作者：苏丹,任东林,林宏城,陈经宝,范小华
【摘要】 【目的】 观察大鼠结肠吻合术后早期灌服小承气合剂对吻合口愈合的影响。【方法】选用wistar大鼠60只,随机分为中药组与模型组，2组均行结肠切除吻合术造模。中药组术后早期灌服小承气合剂(剂量为15 g·kg-1·d-1),模型组同期灌服净化自来水。分别于术后第3、7、14天每组取10只动物进行剖腹探查,观察吻合口评分并进行吻合口急性压力负载试验及组织学观察评分。【结果】中药组吻合口评分显著低于模型组(p＜005),且术后第3、7天检测压力升高至40 mmhg时均未见吻合口破裂情况出现。术后第14天检测2组吻合口破裂压力(abs),中药组显著高于模型组(p＜005)。组织学观察发现中药组吻合口组织愈合时间较模型组提早,愈合强度较模型组增强。【结论】结肠吻合术后早期灌服小承气合剂可以加快吻合口愈合，加强吻合口愈合强度,对吻合口有一定的保护作用。
【关键词】 小承气合剂/药理学 吻合口愈合/中药疗法 结肠/病理学 疾病模型,动物 大鼠
abstract: objectiveto investigate the efficacy of early postoperative gastric gavage of xiao chengqi mixture (xcm) in promoting healing of colonic stoma in rats after colocolic anastomosis. methodssixty wistar rats were randomly divided into 2 groups: model group and xcm group. the two groups received colocolic anatomosis after colonectomy. after the operation, xcm group was given early gastric gavage of xcm 15 g·kg-1·d-1 , and the model group was given distilled water. on the 3rd, 7th and 14th day after operation, 10 rats from each group received exploratory laparoscopy for stoma scoring, stoma acute pressure load test and histological scoring. resultsthe stoma score was lower in xcm group than that in the model group(p<005). on the 3rd and 7th day after operation, stoma pressure in xcm group was up to 40mmhg, but stoma rupture did not occur. on the 14th day after operation, the stoma break pressure was higher in xcm group than that in the model group (p<005). the results of histological examination showed that the time for the healing of stoma tissue was shorter, and the healing degree was higher in xcm group than those in the model group. conclusionearly postoperative gastric gavage of xcm exerts certain preventive effect on the stoma in rats after colocolic anastomosis through promoting the healing of stoma and increasing the healing degree of stoma．
key words:xiao chengqi mixture/pharmacology;healing of stoma/tcd therapy;colon/pathology;disease models, animal;rats
腹部外科手术后胃肠动力的恢复是患者术后平稳度过围手术期的关键环节,尤其是有胃肠吻合口的病例,既希望胃肠动力早日恢复,又担心过早的动力恢复会影响胃肠吻合口的安全,特别是结肠吻合口的安全。wwW.133229.cOm前期研究［1］证实：小承气合剂能有效促进结肠吻合术后胃肠动力的早期恢复,同时对预防腹部外科术后的肠粘连、肠梗阻也有积极意义。为进一步研究小承气合剂对结肠吻合术后吻合口的影响,我们在wistar大鼠的结肠切除吻合模型上进行了相关实验,现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物清洁级wistar大鼠60只，体质量200～220 g,雌雄各半,由广州中医药大学实验动物中心提供(合格证号：0025478)。
1.2 主要试剂与仪器水合氯醛由广州汇通化工有限公司提供,甲醛由南京化学试剂有限公司提供,苏木素—伊红（he）染色液由上海沪峰生物科技有限公司提供,masson 三色染色液由上海源叶生物科技有限公司提供,大鼠血管内皮生长因子(vegf)试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供,普通血压计由江苏鱼跃医疗设备股份有限公司提供,44x3a双目生物显微镜由上海光学仪器厂提供,h7600型透射电镜由日本日立有限公司提供。
1.3 小承气合剂组方及制备小承气合剂组方：生大黄6 g,厚朴10 g,枳实10 g,丹参30 g(均为广东一方制药有限公司提供的中药颗粒剂),加入加热净化自来水配成100 ml药液。
1.4 动物模型制备［2］术前12 h禁食、禁水。100 mg/l水合氯醛行腹腔内麻醉(按300 mg/kg剂量给药),在剑突下1 cm处取长约3 cm腹部正中切口,逐层切开入腹,切除1 cm横结肠后用3/0丝线行结肠全层吻合,并修复肠系膜裂孔,理顺肠管后逐层关腹。
1.5 分组及治疗将60只大鼠随机分为中药组、 模型组,每组各30只。动物手术清醒后自由进食进水。自术后第6 h开始,中药组灌服小承气合剂,模型组灌服净化自来水。按照不同动物间以体质量折算等效剂量系数［3］计算大鼠灌胃剂量(单位体质量成人用量∶大鼠用量=1∶9),小承气合剂灌胃剂量为15 g·kg-1·d-1。全部动物于术后第2、3天早晨继续灌胃2 d,共灌药3次。分别于术后第3、7、14天每组取10只动物进行剖腹探查。
1.6 观察指标
1.6.1 吻合口评分所有大鼠剖腹后立即观察吻合口愈合情况(观察内容包括吻合口完整性,腹膜炎,吻合口周围脓肿、粘连情况)。并参照nair等［4］的肠粘连评分法计算吻合口粘连的评分数：0分,无粘连；1分,吻合口与内脏或腹壁间1条粘连带；2分,吻合口与内脏或腹壁间2条粘连带；3分,多于2条粘连带而内脏未直接粘连至腹壁；4分,内脏直接粘连到腹壁,而不管粘连带多少。
1.6.2 吻合口急性压力负载试验参照biert等［5］的方法并进行改良,切取距吻合口远近端各3 cm肠襻,将肠襻两端用1/0丝线分别结扎在已去除袖带的血压计通气管的橡胶连接管上,加压球囊充气,保持水银柱以5 mmhg/s上升,若见水银柱不上升或反而下降,记下刻度即为吻合口破裂压力(abs)。2组实验动物于术后第3、7天记录结肠abs低于40 mmhg的动物数量,第14天则记录2组abs。
1.6.3 组织学观察评分压力负载试验后,取吻合口处肠襻,置于体积分数10％的中性甲醛液固定,常规石蜡包埋,切片4 μm,术后第3、7、14天标本分别于光镜下观察he染色、masson染色、vegf免疫组化情况,术后第7天标本行透射电镜组织学观察。
1.7 图像分析方法采用专业图像分析软件(imagepro plus),每例组织切片随机选取5个高倍镜下视野,计算机自动计算每个视野中不同染色成分占整个视野的比例,计算视野下的单一染色成分的平均值,即为某一组织成分含量的相对平均值。
1.8 统计学方法采用spss 130 for windows 统计软件建立数据库并进行统计分析。
2 结果
2.1 各组吻合口评分及急性压力负载试验结果表1结果显示：中药组吻合口评分显著降低,与模型组比较差异有显著性意义(p＜005)。两组术后第3、7天检测压力升高至40 mmhg时均未见吻合口破裂情况出现。术后第14天测两组abs,中药组abs显著升高,与模型组比较差异有显著性意义(p＜005)。表1各组吻合口评分及破裂压力比较(略)
2．2 吻合口组织学情况
2.2.1 各组he染色情况图1（图片见第201~202页）结果显示：在he染色的切片中细胞核呈蓝色,细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色,钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色。术后第3天,两组肠壁黏膜均已修复完整,但腺体欠发达,腺腔开口较小,黏膜以下肉芽生长活跃,可见较多毛细血管及成纤维细胞增生,两组无明显区别。术后第7天,两组黏膜腺体发育良好,与正常肠黏膜相近,肉芽组织中有较多毛细血管,其中小部分已转变成小血管,成纤维细胞增生,其周围已有明显胶原纤维形成,但胶原纤维束较细,排列稀疏,而中药组成纤维细胞较模型组增多。术后第14天,两组黏膜与术后第7天时相似,肉芽组织处毛细血管较术后第7天减少,较多小血管生成,并见成纤维细胞周围较多胶原纤维形成,以中药组为明显。
2.2.2 各组masson染色情况masson染色是研究组织中胶原纤维最常用和有效的染色方法之一。图2（彩图见第202页）结果显示：胶原纤维被染成蓝色,肌纤维呈红色,细胞核呈蓝黑色。术后第3天,中药组吻合口成纤维细胞合成胶原较模型组活跃,分布较均匀,但纤维纤细,无粗大的胶原纤维形成。两组胶原合成于术后第7天达高峰,胶原纤维含量均较同组第3天显著增多(p＜005)，并开始出现明显纤维化,但纤维束较细,纤维排列紊乱,中药组吻合口胶原纤维含量较模型组增多,但差异无显著性意义(p>005)。术后第7天之后胶原合成趋于稳定,于术后第14天呈现广泛纤维化,且纤维束较粗,排列较整齐,此时中药组胶原纤维含量与模型组比较差异无显著性意义(p>005)，见表2。表2各组术后不同时间点胶原纤维显色情况比较(略)
2.2.3 各组vegf免疫组化检测结果表3结果显示：吻合口肉芽组织中毛细血管增生于第3天左右迅速增长并达高峰,中药组毛细血管密度显著大于模型组(p＜005)。术后第7天,毛细血管较术后第3天无明显增长,但见部分已化生成小血管,中药组毛细血管密度与模型组比较差异无显著性意义(p>005)。术后第14天,两组毛细血管密度较术后第7天显著减少(均p＜005),见较多小血管生成,但中药组毛细血管密度与模型组比较差异无显著性意义(p>005)。vegf阳性表达比较结果与毛细血管密度比较结果一致(见表4)。图3（彩图见第202~203页）结果显示：结肠术后吻合口肉芽组织中毛细血管增生于第3天迅速增长并达高峰,且中药组毛细血管密度大于模型组,表明小承气合剂具有一定的早期诱导血管增生和肉芽组织生成作用。表3各组术后不同时间点毛细血管密度比较，表4各组术后不同时间点vegf阳性表达比较(略)。
2.2.4 各组透射电镜检查结果图4（彩图见第203页）结果显示：术后第7天,中药组腺上皮细胞分泌功能活跃,细胞浆丰富,内含许多分泌颗粒,腺上皮细胞间连接紧密,而模型组腺上皮细胞分泌功能欠活跃,细胞浆较少,分泌颗粒较少,腺上皮细胞间连接欠紧密。中药组成纤维细胞增生活跃,胞浆较多,胞质丰富,细胞内质网、线粒体发达,而模型组成纤维细胞亦明显增生,但胞浆较少,胞质不丰富,核浆比较大,细胞内质网、线粒体不发达。中药组成纤维细胞旁已有明显胶原纤维形成,胶原纤维细长,交叉排列,部分平行,而模型组成纤维细胞旁有明显胶原纤维形成,胶原纤维较短,交叉排列,部分平行,排列较中药组稀疏。
3 讨论
临床上,结肠吻合口漏或破裂可分原发性及继发性两类。原发性结肠吻合口破裂或漏,临床上主要与吻合技术有关,常出现于术后早期。而继发性吻合口破裂多见于术后第3～7天,这是因为缝线处的组织坏死,使缝线失去了原有的拉力,如此时吻合口尚未愈合,就有可能发生吻合口裂开［6］。有学者对大鼠行结肠吻合术,发现术后第3～4天结肠吻合口离断力显著下降,此时最易发生吻合口破裂。因此,观察结肠吻合口愈合情况,常选择术后第3～4天或第7天。
观察药物对吻合口愈合的影响,一般是检测吻合口的离断力(brs),但临床上继发性吻合口破裂常发生在吻合口薄弱处,很少发生吻合口离断,故测吻合口破裂压力(abs)已成为临床检测吻合口愈合良好与否的一个重要指标。结合本研究进行的吻合口安全性急性压力负载试验结果,术后第3、7天两组均可耐受高于40 mmhg压力,说明实验吻合技术无明显差异,两组均良好愈合。至术后第14天,中药组abs显著升高,说明早期灌服小承气合剂能够增加结肠吻合口抗张强度,促进吻合口愈合。
结肠吻合口的愈合主要依赖吻合口局部胶原纤维的形成,与其局部胶原质和量的变化呈正相关［7-8］。正常大鼠于结肠吻合术后12 h其吻合口处即有胶原纤维形成［9］,故早期提高胶原的质和量将有利于肠吻合口的修复。本实验结果证明,术后2组虽均未发生吻合口瘘,但abs中药组明显高于模型组。组织学观察,中药组大鼠吻合口组织新生毛细血管和成纤维细胞增加,胶原量增加显著。从胶原染色分析,术后第3天起中药组吻合口成纤维细胞合成胶原较模型组活跃,且于术后7天及14天发现中药组吻合口胶原纤维含量较模型组多。与模型组比较,中药组电镜观察见成纤维细胞增生活跃,胞浆较多,胞质丰富,细胞内质网、线粒体发达,胞外胶原形成亦较密。提示应用小承气合剂后不但促使吻合口局部组织代谢活跃,而且能加快成纤维细胞成熟和胶原合成增多,对加强吻合口组织愈合,预防吻合口瘘有重要意义。
vegf是一种特异的作用于内皮细胞的多功能因子,作为一个重要的促血管生成因子,在原位诱导血管生成的作用十分强大［10］,其作用与组织修复密切相关。目前研究［11-12］已证实,vegf作为内皮细胞特异有丝分裂原，它能刺激内皮细胞增生、促使血管渗漏、刺激细胞迁移,导致纤维蛋白原外渗进入组织间质而促成血管生成,进而形成组织内部高密度的微血管网，同时能够促进成纤维细胞、平滑肌细胞分裂,从而促进肉芽组织形成。因此,局部组织内vegf的表达情况,能够较好地反映组织的增生、修复情况。本实验结果显示,结肠术后吻合口肉芽组织中毛细血管增生于第3天迅速增长并达高峰,且中药组毛细血管密度大于模型组,表明小承气合剂具有一定早期诱导血管增生和肉芽组织生成的作用。
综上所述,结肠吻合术后早期灌服小承气合剂可以加快吻合口愈合，加强吻合口的愈合强度,对吻合口起保护作用,为该方临床应用提供了动物实验依据。
【参考文献】
［1］陈经宝,任东林,蔡北源,等.小承气合剂早期灌服对结肠吻合术后胃肠动力恢复及安全性的作用［j］.广东医学,2007,28(3):473．
［2］ 何清.最新医学实验动物研究评析与手术创新、管理创新实务全书［m］.长春:吉林科学技术出版社,2005：316．
［3］ 李康,朱佐江.机能实验学［m］.北京:人民军医出版社,2000：64．
［4］ nair s k,bhal i k,aurora a l.role of proteolytic enzymes in the prevention of postoperative intraperitoneal adhesions［j］.arch surg,1974,108：849．
［5］ biert j,seifert w,de man b,et al.combined preoperative irradiation and local hyperthermia delays early healing of experimental colonic anastomoses［j］.arch surg,1996,131(10)：1037．
［6］ 李界明,黎介寿,李文斌,等.双半环结肠浆肌片加强外伤性结肠吻合口［j］.中华实验外科杂志,1992,9：157．
［7］ vander ham a c, kort w j, weijma i m, et al. effect of antibiotics in fibrin sealant on healing colonic anastomoses in the rat［j］. br j surg, 1992,79：525．
［8］ jonnsson k,jibom h,zederfedt b.collagen metabolism in small intestinal anastomosis［j］.am j surg,1987,154：288．
［9］ martens m f,hendriks t.postoperative changes in collagen synthesis in intestinal anastomoses of the rat：differences between small and large bowel［j］.gut,1991,32：1482．
［10］dlate k h,breier g,weich h a,et al.vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in human gliomas in vivo［j］.nature,1992,359(6398):845．
［11］ arii s,mori a,uchida s,et al.implication of vascular endothelial growth factor in the development and metastasis of human cancers［j］.hum cell,1999,12(1):25．
［12］ 林茂虎,郁华亮,苗芮,等.小肠黏膜下层在膀胱组织修复中生长因子释放的研究［j］.中国康复理论与实践,2006,12(7):579．
