【摘要】 目的: 构建用于rnai的shrna（small hairpin rna）表达载体及检测其对低氧诱导因子1（hypoxiainducible factor1, hif1）基因的沉默效果。方法: 从人血基因组中pcr扩增出h1基因启动子, 克隆入酶切处理后的pegfpc1载体片段中, 此载体命名为pwh1。以人hif1 cdna基因为靶标设计引物, 退火后克隆入pwh1。新的载体转染sgc7901细胞, 然后用rtpcr和western blot检测hif1基因的表达改变。结果: 构建的pwh1载体能很好地表达针对hif1基因的shrna, rtpcr和western blot的结果显示hif1基因的mrna和蛋白表达水平均明显下降。结论: 成功构建了shrna表达载体pwh1, 这对于基因的功能研究具有重要的意义。
【关键词】 shrna 表达载体 rna干涉 hif1基因
[abstract]aim: to construct the expression vector of small hairpin rna（shrna）and to test its efficacy in silencing the hypoxiainducible factor1 (hif1)gene. methods: the h1 gene promoter was amplified from the genome of the human blood cells by pcr. then the promoter was cloned into the pegfpc1 vector digested with the restriction enzyme. the constructed vector was named pwh1. the primer was designed to target the human hif1 cdna gene. the annealed primer fragment was cloned into pwh1. the new constructed plasmid was transfected into the sgc7901 cell line. then the expression level of hif1 gene was assayed by rtpcr and western blot. results: the newly constructed plasmid expressed shrna to target the hif1 gene.the results of rtpcr and western blot showed the expression of hif1 gene was reduced dramaticaly in mrna and at protein level. conclusion: the successful construction of shrna expression vector (pwh1) provides a tool for further research into the function of a novel gene.
[keywords]shrna; expression vector; rna interference; hif1 gene
rna干涉(rna interference, rnai)是将双链rna（dsrna）导入细胞引起特异基因mrna降解的一种细胞反应过程。wwW.133229.COm它是转录后基因沉寂（ptgs）的一种。1998年, fire等[1]在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现, 由正义和反义rna退火形成的dsrna引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义rna强10倍以上。dsrna引起的基因表达抑制不是正义或反义rna引起的基因表达抑制在数学上的叠加, 这就说明dsrna触发了细胞内的一些反应机制, 从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果。当时, 他们就把这种现象命名为rnai。rnai的应用谱非常广泛, 从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫, 其次就是果蝇。哺乳动物细胞的rnai应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。wianny等[2]将dsrna用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了rnai。sayda等[3]用人工合成的21ntrna二合体在培养的哺乳动物细胞成功进行了rnai。brummelkamp等[4]利用载体表达的shrna在许多培养的人源, 猴源和鼠源的哺乳动物细胞的rnai实验中取得了成功。
在真核细胞内, rna聚合酶iii能指导短rna的表达和rna聚合酶iii结合的启动子有h1, u6等。目前, 这两种启动子都被尝试作为表达短rna的工具。本实验旨在克隆得到的h1启动子的基础上构建一个能稳定表达shrna的真核载体。然后针对hif1基因mrna设计靶标, 在培养的sgc7901细胞（胃癌细胞系）内进行rnai实验, 以观察新建的pwh1载体在基因沉默中的使用效率。这将为以后新基因的功能研究和基因治疗奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 pegfpc1质粒为clontech公司产品; 各种限制性内切酶为neb公司产品。t4连接酶、 pfu dna聚合酶和dl 2000 dna marker为takara公司产品。各种引物均由北京赛百盛公司合成。sgc7901细胞由全军消化病研究所保存。superscript ii反转录试剂盒购自invitrogen公司; 兔抗人hif1多抗、 兔抗人βactin多抗和western blot luminol reagent为santa cruz公司产品。top10菌种由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 以pegfpc1为框架构建shrna表达载体pwh1 (1)用ase i和mlu i双酶切, 去掉pegfpc1质粒上pcmv, egfp, mcs 和sv40polya等片段, 剩余的部分作为构建pwh1的框架。在ase i和mlu i之间加上一个接头dna序列, 该段接头dna由下面2条引物退火形成（退火温度: 39.5℃）: 序列1: 5′taatggaattcgaagctta3′; 序列2: 5′cgcgtaagcttcgaattccat3′。(2)通过pcr从人血细胞基因组dna获得h1 rna基因promoter[5]。取新鲜血液20 ml, 以1300 r/min离心15 min, 取淡黄层细胞（白细胞）重悬于15 ml抽提缓冲液（10 mmol/l triscl ph8.0, 0.1 mmol/l edta ph8.0, 20 mg/l胰rna酶, 5 g/l sds）, 37℃温育1 h。加蛋白酶k至终浓度为100 mg/l, 温和混匀。50℃水浴中放置3 h。冷却至室温后, 用等体积酚和氯仿抽提后, 加入0.2体积10 mol/l乙酸铵和2体积的乙醇, 放置30 min, 12000 r/min离心10 min。700 ml/l乙醇洗涤2次, 空气中晾干。加入1 ml te(ph8.0)溶解dna, 此即人血细胞基因组dna。以此dna为模板, pcr引物为: p1: 5′ccatggaattcgaacgctgacgtc3′(含ecor i位点); p2: 5′gcaagcttagatctgtggtctcatacagaacttataagattccc3′ (含hind iii, bgl ii位点)。 pcr产物通过ecor i和hind iii两个酶切位点克隆入puc19质粒, 进行序列验证。(3)pwh1载体的构建: pcr产物用ecor i和hind iii双酶切, 克隆入同样用这两种酶双酶切的上述框架载体。新载体命名为pwh1。
1.2.2 用pwh1进行沉默hif1基因的表达 (1)以人hif1 cdna基因为靶标的引物设计: 选取人hif1 cdna基因(genbank登录号: af304431)中的512～530核苷酸为靶标, 设计两条引物。序列如下: 引物1: 5′gatcccctgaagtgtaccctaactagttcaagagactagttagggtacacttcatttttggaaa3′; 引物2: 5′agcttttccaaaaatgaagtgtaccctaactagtctcttgaactagttagggtacacttcaggg3′。(2)构建针对hif1基因的shrna表达载体pwh1hif1。将上面合成的两条引物用te（ph8.0）稀释成0.5 nmol/μl。各取5 μl混匀, 沸水中放置10 min, 缓慢冷却至室温→4℃→-20℃保存备用。用限制性内切酶bgl ii和hind iii对质粒pwh1做双酶切。用t4连接酶对pwh1质粒和退火产物进行连接。将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。铺于含卡那霉素的lb平板上, 37℃培养24 h。挑取单克隆并提取质粒。用限制性内切酶ecor i和hind iii对候选阳性克隆质粒做双酶切鉴定。阳性克隆质粒命名为pwh1hif1。（3）转染胃癌细胞系sgc7901: sgc7901细胞用rpmi1640培养液（含100 ml/l小牛血清）在37℃、 50 ml/l co2条件下培养。转染前24 h将处于对数生长期的细胞重新接种于6孔板（瞬时）和24（稳定）孔板中, 贴壁细胞在长满底面积80%时进行转染。转染按照lipofectaminetm2000试剂说明书操作。于转染后48 h收集6孔板内细胞,做为瞬时转染细胞表型鉴定用。于转染后72 h按1∶10比例传代于60 mm直径培养皿中, 然后加入适量(400～1000 mg/l)g418进行筛选, 2周后挑取单个细胞集落, 扩大培养, 然后做为稳定转染细胞表型鉴定用。(4)rtpcr检测hif1基因的mrna水平: 待6孔板内细胞生长至底面积90%～95%时, 收集细胞。参照gibco公司trizol试剂使用方法提取细胞rna, 溶于20 μl depc水内。用superscripttm ii rt kit参照其使用说明进行cdna第1条链的合成。人βactin内对照引物: p1: 5′ggccgggacctgactgactac; p2: 5′tctttgcggatgtccacgtc（长度331 bp）。人hif1 rtpcr引物: p3: gatctcggcgaagtaaagaatctg; p4: agaaaatttcatatccaggctgt（长度680 bp）。pcr反应条件: 95℃ 1 min(94℃ 40 s; 56℃ 40 s; 72℃ 40 s)×26 cycle; 72℃ 10 min; 4℃保存。(5)western blot检测hif1的蛋白水平: 已处理的转染细胞样品经sds聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 100 伏转移3 h至nc膜上, 50 g/l脱脂奶粉室温封闭2 h, 依次加入1∶2500稀释的兔抗人一抗4℃孵育过夜, 1∶5000稀释的hrp标记的鼠抗兔二抗作用2 h, 加入luminol试剂, 并以x光片捕捉hrp催化luminol试剂所产生的激发光。
2.1 shrna表达载体pwh1构建的实验结果
2.1.1 从人血细胞基因组dna中扩增得到h1 rna基因promoter pcr反应体系: dna模板2 μl, p11 μl, p21 μl, taq 0.5 μl, dntp 2 μl, 10×buffer 5 μl, h2o 38.5 μl, 总体积50 μl。pcr反应条件为: 94℃ 5 min(94℃ 30 s; 45℃ 45 s; 72℃ 30 s)×5 cycle; (94℃ 30 s; 56℃ 45 s; 72℃ 30 s)×25 cycle; 72℃ 2 min; 4℃保存。10 g/l琼脂糖凝胶电泳后, 在250 bp左右可以见到一扩增条带(图1), 大小与理论预计一致。
图1 h1基因启动子的pcr扩增电泳结果（略）
fig 1 age analysis of pcr products encoding h1 gene promoter
m: dna marker dl 2000; 1: pcr of h1 gene promoter.
2.1.2 重组质粒puc19h1的酶切鉴定 上述pcr产物经ecor i和hind iii双酶切后, 克隆入puc19载体。阳性克隆命名为puc19h1（图2）。puc19h1质粒递交上海生工公司测序, 结果显示, 与genbank的h1基因启动子序列（登录号: x16612）完全一致。
图2 重组质粒puc19h1的酶切鉴定结果（略）
fig 2 age analysis of recombinant plasmid puc19h1 digested with ecor i and hind iii
m: dna marker dl 2000; 1, 2: puc19 h1.
2.1.3 pwh1双酶切鉴定 pegfpc1质粒经ase i和mlu i双酶切后, 加上一段由2条引物退火形成的接头dna, 此框架质粒命名为pwk。再利用接头上带有的ecor i和hind iii酶切位点将puc19h1质粒上的目的片段亚克隆到这个框架质粒上。新的质粒命名为pwh1(图3)。
图3 pwh1质粒的酶切鉴定结果（略）
fig 3 age analysis of plasmid pwh1 digested with ecor i and hind iii
m: dna marker dl 2000; 1: pwk; 2: pwh1.
2.2 pwh1hif1的酶切鉴定结果 将合成的2条引物退火后, 从bgl ii和hind iii两个酶切位点克隆到质粒pwh1。新的质粒命名为pwh1hif1。用ecor i和hind iii对pwh1hif1进行双酶切鉴定（图4）, 阳性克隆切下约310 bp片段, 阴性克隆切下约250 bp片段。
图4 pwh1hif1质粒的酶切鉴定（略）
fig 4 age analysis of recombinant plasmid pwh1hif1 digested with ecor i and hind iii
m:dna marker dl 2000; 1: pwh1hif1; 2: pwh1.
2.3 pwh1hif1瞬时转染sgc7901细胞 将准备好的pwh1hif1质粒5 μg用脂质体方法转染入sgc7901细胞, 48 h后收集细胞。用trizol试剂抽提细胞rna, 进行rtpcr。12 g/l琼脂糖凝胶电泳结果（图5）可以看出, rnai后和对照组相比mrna被明显降解。
图5 pwh1hif1瞬时转染sgc7901细胞后的rtpcr结果（略）
fig 5 rtpcr result of sgc7901 cells transient transfected with pwh1hif1
m: dna marker; 1: sgc7901; 2: sgc7901transfected with pwh1; 3: sgc7901 transfected with pwh1hif1.
2.4 pwh1hif1稳定转染sgc7901细胞 将准备好的pwh1hif1质粒2 μg用脂质体方法转染入sgc7901细胞, 按有限稀释法挑取单克隆细胞。用trizol试剂抽提细胞rna, 进行rtpcr。12 g/l琼脂糖凝胶电泳结果（图6）可以看出, rnai后和对照组相比mrna被明显降解。
图6 pwh1hif1稳定转染sgc7901细胞后的rtpcr结果（略）
fig 6 rtpcr result of sgc7901 cells stable transfected with pwh1hif1
m: dna marker; 1: sgc7901 transfected with pwh1hif1; 2: sgc7901 transfected with pwh1; 3: sgc7901.
2.5 western blot检测hif1基因的rna干涉效果 挑取3个稳定转染pwh1hif1质粒的sgc7901单克隆细胞。用抗hif1抗体进行western blot和化学发光显色（图7）可见, rnai后和对照组相比hif1的蛋白表达水平明显下降。
图7 pwh1hif1稳定转染sgc7901细胞后的western blot结果（略）
fig 7 western blot result of sgc7901 cells stable transfected with pwh1hif1
1-3: 3 sgc7901 cell clones transfected stably with pwh1hif1; pwh1: sgc7901 cell clone transfected stably with pwh1.
3 讨论
rnai一经发现, 立即成为科学研究的一大热点。这是因为rnai这个生物领域的新兴事物, 本身具有它的神秘性, 同时又具有广阔的应用前景[6]。rnai已经被应用到线虫的系统性功能基因组研究上, rnai作为一个工具, 它的应用范围可以从单细胞的原生动物一直扩展到人。使哺乳动物细胞产生特定基因的功能丧失表型, 对于新基因功能研究、 新蛋白质药物的开发和基因治疗等方面都具有重要的意义。本实验构建的pwh1载体, 能在真核细胞内表达shrna, shrna可以有效模仿sirna, 使目标蛋白的mrna发生特异性的降解。pwh1可被广泛用于真核细胞的rnai实验模型。
缺氧诱导因子1(hif1)是机体细胞在低氧环境中产生的一种结合dna蛋白质因子, 在低氧信号中起到一个重要的中介作用, 通过转录水平参与对低氧反应基因的调控, 从而使机体对低氧刺激作出复杂的病理生理反应［7］。hif1在多种肿瘤中广泛存在, 它与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点缺氧反应元件(hypoxia response element, hre)结合, 从而启动靶基因的转录表达, 同肿瘤的增殖、 转移密切相关［8］。talks等[9]发现大多数恶性肿瘤细胞中有hif1表达, 且hif1在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘表达明显增多。本实验在胃癌细胞系sgc7901中利用所构建的pwh1载体成功降低了hif1基因的表达, 这对研究胃癌的发生、 增殖、 多药耐药和治疗等均有重要的意义。
【参考文献】
[1] fire a, xu s, montgomery mk, et al. potent and specific genetic interference by doublestranded rna in caenorhabditis elegans[j]. nature, 1998, 391(6669): 806-811.
[2] wianny f, zernickagoetz m. specific interference with gene function by doublestranded rna in early mouse development[j]. nat cell biol, 2000, 2(2): 70-75.
[3] sayda me, jens h, winfried l, et al. duplexes of 21nucleotide rnas mediate rna interference in cultured mammalian cells[j]. nature, 2001, 411: 494-498.
[4] brummelkamp tr, bernards r, agami r. a system for stable expression of short interfering rnas in mammalian cells[j]. science, 2002, 296(5567): 550-553.
[5] 萨姆布鲁克j, 弗里奇ef, 曼尼阿蒂斯t（金冬雁, 等译). 分子克隆实验手册[m]. 北京: 科学出版社, 1996: 465-467.
[6] 吴元明, 陈苏民. rna干涉最新研究进展[j].
