作者：胡怀强 ,周永红,马学盛,曹秉振,王新陆
【摘要】 【目的】观察滋补肝肾中药复健片在不同时相对脑梗死大鼠脑组织微管相关蛋白2(map2)表达的影响,探讨其促进神经干细胞分化的作用机制及map2在脑梗死后的动态变化。【方法】选用240只sd大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和中药组,并根据脑梗死病程每组又分为3、7、14、28、42 d共5个亚组,每个亚组动物数为12只。采用改良的longa法行大脑中动脉阻塞复制大鼠局灶性脑缺血模型,中药组灌胃给予复健片水溶液(剂量为9 g·㎏-1·d-1),其他各组分别灌胃给予同剂量的蒸馏水。【结果】模型组大鼠脑梗死后3 d时,脑组织map2表达即达到高峰,与正常对照组比较差异有显著性意义(p＜00001),后逐渐下降,至第14天时降至正常水平,与正常对照组比较差异无显著性意义(p＞005)。中药组在3 d时map2出现高表达,7 d时其表达达到高峰,持续至14 d时开始下降。不同时相中药组的map2表达与模型组比较差异均有显著性意义(p＜001或p＜00001)。【结论】复健片促进中枢神经再生作用与其能增加脑梗死后脑组织map2的表达有关。
【关键词】 复健片/药理学 脑梗死/中药疗法 神经再生 脑组织/病理学 微管相关蛋白
abstract: objectiveto observe the effect of fujian tablets (ft), a prescription with the actions of nourishing liver and kidney, on the expression of microtubuleassociated protein 2 (map2) in cerebral infarction rats at different time points, and to explore its mechanism on promoting nerve cell differentiation. methodsa total of 240 male sprague dawley rats were divided into normal control group, shamoperation group, model group and ft group. focal cerebral ischemia models were established by occlusion of the middle cerebral artery according to the reformed longa method in rats, and were subdivided into 3, 7, 14, 28, and 42day cerebral infarction subgroups. ft group was given ft in the dose of 9 g·kg-1·d-1, and the other groups were given the same dose of distilled water. resultsin the model group, map2 expression in the hippocampus increased and reached a peak on day 3, which were notably different from that in the normal control group (p<00001), and gradually decreased from then on, reduced to normal level on day 14. the difference of map2 expression between the model group and the normal control group was insignificant from day 14 (p＞005). in ft group, map2 expression increased on day 3, reached a peak on day 7, remained high level till day 14, and then decreased, the difference being significant compared with the model group (p＜001 or p<00001). conclusionthe mechanism of ft on promoting neural regeneration is probably related with the increase of cerebral map2 expression after cerebral infarction.
key words: fujian tablets/pharmacology;cerebral infarction/tcd therapy;neural regeneration;brain/pathology;microtubuleassociated protein 2
影响脑梗死后神经功能重塑的因素十分复杂,有多种因子的参与,其中微管相关蛋白2(microtubuleassociated protein2,map2)对脑缺血最敏感,在缺血中心表达丧失,而在相对完整的神经元和缺血半暗带却选择性地升高,与神经元恢复相对应［1］。www.133229.Commap2为神经细胞骨架成分,主要存在于神经细胞的树突和胞体中,map2的表达对于树突的分化是必需的,其参与了神经元和非神经元细胞突起生长以及神经元极性的形成［2］,对神经元的发育、分化、重塑、细胞结构的维持、神经元突起的生长及线粒体的轴突转运具有重要意义［3］。因此,map2被认为是神经生长和修复相关蛋白,是研究神经再塑的分子标志物［4］。研究表明,滋补肝肾的中药复健片可明显改善中风患者神经功能评分,具有促进中枢神经再生作用［5］。本研究观察了局灶性脑缺血模型大鼠不同时点海马中map2含量的变化,探讨复健片在脑梗死后脑功能重塑中的作用机制,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组成年spf级雄性spraguedawley (sd)大鼠240只,体质量(250±10)g,由山东中医药大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号：scxk(鲁)20050015(山东省科学技术厅发),实验动物质量合格证号：鲁动质号0002342(山东省实验动物管理委员会发),检疫后备用,自由摄食进水。颗粒大鼠饲料由济南康大饲料公司与山东省实验动物中心联合生产,许可证号：鲁饲准字364号。大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、中药组,并根据脑梗死病程每组又分为3、7、14、28、42 d共5个亚组,每个亚组动物数为12只。
1.2 药物复健片主要药物为何首乌、草决明、桑寄生、海马、淫羊藿等,由山东鲁信药业有限公司提供,批号：2007030701,并按照成人剂量的20倍(9 g·kg-1·d-1)将其制成水溶液,浓度为09 g/ml,置于4℃冰箱中备用。
1.3 主要试剂与仪器map2单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供；浓缩型二氨基联苯胺(dab)试剂盒由北京中杉金桥生物科技有限公司提供；wvcp410型显微镜由日本olympus公司提供；hpias1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统购于同济千屏影像公司。
1.4 造模与给药在longa等［6］报道的方法基础上改良后行大脑中动脉阻塞术(middle cerebral artery occlusion,mcao)复制局灶性脑缺血模型。mcao模型成功的判断标准采用longa评分标准［6］：0分,无神经缺损表现；1分,对侧前爪不能充分伸展；2分,向外侧转圈；3分,行走时向对侧倾倒；4分,不能行走,意识丧失。动物清醒后进行神经功能评分,1至3分者为纳入标准,0分和4分者剔除。正常对照组不做任何干预。假手术组采用线栓插入颈内动脉但不栓塞大脑中动脉,模型组采用线栓法致大脑中动脉闭塞造模但不进行药物干预。中药组先对该组动物进行线栓法致大脑中动脉闭塞造模，于造模成功24 h后灌胃给予复健片水溶液9 g·kg-1·d-1,其他各组分别灌胃给予10 ml/kg的蒸馏水,连续给药42 d。固体饲料和水自由摄取。各组均为每天给药1次,每3 d称体质量1次,重新计算每只动物给药量,直至取材时。在取材的各时间点,以35 g/l水合氯醛腹腔注射麻醉后,40 g/l多聚甲醛灌注固定取脑,然后将其浸于40 g/l多聚甲醛中后固定。常规脱水浸蜡包埋,予正中隆起水平在切片机上行4 μm连续冠状切片。观察各时间点各组纳入的实验动物样本数（见表1）。表1不同时相各组样本含量（略）
1.5 免疫组织化学染色切片常规脱蜡至水,体积分数3%h2o2室温孵育10 min,以灭活内源性酶,蒸馏水洗3次。热修复抗原：将切片浸入001 mol/l枸橼酸盐缓冲液(ph 60),电炉加热至沸腾后断电,间隔10 min后,反复1次,自然冷却后用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,pbs,ph 72～76)洗涤2次。滴加50 g/l牛血清蛋白(bsa)封闭液,室温20 min,甩去多余液体,不洗。滴加兔抗鼠map2一抗(1∶50),4℃过夜,pbs洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔igg,37℃、20 min，pbs洗2 min×3次。滴加试剂抗生蛋白链菌素生物素复合体,37℃，20 min,pbs洗5 min×4次。dab显色：使用dab显色试剂盒,室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤,脱水,透明,封片,显微镜观察。免疫组织化学染色阴性对照用生物素化山羊抗兔igg代替一抗,其余步骤同上,以检查map2免疫反应的特异性。切片在统一放大倍数(10×20)下,随机选5个视野,运用hpias1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行分析,记录平均阳性细胞数。
1.6 统计学方法所得数据经正态分布及方差齐性检验后进行单因素方差分析,数据采用sas 81版统计软件进行分析。
2 结果
2.1 复健片对不同时相mcao模型大鼠map2表达的影响结果见表2、图1（彩图见第204页）。表2结果显示：正常对照组和假手术组大鼠脑组织内的map2呈低表达状态,在不同时相无明显变化。mcao模型大鼠脑梗死后3 d时,脑组织map2表达即达到高峰,与正常对照组比较差异有显著性意义(p＜00001),后逐渐下降,至第14天时降至正常水平,与正常对照组比较差异无显著性意义(p＞005),说明脑内神经元在正常状态下无明显分化,在脑缺血刺激下可引起神经元分化。表2各组对不同时相mcao模型大鼠map2表达的影响(略)
3 讨论
map2属于结构性微管相关蛋白家族,是20世纪80年代初发现的一种热稳定的磷蛋白质,是一种调节微管蛋白组装及动力学的重要调节因子,主要存在于神经元胞体和树突,是脑内最丰富的蛋白之一。其与微管蛋白形成微管,促进微管形成,并同其他结构元件肌动蛋白、微丝等相互作用构成细胞骨架,参与突起生长、形成、胞浆蛋白运输、神经元发育、轴突和树突的细胞器运输等功能,并可稳定细胞结构、传导信号［7］,上述诸多功能是神经功能恢复所必须的。
map2可增加微管的稳定性和刚性,使微管伸长。微管存在于神经元发育早期和成年后突触构成时期,与树突及突触的形态学变化有关［8］。微管蛋白是一种重要的细胞骨架蛋白,参与细胞分裂、小泡运输及细胞形态的维持［9］,它对细胞结构的维持和线粒体的轴突转运具有重要意义。研究发现,map2活性下降可造成微管变性堆积,影响细胞骨架的完整，并可使线粒体的轴突转运发生障碍,最终导致神经元死亡［10］。因此,map2对神经元的发育、分化、重塑、细胞结构的维持、神经元突起的生长及线粒体的轴突转运具有重要意义［4,7］。
本实验结果显示,正常情况下大鼠脑内的map2呈低表达状态,梗死后其脑组织内map2在早期即呈高表达,3 d达到高峰,此后逐渐下降,7 d时仍明显高于正常对照组,14 d降至正常水平。说明脑梗死后在急性期有较好的恢复作用,后期map2表达下降,内源性神经干细胞分化较差,这可能是中枢神经损伤后再生困难的主要原因之一。
中医学认为,脑梗死的主要病机是机体在各种病理因素作用下,机体阴阳失调,肝肾阴精受损,风火痰瘀等病理产物旋即变生,在各种诱因作用下引发而致。其病机关键为肝肾阴虚,肝肾阴虚成于中风之先,是脑梗死发病的根本,已病之后贯穿于脑梗死的整个病理过程,且在其发展演变和治疗过程中往往进一步伤耗阴津。故宜采用滋补肝肾法治疗脑梗死。复健片正是根据此法而设,具有调补肝肾之效,补肾以填精生髓,补肝以养春生之木气,助肾生髓,肝肾并补,意在加强生髓以充脑。本研究通过动态观测大鼠脑组织内map2的变化,探索脑梗死后脑内神经干细胞的分化规律,并探讨复健片对神经干细胞的分化作用。结果表明,中药组在3 d时map2出现高表达,7 d时其表达达到高峰,持续至14 d时开始下降,且7、14 d两者之间无显著性差异。不同时相中药组的map2表达与模型组比较差异均有非常显著性意义(p＜001或p<00001),说明滋补肝肾中药复健片能显著增加脑梗死后脑内map2的表达,促进神经元分化,并使其持续较长时间处于分化状态,这可能是复健片促进神经再生的主要机制之一。
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