作者：江远，张玲，何金洋，郭兴伯
【摘要】 【目的】观察复方肝毒清对铁超载肝星状细胞(hsc)活化和凋亡的影响。【方法】体外培养hsct6细胞，分为正常对照组、模型组、中药组(给药浓度为008 g/l)。以柠檬酸铁胺(fac)与hsct6细胞共同温育，建立hsc铁超载模型。采用免疫组化法检测hsct6细胞α平滑肌肌动蛋白(αsma)的表达，半定量聚合酶链反应(pcr)法检测细胞转化生长因子β1(tgfβ1 )mrna的表达，tunel法检测hsct6细胞的凋亡，电镜观察hsct6细胞超微结构。【结果】正常对照组和模型组hsct6细胞αsma大量表达，未见或仅见有较少细胞发生凋亡，而中药组hsc细胞αsma表达明显减少，tgfβ1 mrna表达显著降低(p<005)，且出现明显细胞凋亡。【结论】中药复方肝毒清可能通过调节细胞铁的代谢，抑制hsc活化并诱导其发生凋亡，从而在体外发挥抗肝纤维化作用。
【关键词】 肝纤维化/中药疗法;复方肝毒清/药理学;肝星状细胞/病理学;肝星状细胞/超微结构;细胞培养
铁超载与肝纤维化关系密切。WwW.133229.Com研究表明，铁可通过诱导肝星状细胞(hepatic stellate cells，hsc)活化引起胶原沉积，从而导致肝纤维化的发生[1]。复方肝毒清具有抗乙肝病毒[2]、保护免疫性肝损伤[3]以及抗肝纤维化作用[4]。既然以扶正利湿解毒为治疗原则的复方肝毒清具有抗肝纤维化作用，那么复方肝毒清能否抑制铁诱导的hsc活化，并影响hsc的转归?本实验观察了复方肝毒清对铁超载hsc活化和凋亡的影响，旨在研究复方肝毒清对肝纤维化的体外逆转作用。现报道如下。
1材料与方法
11细胞系hsct6细胞为sv40转染sd大鼠的肝星状细胞系，其表型为活化的肝星状细胞，由汪晓军博士惠赠。
12中药复方复方肝毒清主要由白花蛇舌草、三七、旱莲草、太子参、白芍等8味中药组成，药材均购于广州采芝林医药连锁店。购回后以蒸馏水500 ml煎煮2次，每次30 min，将2次药液合并后浓缩为1 kg/l浓度，冷藏后尽快使用。
13主要试剂与仪器柠檬酸铁胺[ammonium iron (ⅲ) citrate，fac]，化学纯，购于国药集团化学试剂有限公司，批号：20060519，将fac溶解于培养基中过滤，4℃保存，备用。噻唑蓝(mtt)由吉泰科技有限公司提供(批号：20050412)，鼠抗α平滑肌肌动蛋白(αsma，批号：bm0002)、山羊抗小鼠igg(sa1020)、二氨基联苯胺(dab)显色试剂盒(ar1022)、细胞凋亡检测试剂盒(mk1020)均由武汉博士德公司提供，转化生长因子β1(tgfβ1)引物、鼠类白血病病毒逆转录酶(mmlv逆转录酶)、脱氧核苷三磷酸(dntp)、rna 酶抑制剂(rnase inhibitor)均购自fermentas公司，master mix荧光定量聚合酶链反应(pcr)试剂盒购于日本toyobo公司，trizol rna抽取试剂购于mrc公司。7300型荧光定量pcr仪购于abi公司。
14细胞毒性实验(mtt比色法)细胞按1×108/l密度接种于96孔培养板中，至细胞长满单层后，弃培养液。fac设800、400、200、100、50、25、125、625 μmol/l共8个浓度，复方肝毒清设10、2、04、008、0016、0003 2、0000 64、0000 128 g/l共8个浓度，每个浓度重复4孔，同时设立正常细胞作为对照组，继续培养24 h后，加mtt溶液(5 g/l)20 μl/孔，37℃孵育3 h。吸去上清，加入二甲基亚砜(dmso)150 μl/孔，震荡20 min，全自动酶标仪测定各孔吸光度(d)值，测定波长为490 nm。计算细胞生长抑制率：p抑制=(d对照组-d给药组)/d对照组×100%。选择最大无细胞毒作用的fac和中药浓度进行以下实验。
2010年第27卷广州中医药大学学报江远，等.复方肝毒清对铁超载肝星状细胞活化和凋亡的影响第1期15建立hsc细胞铁超载模型hsct6细胞培养于6孔板，每孔中均置入18 cm2之正方形盖玻片(无菌处理)。细胞分为正常对照组、铁超载模型组。待细胞贴壁长满后铁超载模型组中加入25 μmol/l fac(最大无细胞毒浓度)，正常对照组为正常培养的hsct6细胞。细胞培养24 h后弃上清，用40 g/l多聚甲醛固定30 min，予体积分数75%酒精洗5 min。蒸馏水漂洗晾干后行普鲁士蓝染色，显微镜下观察。
16hsc细胞αsma表达及细胞凋亡的检测
161分组及处理hsct6细胞培养于6孔板，每孔中均置入18 cm2之正方形盖玻片(无菌处理)。细胞分为正常对照组、模型组、中药组。正常对照组为正常培养的hsct6细胞，模型组为经25 μmol/l fac处理并证实铁超载的hsct6细胞，中药组为铁超载并经008 g/l(最大无细胞毒浓度)中药复方处理的hsct6细胞。继续培养24 h。
162hsc细胞αsma表达检测弃上清，无菌磷酸盐缓冲液(pbs)洗2次，用40 g/l 多聚甲醛固定30 min，蒸馏水漂洗晾干。以体积分数30% h2o2 1份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗1~2次。滴加体积分数50 g/l牛血清白蛋白(bsa)封闭液，室温20 min，甩去多余液体。滴加适量一抗(1 ∶100~1 ∶500稀释)，37℃、1 h，pbs(ph 72~76)洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠igg，20℃~37℃、20 min,pbs洗2 min×3次。滴加试剂链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(sabc)，20℃~37℃、20 min,pbs洗5 min×4次。dab显色，蒸馏水洗。苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察。
163hsc细胞凋亡的检测(tunel法)弃上清，无菌pbs洗2次，用40 g/l 多聚甲醛固定30 min，蒸馏水漂洗晾干。新鲜配制体积分数3% h2o2，室温处理10 min，蒸馏水洗。标本加标记缓冲液(labeling buffer)，20 μl/片，保持盖玻片湿润。按每张片各取1 μl，加入18 μl标记缓冲液，混匀。甩去片上多余液体，加标记液20 μl /片，样品放在湿盒中，37℃水浴箱标记1 h，tris缓冲生理盐水(tbs)冲洗，加封闭液50 μl /片，37℃、30 min，甩去封闭液，不洗。用封闭液1 ∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，50 μl /片，置于湿盒中，37℃反应30 min，tbs冲洗3次，每次2 min。tbs ∶sabc(体积比)=1 ∶100混匀滴加，37℃反应60 min，tbs洗涤。dab显色，蒸馏水洗。苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察。细胞核中见棕色颗粒者即为凋亡细胞。
164电镜观察用25 g/l胰酶消化细胞，离心后用戊二醛固定，包埋后制成超薄切片，电镜观察拍照。
17定量pcr检测hsc细胞tgfβ1 mrna表达
171分组及处理hsct6细胞培养于24孔板，并将细胞分为正常对照组、模型组、中药组，每组重复5孔，各组处理方法同161项。
172标本收集及rna提取收集细胞标本，用25 g/l的胰酶消化，然后离心，弃去上清，向沉淀中加入02 ml trizol，然后加入40 μl氯仿，室温放置10 min，然后4℃、12 000 r/min离心15 min。去上清，加入另一个无rna酶的离心管中，加100 μl异丙醇，混匀后室温放置10 min，然后4℃、12 000 r/min 离心10 min，弃上清，向管中加入体积分数75%乙醇，8 000 r/min 离心5 min，弃去乙醇并用滤纸吸干残余液体，加入30 μl无rna酶的水，然后立即进行逆转录。
173逆转录及定量pcr检测hsc细胞tgfβ1 mrna的表达逆转录反应体系组成：10倍buffer 2 μl、10 mmol/l dntp 1 μl、rnase inhibitor 20 μl、oligo dt引物05 μl、mmlv逆转录酶1 μl、模板rna 8 μl，加无rna酶的水至20 μl。tgfβ1引物序列：sense：5’gacggaatacagggc
tttcg3’;antisense：5’cctcgacgtttgggactgat3’。gapdh(内参照基因)：sense：5’ctcccat
tcctccacctttg3’;antisense：5’atgaggtcc
accaccctgtt3’。反应条件为：30℃、10 min，42℃、1 h，99℃、5 min，然后进行定量pcr。定量pcr采用25 μl体系，引物浓度为250 nmol/l，扩增条件为：95℃变性1 min，然后95℃、15 s，60℃、1 min，40个循环。然后进行定量分析，以目的基因与内参照基因的比值(p)表示tgfβ1 mrna的表达。
18统计学方法采用spss 115 统计软件进行统计分析。
2结果
21fac及复方肝毒清对hsc细胞增殖的抑制作用不同浓度fac和复方肝毒清处理24 h，hsc细胞生长受到抑制，抑制率随剂量增加而升高，结果见表1、表2。选择25 μmol/l fac和008 g/l复方肝毒清继续进行实验。表1fac对hsc细胞增殖的抑制作用表2复方肝毒清对hsc细胞增殖的抑制作用
22铁超载hsc细胞模型的病理特点见图1。经普鲁士蓝染色后，镜下hsc细胞核呈红色，铁超载模型组细胞可见蓝色铁颗粒沉积于细胞质中，正常对照组细胞未见铁颗粒沉积。
23复方肝毒清对铁超载肝星状细胞活化的影响
231复方肝毒清对铁超载肝星状细胞αsma表达的影响见图2(彩图见第100页)。经免疫组化染色，镜下可见正常对照组hsc明显活化，αsma大量表达，表明体外培养的hsct6本身已经活化，αsma表达明显。模型组hsc细胞αsma亦大量表达，说明适量的铁能诱导hsc细胞活化。而中药组hsc细胞αsma表达较正常对照组和模型组明显减少，提示细胞活化受到不同程度抑制。
232复方肝毒清对铁超载hsc细胞tgfβ1 mrna表达的影响由表3可见，模型组tgfβ1 mrna表达与正常对照组比较差异无显著性意义(p>005)，说明适量的铁能诱导hsc细胞tgfβ1 mrna表达。中药组能显著下调tgfβ1 mrna表达(p<005)，提示中药复方能在转录水平抑制hsc细胞tgfβ1的分泌，从而抑制hsc细胞活化。表3各组铁超载hsc细胞tgfβ1 mrna的表达比较
24复方肝毒清对铁超载hsc细胞凋亡的影响见图3(彩图见第100页)。镜下可见细胞核呈蓝色，细胞核中见棕褐色颗粒者为凋亡细胞。正常对照组、模型组hsc未见或仅见有较少细胞发生凋亡。而中药组hsc则见明显细胞凋亡，凋亡细胞的细胞核呈棕褐色，并可见凋亡小体。
25各组对hsc细胞超微结构的影响见图4。正常对照组hsc细胞内细胞器结构如线粒体、粗面内质网形态正常。模型组出现大量双核细胞，细胞质中线粒体、内质网等细胞器明显减少。中药组hsc细胞发生凋亡，其特点是凋亡细胞形态变小，核染色体堆积，线粒体、内质网等细胞器明显减少，代之以大量空泡。
铁是各类细胞生长和分化的必需元素。对于铁在肝纤维化的发生、发展过程中的机制，目前有以下几种学说：①铁是肝纤维化的诱导者(直接发起者)。体外研究[1]表明，在无肝脏坏死性炎症情况下，铁通过刺激hsc可引起胶原沉积。②铁是肝纤维化的介导者(间接发起者)。铁通过激活过氧化反应，产生氧自由基，导致细胞内蛋白和dna脂质过氧化损伤，介导肝细胞炎症和坏死[5]。③铁还可协同其他肝细胞毒性因素共同导致肝纤维化的发生，被称为是肝纤维化的协同发起者。研究显示[6-8]对于人类和动物的多种疾病如非酒精性脂肪性肝炎(nash)、慢性丙型病毒性肝炎(chc)、酒精性肝病(ald)，肝铁浓度(hic)增加均可促进肝纤维化的发展。
本研究选择对hsc无毒性作用的25 μmol/l fac (ⅲ价铁)与hsc共同温育24 h。经铁染色后发现，铁超载模型组可见蓝色铁颗粒沉积于细胞质中，而正常对照组细胞未见铁颗粒沉积。hsc细胞铁超载模型的成功建立，不仅证实了铁沉积于hsc细胞的重要病理变化，同时也为研究中药干预铁超载肝星状细胞活化和转归的肝纤维化机理奠定了基础。
hsc活化是肝纤维化发生、发展的核心环节，是产生细胞外基质(extracellular matrix，ecm)的主要效应细胞。hsc活化的形态特征为细胞内脂滴消失，转化为肌成纤维样细胞，表达标志性蛋白αsma。tgfβ1是组织损伤后的强效致纤维化因子。在肝纤维化中，tgfβ1是最有效的刺激因子已经达成广泛共识。tgfβ1 对hsc细胞影响是多方面的：tgfβ1可以上调hsc表达ⅰ、ⅲ、ⅳ型胶原以及纤维连接蛋白、层粘蛋白、透明质酸、硫酸软骨素，释放细胞因子及炎症介质，包括tgfβ1自身形成tgfβ1 的自分泌环路从而促进静息hsc激活[9]。本研究结果显示，复方肝毒清能使铁超载hsc细胞αsma表达显著减少，且能显著下调铁超载hsc细胞tgfβ1 mrna的表达(p<005)，通过在转录水平抑制hsc细胞tgfβ1 的分泌，使铁诱导的hsc细胞活化受到抑制。通过电镜和tunel法均发现中药组hsc细胞出现明显细胞凋亡。这些结果表明，复方肝毒清能下调hsc细胞tgfβ1 mrna的表达，抑制hsc细胞活化，甚至诱导其转为静止或发生细胞凋亡。
但是，关于hsc的铁代谢机制尚不清楚。hsc细胞存在铁蛋白受体和转铁蛋白受体[10-11 ]。推测枯否细胞可能通过吞噬衰老的红细胞并释放铁蛋白，然后被hsc细胞摄取。这一过程可能是通过结合铁的铁蛋白与hsc细胞表面的转铁蛋白受体结合形成复合物，以吞饮的方式进入细胞，然后铁从内吞小体中释放出来[12]。因此，在肝脏铁的代谢过程中，hsc可能与肝细胞、枯否细胞一起在铁的贮存(通过铁蛋白)和转运(通过转铁蛋白)过程中发挥重要作用。我们推测，中药复方肝毒清可能是通过调节hsc细胞铁的代谢，并影响hsc细胞的活化和转归，从而发挥抗肝纤维化作用。具体机制有待进一步研究。
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