,u937泡沫细胞的vegf mrna表达水平呈浓度依赖性下降[(2.168±0.270)vs(1.533±0.248)vs(1.022±0.189)(p<0.01)];u937泡沫细胞组vegf蛋白表达较u937细胞对照组明显增加[(1 804.18±177.59) pg/ml vs (716.19±60.82) pg/ml(p< 0.01)],培哚普利干预后,随着浓度(0.01、0.10、1.00 μmol/l)的增加,u937泡沫细胞vegf蛋白表达呈浓度依赖性降低(1 601.46±154.68) pg/ml vs (1 377.09±110.36) pg/ml vs (1 017.89±147.18) pg/ml(p<0.01)]。wWw.133229.coM结论: 培哚普利能够浓度依赖性地下调oxldl诱导的u937泡沫细胞vegf mrna、蛋白的表达。

【关键词】 培哚普利;泡沫细胞;血管内皮生长因子

[abstract] objective: to study the expression of vascular endothelial growth factor (vegf) induced by oxidized low density liprotein (oxldl) and the inhibitory effects of perindopril on the levels of vegf protein and mrna in the u937 foam cells.methods: the u937 cells were incubated with oxldl 80 μg/ml for 48 h and a macrophagederived foam cell model was established. the medium was pretreated with perindopril (0.01、0.1、1 μmol/l) for 24 h , incubated with oxldl 80 μg/ml for 48 h.reverse transcriptionpolymerase chain reaction(rtpcr) and enzymelinked immuneosorbent assay (elisa) were applied to determine the expression of vegfprotein and mrna in u937 cells and treated u937 cells.results: vegfmrna levels in u937 cells after incubation with oxldl 80 μg/ml increased significantly compared with control cells(foam cells vs control cells, 2.371±0.253 vs 0.954±0.245, p<0.01).after treated with perindopril(0.01、0.10、1.00 μmol/l), vegf protein levels were concentrationdepently attenuated(foam cells vs perindopril treated cells, 2.371±0.253 vs 2.168±0.270、1.533±0.248、1.022±0.189, p<0.01). vegf protein levels in the medium after incubation with oxldl 80 μg/ml increased significantly compared with control cells(foam cells vs control cells , 1 804.18±177.59 pg/ml vs 716.19±60.82 pg/ml, p<0.01).after treated with perindopril(0.01, 0.10, 1.00 μmol/l), vegf protein levels were concentrationdepently attenuated(foam cells vs perindopril treated cells, 1 804.18± 177.59 vs 1 601.46±154.68 pg/ml, 1 377.09±110.36 pg/ml, 1 017.89±147.18 pg/ml, p<0.01). conclusion: perindopril can signifantly attenuated vegf mrna and protein expression in foam cells.

[key words] perindopril ; foam cells ; vascular endothelial growth factor

动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)是常见的危害严重的心血管疾病。泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞,一般认为在动脉粥样硬化形成的早期,血液中的单核细胞进入内皮下间隙,在内膜下被激活后分化为巨噬细胞,后者主要通过清道夫受体无反馈性下调地吞噬大量氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxldl),导致细胞内脂质堆积,形成泡沫细胞。研究表明斑块内巨噬泡沫细胞分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,vegf)可促进斑块内血管新生(angiogenesis),而血管新生与斑块的生长、破裂、出血及血栓形成关系密切[1]。本研究通过氧化低密度脂蛋白诱导体外培养的人单核/巨噬细胞系u937细胞成泡沫细胞,观察vegf在泡沫细胞中的表达情况及培哚普利对其表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人单核/巨噬细胞系u937细胞(上海午立生物技术有限公司),培哚普利(天津施维雅制药有限公司),胎牛血清(杭州四季青公司),低密度脂蛋白(ldl,中国医学科学院基础研究所),trizol试剂(invitrogen公司),逆转录试剂盒(晶美公司),taq酶、10×pcr反应缓冲液、dntps、6×溴酚蓝上样缓冲液、dna marker(takara公司),vegf酶联免疫吸附试验(elisa)检测试剂盒(r&d systems公司)。

海南医学院学报 vol.15 no.1 feb.20091.2 ldl的氧化修饰

取0.9 mg/ml的ldl 1 ml放入0.01 mol/l的pbs 100 ml(ph 7.4)中4 ℃透析24 h,以除去离心过程中所加的抗氧化剂,用pbs将ldl稀释至蛋白浓度为0.5 mg/ml,放入新鲜配制的含10 μmol/l cuso4 的pbs溶液中37 ℃孵育氧化12~24 h,然后放入含1 μmol/l edta的pbs(ph 7.4)中4 ℃透析24 h,以终止氧化还原反应。测定oxldl丙二醛( mda)的含量为31.97 nmol/l(mda药盒),鉴定其氧化修饰程度。将制备好的oxldl以0.22 μm滤膜过滤除菌,4 ℃保存。将上述最终反应物用无血清无酚红1640定容至9 ml,配制成80 μg /ml的oxldl溶液备用。

1.3 u937泡沫细胞模型的建立和分组

将人单核/巨噬细胞系u937细胞悬浮生长于含10% 胎牛血清的rpmi 1640培养液中,放入37 ℃、5% co2培养箱中培养,2 d换液传代一次,至细胞密度达1.0×109个/ l,将培养细胞分为u937细胞对照组、u937泡沫细胞组及3种剂量的药物干预组。u937细胞对照组:u937细胞中除加rpmi 1640培养液外,不加其它任何药物;u937泡沫细胞组:rpmi 1640洗2遍,换入无血清的rpmi 1640培养液中,同时加入oxldl至终浓度80 μg/ml培养48 h,使u937细胞泡沫化。药物干预组:u937细胞用rpmi 1640洗2遍后分别加入0.01、0.10、1.00 μmol/l 不同浓度的培哚普利液中,在温箱中37 ℃温育24 h,再加入浓度80 μg/ml的oxldl孵育 48 h。处理后的各细胞组及亚组分别采用逆转录聚合酶链式扩增反应(rtpcr)方法检测细胞vegf mrna表达及elisa方法检测细胞上清液vegf蛋白水平,每组重复检测6次。

1.4 u937泡沫细胞油红o染色

收集细胞低速离心制成细胞悬液,涂于干净的被有1%明胶的玻片上,自然晾干。在4%的甲醛中固定12 h 后以新鲜配制的0.3% 油红o染色20 min,再以氧化苏木精衬染2 min,然后以丙酮脱水1~2 s后pvp封片。各步骤间均用双蒸水冲洗干净。胞浆内出现红染颗粒的为脂质染色阳性。

1.5 rtpcr检测细胞vegf mrna的表达

采用逆转录试剂盒以trizol试剂一步法抽提细胞rna并定量,各样本均加入总rna 2 μg,逆转录合成第一链cdna。cdna扩增聚合酶链反应,引物:vegf上游 5′ggacatcttccaggagta3′,下游5′tgcaacgcgagtctgtgt3′,扩增产物356 bp;内参βactin 上游5′atcgtgcgtgacattaagg 3′, 下游5′acaggactccatgcccagg3′,扩增产物195 bp。逆转录酶链反应条件:94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35个循环。反应完成后用含有5 mg/l 溴化乙锭的1.5 % 琼脂糖凝胶对rtpcr反应产物进行电泳,用数字成像系统进行分析和拍照。

1.6 elisa检测细胞上清液vegf蛋白水平

采用双抗体夹心法,按照试剂盒操作步骤,以rpmi 1640培养液为空白对照,将不同浓度的vegf标准品(2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.5 pg/ml),在酶标仪上波长为450 nm波段测定光密度值,以vegf标准品浓度为横坐标、光密度值为纵坐标进行直线相关回归,根据待测标本的光密度值在直线上查出相应的vegf蛋白水平。

1.7 统计学处理

所有计量资料均用均数±标准差(±s)表示,采用spss 11.0统计软件,数据处理用单因素方差分析,检验水准a= 0.05。

2 结果

2.1 u937泡沫细胞模型的建立

u937细胞长至1×106/ml后用80 μg/ml的oxldl刺激48 h,油红o染色后光镜下可见细胞胞浆内存在大量的脂滴,符合泡沫细胞的形态特征, u937泡沫细胞模型建立。

2.2 u937细胞vegf mrna表达的变化

oxldl刺激u937细胞48 h成为u937泡沫细胞后,vegf mrna的表达较u937细胞对照组明显增加(p<0.01)。采用不同浓度的培哚普利干预u937泡沫细胞后,其vegf mrna表达水平呈浓度依赖性下降,较u937泡沫细胞组差异有统计学意义(p<0.05~0.01),不同浓度培哚普利组间差异亦有统计学意义(p<0.01)(表1)。不同浓度培哚普利处理u937细胞后rtpcr检测vegf mrna的结果见图1。

2.3 u937细胞上清液vegf蛋白水平的变化

与u937细胞对照组相比,u937泡沫细胞组vegf蛋白表达水平增加了1.52倍,差异有统计学意义(p<0.01)。采用不同浓度的培哚普利干预u937泡沫细胞后,vegf蛋白水平呈浓度依赖性下降,较u937泡沫细胞组差异有统计学意义(p<0.05~0.01),不同浓度培哚普利组间差异亦有统计学意义(p<0.01)(表2)。表1 各组u937细胞vegf mrna表达的变化注:与u937细胞对照组比较,*p< 0.01;与u937泡沫细胞组比较,#p<0.05,▲p<0.01;与0.01 μmol/l培哚普利组比较,■p<0.01;与0.10 μmol/l培哚普利组比较,△p<0.01。 表2 各组 u937细胞上清液vegf蛋白水平 的变化 注:与u937细胞对照组比较,*p<0.01;与u937泡沫细胞组比较,#p<0.05,▲p <0.01;与0.01 μmol/l培哚普利组比较,■p <0.01;与0.10 μmol/l培哚普利组比较,△p<0.01。

3 讨论

研究表明, oxldl是动脉粥样硬化的独立危险因子,在动脉粥样硬化过程中起着关键作用[2]。oxldl作为氧化信号使巨噬细胞中接受氧化物成分的转录因子激活,刺激包括vegf在内的一系列细胞因子及生长因子表达,诱导单核细胞粘附于动脉内皮并分化为巨噬细胞,巨噬细胞清道夫受体大量摄取oxldl而不受胞内胆固醇含量的影响,导致体内胆固醇蓄积,最终促进单核/巨噬细胞转变为泡沫细胞,无疑促进了动脉粥样硬化的发生[3,4]。泡沫细胞的形成贯穿了动脉粥样硬化发生、发展的整个过程,泡沫细胞分泌的炎性细胞因子和生长因子对于斑块的稳定性有重要的作用 。

vegf与斑块内的血管新生有密切关联。vegf是ferrara等[5]从脑垂体滤泡星状细胞培养液中提取的一种能与肝素结合的二聚体糖蛋白,这种蛋白对血管内皮细胞有特异性分裂增殖的作用。vegf作为一种特异的内皮细胞丝裂原分裂蛋白,可引起血管系统和一系列病理过程,包括肿瘤生长、伤口愈合和糖尿病视网膜病变的发展[6]。vegf在正常血管上无表达,但主要存在于人动脉粥样硬化损害部位,在早期动脉粥样硬化损害中,vegf多存在于内皮下巨噬细胞丰富的部位。在粥样斑块中,检测到vegf存在于由脂质丰富的巨噬细胞组成的粥样损害中央和主要由平滑肌细胞组成的斑块基底部[1]。celletti等[7]将新西兰大白兔高脂喂养3个月,单独肌肉内注射vegf,7~21 d后取兔胸主动脉进行形态学和免疫组化分析,发现注射vegf组兔的平均斑块面积、斑块周长、最大斑块厚度、内皮密度(内皮占斑块厚度的比率)以及巨噬细胞密度均较注射白蛋白组(对照组)有非常显著性增加,从而提示vegf能增加高脂喂养的兔胸主动脉动脉粥样硬化斑块形成的程度和数量。inoue等[8]发现oxldl可使thp1、u937等单核巨噬细胞及人冠状动脉内皮细胞的vegf mrna及蛋白表达增加,并指出该作用是通过激活细胞过氧化物增殖体激活受体γ信号来实现的。此外,血管紧张素ⅱ(angiotensinⅱ,angⅱ)、高葡萄糖、高同型半胱氨酸均可诱导血管平滑肌细胞、单核巨噬细胞表达vegf[911] ,说明vegf参与了动脉粥样硬化有关的危险因素,如高血脂、高血压、高血糖、高同型半胱氨酸血症导致动脉粥样硬化的过程。

u937细胞是一种人单核/巨噬细胞株,常用于动脉粥样硬化发病机制的研究,用oxldl刺激u937细胞可制作可靠、稳定的单核/巨噬细胞源性泡沫细胞模型[12]。该泡沫细胞模型避免了个体差异,也避免了从人体取材原代细胞培养的麻烦,能为研究泡沫细胞提供大量稳定可靠的细胞材料。u937细胞无经典的a类清道夫受体,但存在b类清道夫受体cd36。本实验用80 μg/ml oxldl刺激u937细胞48 h,通过油红o染色发现泡沫细胞形成。用trizol一步法抽提细胞的总rna并进行rtpcr发现经oxldl刺激后形成的u937泡沫细胞vegf mrna表达较对照细胞组明显增加,差异有统计学意义。夹心抗体酶联免疫定量法检测vegf蛋白表达量发现,与u937细胞对照组相比,u937泡沫细胞组vegf蛋白水平升高了1.52倍,差异有统计学意义。本实验的oxldl对单核/巨噬细胞vegf mrna及蛋白表达的影响与以往的报道相符。以往的报道多是单纯的从单核/巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞角度来考虑的,而本研究则是从泡沫细胞角度来观察vegf的表达情况。泡沫细胞是动脉粥样硬化的重要特征,泡沫细胞的vegf表达可能更具有病理意义。本实验提示了oxldl诱导的泡沫细胞vegf表达可能在动脉粥样硬化发生、发展过程中起一定作用。

angⅱ能促使动脉粥样硬化斑块形成,血管紧张素转换酶抑制剂(acei)可抑制angⅱ生成从而具有抗动脉粥样硬化的作用。acei还具有稳定斑块作用,动物实验表明它不仅能降低斑块体积,还能减少巨噬细胞聚集发生率和增加细胞外基质,但这种有益的效应不能完全用降血压作用来解释。hope试验结果表明,acei雷米普利能显著减少高危冠心病病人的心血管不良事件,提示雷米普利具有抗炎、稳定斑块的作用。europa也揭示了培哚普利防治冠心病的作用,能显著减少主要终点事件(心血管死亡、急性心肌梗死和血运重建)。europa亚组研究(pertinent)进一步阐明了培哚普利的可能机制[13]:(1)减少angⅱ和肿瘤坏死因子a(tnfα)水平;(2)显著增加缓激肽水平;(3)上调内皮型一氧化氮合酶(enos)的活性并降低内皮细胞凋亡率;(4)降低血管性血友病因子(vwf)水平。本实验结果发现oxldl刺激的u937泡沫细胞vegf mrna及蛋白水平表达显著增加。在加入acei培哚普利后,随着浓度(0.01、0.10、1.00 μmol/l)的增加,u937泡沫细胞表达vegf mrna及蛋白逐渐降低,差异有统计学意义。本实验证实了培哚普利体外干预泡沫细胞可从转录、翻译角度呈浓度依赖性降低vegf表达水平,培哚普利有可能通过降低泡沫细胞vegf的表达来发挥治疗动脉粥样硬化、稳定斑块的作用。murakami等[14]报道急性心肌梗死发作36 h内给予培哚普利或坎地沙坦,并不能显著降低外周血vegf水平。本研究与该报道不同,原因可能为急性心肌梗死具有严重的缺血缺氧,而缺氧是vegf表达的强刺激,vegf表达对缺血心肌侧枝循环的建立有帮助,是一种代偿性保护机制,可能acei降低泡沫细胞vegf的程度不足以抵消外周血vegf升高的程度。

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