作者：张韧,李娟,邝枣园,欧志英,王宁宁,计勇,何蕴韶
【摘要】 【目的】 探讨原癌基因hccr mrna、fbi1 mrna在肝癌相关患者血液中的表达及其与临床指标的关系。【方法】采用荧光定量聚合酶链反应(pcr)技术,检测41例肝细胞癌、3例肝硬化患者术前血液标本及10例健康者血液标本中hccr mrna、fbi1 mrna 含量,分析其与临床指标的关系。【结果】 肝细胞癌患者血液中hccr mrna、fbi1 mrna 水平高于肝硬化患者,健康者血液中未发现两基因的mrna 表达。同时发现,血液中fbi1 mrna 与甲胎蛋白(afp)水平显著相关(p＜001),fbi1 mrna 与hccr mrna 的表达水平显著相关(p＜001)。【结论】肝细胞癌、肝硬化患者血液中hccr mrna、fbi1 mrna表达异常增高,fbi1 mrna 表达与afp水平显著相关。
【关键词】 肝肿瘤 基因表达 相关分析
abstract:objectiveto investigate mrna expression of protooncogene fbi1 and hccr in the blood of hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis, and to explore their relation with clinic parameters. methodsquantity realtime fluorescence polymerase chain reaction (pcr) was used for the detection of fbi1 and hccr mrna expression in the blood of 41 hepatocellular carcinoma patients before surgery, 3 liver cirrhosis patients before surgery, and 10 healthy volunteers. the relationship of fbi1 and hccr mrna expression with clinic parameters was analyzed by fishers exact test or spearmans analysis of correlation. resultsthe level of fbi1 and hccr mrna expression was higher in the blood of hepatocellular carcinoma patients than that in hepatic cirrhosis patients. fbi1 and hccr mrna expression was negative in the blood of the healthy volunteers. fbi1 mrna expression was positively correlated with alpha fetoprotein (afp) level (p<001), and also positively correlated with hccr mrna expression (p<001). conclusionabnormal increase of fbi1 and hccr mrna expression occurs in the blood of hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis patients. fbi1 mrna expression is positively correlated with afp level．
key words: liver neoplasms；gene expression；correlation analysis
原癌基因fbi1(factor that binds to inducer of short transcripts1),其编码的蛋白具有特殊结构,即其氮末端具有poz(poxvirus zinc finger)区,碳末端具有由k型锌指结构组成的蛋白结合区。wWW.133229.cOM研究发现fbi1可以通过其特殊蛋白结构特异结合p14arf启动子,以及抑制p53通路参与肿瘤的发生［1］。其蛋白在乳房、肺、膀胱、前列腺、肝脏等肿瘤中有异常高表达［1-3］。原癌基因hccr(human cervical cancer oncogene)最先在人宫颈癌中分离。研究显示,hccr是p53基因的负调控因子,能下调p21waf1基因启动子活性,其蛋白在人乳腺、肾、淋巴、胃、结肠、卵巢等肿瘤中异常高表达［4-6］。本研究检测了肝癌相关患者血液中hccr 及fbi1基因mrna的表达情况及探讨其与患者临床指标的联系,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本及来源
肝细胞癌(hcc)患者术前血液标本41例,肝硬化(lc)患者术前血液标本3例,均取自中山大学附属第一医院、中山大学肿瘤防治中心。各患者的临床指标都收集于中山大学附属第一医院、中山大学肿瘤防治中心检验科的检测记录。3例正常肝组织来源于肝移植的健康供体肝。10例健康者血液标本取自广东省东莞市中心血站,来源于健康献血者,年龄22～40岁,均排除肝肾疾病。
1.2 主要试剂与仪器
trizol(invitrogen 公司)，逆转录试剂盒(fermentas公司)，荧光定量聚合酶链反应(pcr)所用试剂盒(达安基因诊断公司)，引物、探针(invitrogen 公司合成)，pmd18t载体(takara公司)， uvmini1240型紫外分光光度计(日本岛津公司)，7000型荧光定量pcr仪(美国abi公司)，9700型普通pcr仪(美国abi公司)。
1.3 标本rna的提取和cdna第1链合成
临床取来的血液标本用乙二胺四乙酸(edta)抗凝管4℃保存,并在1 d内提取rna,提取时1 ml血液用9 g/l nacl对倍稀释后,缓慢加入已装有2 ml淋巴细胞分离液的离心管中,2 500 r/min离心10 min,吸取中间单个核细胞层置于15 ml ep管中,5 000 r/min离心5 min,弃上清,在沉淀中加入trizol提取rna。临床取来的其他组织标本马上-80℃冷冻,提取时加入液氮碾磨,之后用trizol提取rna。所有rna用紫外分光光度计测出光密度d260与d280比值,并使用普通pcr仪、逆转录试剂盒合成cdna第1链,其在普通pcr仪上的运行条件为：37℃、60 min,95℃、5 min。cdna第1链-80℃保存备用。
1.4 荧光定量pcr检测fbi1 mrna、hccr mrna
1.4.1 引物探针设计
根据genebank上fbi1、hccr2和人βactin mrna序列,应用primer express 20(applied biosystems company)设计。引物探针序列见表1。表1荧光定量rtpcr所用的引物和探针（略）
1.4.2 荧光定量pcr检测fbi1 mrna、hccr mrna方法建立
用forward primer、reverse primer扩增cdna第1链,所得基因片段克隆入pmd18t载体。提取重组质粒经测序证实后,通过光密度(d)值算出拷贝数,并用三羟甲基氨基甲烷—盐酸乙二胺四乙酸溶液(trishcl edta, te缓冲液)倍比稀释后作为系列标准品。将fbi1、hccr、βactin系列标准品和待测样本cdna同时在荧光定量pcr仪完成以下程序：93℃预变性2 min，93℃变性30 s,55℃退火45 s,共40个循环。反应结束后,将样本与各基因标准曲线进行对比分别得到fbi1、hccr、βactin的原始拷贝数后,用fbi1原始拷贝数除以βactin原始拷贝数即得fbi1的相对表达量。用hccr原始拷贝数除以βactin原始拷贝数即得hccr的相对表达量。
1.5 统计学方法
所得数据应用spss 110统计软件包处理,对于2个均为计数资料的采用卡方检验fisher精确概率法进行分析；对于1个为计数资料1个为计量资料的,将计量资料以其中位数分为2类后,使用卡方检验fisher精确概率法进行分析；对于2个均为计量资料的采用spearman 相关分析。
2 结果
2.1 荧光定量 pcr检测fbi1 mrna、hccr mrna方法建立
所有提取rna的 d260与d280均在18～20之间。各基因荧光定量pcr扩增动力曲线图和标准曲线见图1、图2,从扩增动力曲线图可见不同模板浓度(101～108 copies/ml)扩增曲线的上升起始点不同,但都呈形状相似的“s”型曲线,分布均匀。从标准曲线图可见不同梯度模板浓度的对数值与阈值(ct)之间有非常好的线性相关关系,标准曲线的直线回归相关系数r都大于0990,表明标准品与ct值有着良好的线性关系。而阴性对照或阴性样本的扩增曲线不是“s”型,而且都处于基线以下。
2.2 血液中fbi1、hccr基因的表达情况
应用已建立的荧光定量法检测fbi1、hccr表达,测得fbi1、hccr在hcc患者、lc患者、以及健康者血液中的表达情况见表2。在大部分患者血液中两者都有表达,其中hcc患者不仅两者的阳性率略高于lc患者,两基因的表达水平也高于lc患者。而在10例健康者血液中均未检测到hccr、fbi1的表达,即hccr mrna、fbi1 mrna在正常人血液当中的阳性率为0％。表2各组血液中fbi1、hccr表达情况（略）
2.3 hcc和lc患者血液中fbi1、hccr表达水平与临床指标的关系
表3结果显示,fbi1 mrna、hccr mrna表达水平与大部分临床指标的关联均无统计学意义,但fbi1 mrna与hccr mrna水平及fbi1 mrna与afp水平的相关分析均有显著性意义(p<001)。表3肝癌相关患者血液中fbi1 mrna、hccr mrna表达水平与临床指标的关系（略）
3 讨论
3.1 肝癌相关患者血液中fbi1 mrna的表达
本研究中设计了更为严格的健康者血液标本的入选标准,即来源于血站的献血者，且确定排除了肝、肾疾病和肝炎病毒感染,从而尽可能的排除未知因素对实验结果的影响。结果显示健康者血液中fbi1 mrna均为阴性,而肝癌、肝硬化患者血液中大多有不同程度的fbi1 mrna表达,提示fbi1 mrna具有作为一个肝癌相关标记物的可能。本研究选用甲胎蛋白(alpha fetoprotein,afp)数值作为临床指标参与统计,发现患者血液中fbi1 mrna表达与afp水平显著相关,而afp数值的动态变化与患者肝癌病情发展有关［7］。本研究还发现肝癌患者血液中fbi1 mrna水平高于肝硬化患者,结合已有研究结果［8］认为：fbi1 mrna在hcc远端转移患者血液中的表达量远高于其他人群,提示血液中fbi1 mrna的水平高低可能与hcc患者的病情发展有关。
3.2 肝癌相关患者血液中hccr mrna的表达
hccr有2种不同的剪接方式,即hccr1和hccr2,研究发现hccr2更多与肿瘤形成有关［4］。因此本研究根据hccr2设计并建立血液中hccr mrna 检测方法。研究发现hccr可增强p53蛋白稳定性，但降低了p53蛋白调控功能,并可下调p21waf1基因启动子活性［4］。而fbi1是通过结合并抑制p14arf基因启动子活性,参与影响p14p53基因信号旁路［1］。说明hccr、fbi1均参与了p14arf～p53～p21waf1通路。本研究发现,hccr mrna的水平与fbi1 mrna水平显著相关，这说明hccr和fbi1在致癌机理上可能有一定的相关性。而fbi1参与作用的p14arf～p53位于该通路上游,所以可能是hccr基因参与了fbi1基因所引起的后续反应。
另基于本研究中发现fbi1与hccr及afp均显著相关,但hccr与afp不相关,提示fbi1基因所引起的后续反应中是否不仅包含hccr基因参与的一条路径,可能还包含其他途径,有待进一步研究证实。
3.3 两基因联合检测肝癌的可能性
本研究发现血液标本中两基因均未检出mrna的患者共有4例,都属于hcc病例。因此在本实验中,两基因联合检测hcc的阳性率(检出率)为90%(37/41)。而因为健康者血液中均未检出两基因的mrna,因此其特异性为100%。同样,肝硬化患者的检出率(3/3)和特异性均为100%。这说明fbi1 mrna、hccr mrna联合检测有可能用于检测肝癌,但其是否能作为一种新的检测方法,则需要更多的hcc、lc患者及其他肝病或其他疾病患者以及健康者的血液标本进行进一步的验证和研究,为中医药治疗肝癌提供新靶点。
【参考文献】
［1］maeda t,hobbs r m,merghoub t,et al. role of the protooncogene pokemon in cellular transformation and arf repression［j］. nature,2005,433(7023)：278．
［2］zhao z h,wang s f,yu l,et al. overexpression of pokemon in nonsmall cell lung cancer and foreshowing tumor biological behavior as well as clinical results［j］lung cancer,2008,62(1)：113．
［3］计勇,何晓顺,马毅,等. pokemon在肝细胞癌及癌旁、癌以远组织、肝硬化组织及正常肝组织中的表达［j］. 中华实验外科杂志,2007,24(2)：187．
［4］ko j,lee y h,hwang s y,et al. identification and differential expression of novel human cervical cancer oncogene hccr2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization［j］. oncogene,2003,22(30)：4679．
［5］chung y j,kim j w. novel oncogene hccr: its diagnostic and therapeutic implications for cancer［j］. histol histopathol,2005,20(3)：999．
［6］ha sa,shin s,kim h,et al. oncoprotein hccr1 expression in breast cancer is well correlated with known breast cancer prognostic factors including the her2 level, p53 mutation, and er/pr expression［j］. bmc cancer,2009,9(1)：51．
［7］ liaw y f,tai d i,chen t j,et al. alphafetoprotein changes in the course of chronic hepatitis: relation to bridging hepatic necrosis and hepatocellular carcinoma［j］. liver,1986,6(3)：133．
［8］计勇,何晓顺,马毅,等. pokemon在肝细胞癌、肝细胞癌远处转移、肝硬化和健康人群外周血中的表达及意义［j］. 中华实验外科杂志,2007,24(11)：1320．
【摘要】 【目的】 探讨原癌基因hccr mrna、fbi1 mrna在肝癌相关患者血液中的表达及其与临床指标的关系。【方法】采用荧光定量聚合酶链反应(pcr)技术,检测41例肝细胞癌、3例肝硬化患者术前血液标本及10例健康者血液标本中hccr mrna、fbi1 mrna 含量,分析其与临床指标的关系。【结果】 肝细胞癌患者血液中hccr mrna、fbi1 mrna 水平高于肝硬化患者,健康者血液中未发现两基因的mrna 表达。同时发现,血液中fbi1 mrna 与甲胎蛋白(afp)水平显著相关(p＜001),fbi1 mrna 与hccr mrna 的表达水平显著相关(p＜001)。【结论】肝细胞癌、肝硬化患者血液中hccr mrna、fbi1 mrna表达异常增高,fbi1 mrna 表达与afp水平显著相关。
【关键词】 肝肿瘤 基因表达 相关分析
abstract:objectiveto investigate mrna expression of protooncogene fbi1 and hccr in the blood of hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis, and to explore their relation with clinic parameters. methodsquantity realtime fluorescence polymerase chain reaction (pcr) was used for the detection of fbi1 and hccr mrna expression in the blood of 41 hepatocellular carcinoma patients before surgery, 3 liver cirrhosis patients before surgery, and 10 healthy volunteers. the relationship of fbi1 and hccr mrna expression with clinic parameters was analyzed by fishers exact test or spearmans analysis of correlation. resultsthe level of fbi1 and hccr mrna expression was higher in the blood of hepatocellular carcinoma patients than that in hepatic cirrhosis patients. fbi1 and hccr mrna expression was negative in the blood of the healthy volunteers. fbi1 mrna expression was positively correlated with alpha fetoprotein (afp) level (p<001), and also positively correlated with hccr mrna expression (p<001). conclusionabnormal increase of fbi1 and hccr mrna expression occurs in the blood of hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis patients. fbi1 mrna expression is positively correlated with afp level．
key words: liver neoplasms；gene expression；correlation analysis
原癌基因fbi1(factor that binds to inducer of short transcripts1),其编码的蛋白具有特殊结构,即其氮末端具有poz(poxvirus zinc finger)区,碳末端具有由k型锌指结构组成的蛋白结合区。研究发现fbi1可以通过其特殊蛋白结构特异结合p14arf启动子,以及抑制p53通路参与肿瘤的发生［1］。其蛋白在乳房、肺、膀胱、前列腺、肝脏等肿瘤中有异常高表达［1-3］。原癌基因hccr(human cervical cancer oncogene)最先在人宫颈癌中分离。研究显示,hccr是p53基因的负调控因子,能下调p21waf1基因启动子活性,其蛋白在人乳腺、肾、淋巴、胃、结肠、卵巢等肿瘤中异常高表达［4-6］。本研究检测了肝癌相关患者血液中hccr 及fbi1基因mrna的表达情况及探讨其与患者临床指标的联系,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本及来源
肝细胞癌(hcc)患者术前血液标本41例,肝硬化(lc)患者术前血液标本3例,均取自中山大学附属第一医院、中山大学肿瘤防治中心。各患者的临床指标都收集于中山大学附属第一医院、中山大学肿瘤防治中心检验科的检测记录。3例正常肝组织来源于肝移植的健康供体肝。10例健康者血液标本取自广东省东莞市中心血站,来源于健康献血者,年龄22～40岁,均排除肝肾疾病。
1.2 主要试剂与仪器
trizol(invitrogen 公司)，逆转录试剂盒(fermentas公司)，荧光定量聚合酶链反应(pcr)所用试剂盒(达安基因诊断公司)，引物、探针(invitrogen 公司合成)，pmd18t载体(takara公司)， uvmini1240型紫外分光光度计(日本岛津公司)，7000型荧光定量pcr仪(美国abi公司)，9700型普通pcr仪(美国abi公司)。
1.3 标本rna的提取和cdna第1链合成
临床取来的血液标本用乙二胺四乙酸(edta)抗凝管4℃保存,并在1 d内提取rna,提取时1 ml血液用9 g/l nacl对倍稀释后,缓慢加入已装有2 ml淋巴细胞分离液的离心管中,2 500 r/min离心10 min,吸取中间单个核细胞层置于15 ml ep管中,5 000 r/min离心5 min,弃上清,在沉淀中加入trizol提取rna。临床取来的其他组织标本马上-80℃冷冻,提取时加入液氮碾磨,之后用trizol提取rna。所有rna用紫外分光光度计测出光密度d260与d280比值,并使用普通pcr仪、逆转录试剂盒合成cdna第1链,其在普通pcr仪上的运行条件为：37℃、60 min,95℃、5 min。cdna第1链-80℃保存备用。
1.4 荧光定量pcr检测fbi1 mrna、hccr mrna
1.4.1 引物探针设计
根据genebank上fbi1、hccr2和人βactin mrna序列,应用primer express 20(applied biosystems company)设计。引物探针序列见表1。表1荧光定量rtpcr所用的引物和探针（略）
1.4.2 荧光定量pcr检测fbi1 mrna、hccr mrna方法建立
用forward primer、reverse primer扩增cdna第1链,所得基因片段克隆入pmd18t载体。提取重组质粒经测序证实后,通过光密度(d)值算出拷贝数,并用三羟甲基氨基甲烷—盐酸乙二胺四乙酸溶液(trishcl edta, te缓冲液)倍比稀释后作为系列标准品。将fbi1、hccr、βactin系列标准品和待测样本cdna同时在荧光定量pcr仪完成以下程序：93℃预变性2 min，93℃变性30 s,55℃退火45 s,共40个循环。反应结束后,将样本与各基因标准曲线进行对比分别得到fbi1、hccr、βactin的原始拷贝数后,用fbi1原始拷贝数除以βactin原始拷贝数即得fbi1的相对表达量。用hccr原始拷贝数除以βactin原始拷贝数即得hccr的相对表达量。
1.5 统计学方法
所得数据应用spss 110统计软件包处理,对于2个均为计数资料的采用卡方检验fisher精确概率法进行分析；对于1个为计数资料1个为计量资料的,将计量资料以其中位数分为2类后,使用卡方检验fisher精确概率法进行分析；对于2个均为计量资料的采用spearman 相关分析。
2 结果
2.1 荧光定量 pcr检测fbi1 mrna、hccr mrna方法建立
所有提取rna的 d260与d280均在18～20之间。各基因荧光定量pcr扩增动力曲线图和标准曲线见图1、图2,从扩增动力曲线图可见不同模板浓度(101～108 copies/ml)扩增曲线的上升起始点不同,但都呈形状相似的“s”型曲线,分布均匀。从标准曲线图可见不同梯度模板浓度的对数值与阈值(ct)之间有非常好的线性相关关系,标准曲线的直线回归相关系数r都大于0990,表明标准品与ct值有着良好的线性关系。而阴性对照或阴性样本的扩增曲线不是“s”型,而且都处于基线以下。
2.2 血液中fbi1、hccr基因的表达情况
应用已建立的荧光定量法检测fbi1、hccr表达,测得fbi1、hccr在hcc患者、lc患者、以及健康者血液中的表达情况见表2。在大部分患者血液中两者都有表达,其中hcc患者不仅两者的阳性率略高于lc患者,两基因的表达水平也高于lc患者。而在10例健康者血液中均未检测到hccr、fbi1的表达,即hccr mrna、fbi1 mrna在正常人血液当中的阳性率为0％。表2各组血液中fbi1、hccr表达情况（略）
2.3 hcc和lc患者血液中fbi1、hccr表达水平与临床指标的关系
表3结果显示,fbi1 mrna、hccr mrna表达水平与大部分临床指标的关联均无统计学意义,但fbi1 mrna与hccr mrna水平及fbi1 mrna与afp水平的相关分析均有显著性意义(p<001)。表3肝癌相关患者血液中fbi1 mrna、hccr mrna表达水平与临床指标的关系（略）
3 讨论
3.1 肝癌相关患者血液中fbi1 mrna的表达
本研究中设计了更为严格的健康者血液标本的入选标准,即来源于血站的献血者，且确定排除了肝、肾疾病和肝炎病毒感染,从而尽可能的排除未知因素对实验结果的影响。结果显示健康者血液中fbi1 mrna均为阴性,而肝癌、肝硬化患者血液中大多有不同程度的fbi1 mrna表达,提示fbi1 mrna具有作为一个肝癌相关标记物的可能。本研究选用甲胎蛋白(alpha fetoprotein,afp)数值作为临床指标参与统计,发现患者血液中fbi1 mrna表达与afp水平显著相关,而afp数值的动态变化与患者肝癌病情发展有关［7］。本研究还发现肝癌患者血液中fbi1 mrna水平高于肝硬化患者,结合已有研究结果［8］认为：fbi1 mrna在hcc远端转移患者血液中的表达量远高于其他人群,提示血液中fbi1 mrna的水平高低可能与hcc患者的病情发展有关。
3.2 肝癌相关患者血液中hccr mrna的表达
hccr有2种不同的剪接方式,即hccr1和hccr2,研究发现hccr2更多与肿瘤形成有关［4］。因此本研究根据hccr2设计并建立血液中hccr mrna 检测方法。研究发现hccr可增强p53蛋白稳定性，但降低了p53蛋白调控功能,并可下调p21waf1基因启动子活性［4］。而fbi1是通过结合并抑制p14arf基因启动子活性,参与影响p14p53基因信号旁路［1］。说明hccr、fbi1均参与了p14arf～p53～p21waf1通路。本研究发现,hccr mrna的水平与fbi1 mrna水平显著相关，这说明hccr和fbi1在致癌机理上可能有一定的相关性。而fbi1参与作用的p14arf～p53位于该通路上游,所以可能是hccr基因参与了fbi1基因所引起的后续反应。
另基于本研究中发现fbi1与hccr及afp均显著相关,但hccr与afp不相关,提示fbi1基因所引起的后续反应中是否不仅包含hccr基因参与的一条路径,可能还包含其他途径,有待进一步研究证实。
3.3 两基因联合检测肝癌的可能性
本研究发现血液标本中两基因均未检出mrna的患者共有4例,都属于hcc病例。因此在本实验中,两基因联合检测hcc的阳性率(检出率)为90%(37/41)。而因为健康者血液中均未检出两基因的mrna,因此其特异性为100%。同样,肝硬化患者的检出率(3/3)和特异性均为100%。这说明fbi1 mrna、hccr mrna联合检测有可能用于检测肝癌,但其是否能作为一种新的检测方法,则需要更多的hcc、lc患者及其他肝病或其他疾病患者以及健康者的血液标本进行进一步的验证和研究,为中医药治疗肝癌提供新靶点。
(致谢：衷心感谢广东省东莞市中心血站的刘景春博士对本研究的大力支持和帮助!)
【参考文献】
［1］maeda t,hobbs r m,merghoub t,et al. role of the protooncogene pokemon in cellular transformation and arf repression［j］. nature,2005,433(7023)：278．
［2］zhao z h,wang s f,yu l,et al. overexpression of pokemon in nonsmall cell lung cancer and foreshowing tumor biological behavior as well as clinical results［j］lung cancer,2008,62(1)：113．
［3］计勇,何晓顺,马毅,等. pokemon在肝细胞癌及癌旁、癌以远组织、肝硬化组织及正常肝组织中的表达［j］. 中华实验外科杂志,2007,24(2)：187．
［4］ko j,lee y h,hwang s y,et al. identification and differential expression of novel human cervical cancer oncogene hccr2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization［j］. oncogene,2003,22(30)：4679．
［5］chung y j,kim j w. novel oncogene hccr: its diagnostic and therapeutic implications for cancer［j］. histol histopathol,2005,20(3)：999．
［6］ha sa,shin s,kim h,et al. oncoprotein hccr1 expression in breast cancer is well correlated with known breast cancer prognostic factors including the her2 level, p53 mutation, and er/pr expression［j］. bmc cancer,2009,9(1)：51．
［7］ liaw y f,tai d i,chen t j,et al. alphafetoprotein changes in the course of chronic hepatitis: relation to bridging hepatic necrosis and hepatocellular carcinoma［j］. liver,1986,6(3)：133．
［8］计勇,何晓顺,马毅,等. pokemon在肝细胞癌、肝细胞癌远处转移、肝硬化和健康人群外周血中的表达及意义［j］. 中华实验外科杂志,2007,24(11)：1320．
