【摘要】 目的: 构建pcdna3.1()/xapc7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系smmc7721中的表达。方法: 采用pcr法从pet28b/xapc7重组质粒中克隆得到xapc7 cdna全长序列, 将之与pmd18t载体连接、 测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcdna3.1()中。构建好的pcdna3.1()/xapc7真核表达质粒经酶切鉴定后, 采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系smmc7721, 经g418筛选, 得到阳性克隆细胞株, 再应用半定量rtpcr技术检测转染前后该细胞株xapc7基因的mrna表达水平。结果: pcdna3.1()/xapc7经酶切鉴定及dna测序证实, 目的基因xapc7的序列完全正确, 真核表达载体构建成功; 经rtpcr检测, 重组质粒转染株的xapc7基因mrna表达水平高于对照组, 证实xapc7基因已经稳定转染到smmc7721细胞中并得到表达。结论: 成功地建立了人基因xapc7的稳定转染细胞株, 为进一步研究xapc7的功能奠定了实验基础。
【关键词】 真核表达质粒 smmc 7721 xapc7 构建 表达
xapc7基因编码人类蛋白酶体α7亚基（proteasome subunit, alpha type 7）, 该蛋白是20s蛋白酶体核心复合体的一个α亚基。WWw.133229.coM作为蛋白酶体的一个亚基, xapc7编码产物参与了hbv、 hcv和hiv病毒的复制及多种蛋白质的降解, 并与hbx、 hif1、 cabl及arg等多种肿瘤相关的重要蛋白质相互作用; 同时该蛋白还参与膜蛋白的转运及对蛋白酶体活性的调节等; 此外本基因定位于20q13.33染色体, 既往研究提示人类肿瘤普遍伴随20 q的扩增[1, 2], 但xapc7在肿瘤方面的研究目前国内外鲜有报道。为了研究xapc7编码蛋白在肿瘤发生发展中的作用, 我们构建了重组人xapc7真核表达质粒, 并将其转染入人肝癌细胞系smmc7721中, 以便进一步探讨其对肝癌细胞生长、 死亡以及浸润、 转移的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌dh5α和人肝癌细胞系smmc7721均由本实验室保存。原核重组表达质粒pet28b/xapc7由上海复旦大学季朝能教授提供。质粒小量抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自优晶公司。限制性核酸内切酶bamh i、 xho i、 t4 dna连接酶、 dna mr标准(dl 2000)、 pmd18t载体均购自大连宝生物工程有限公司。阳离子脂质体lipofectamine2000、 trizol试剂、 g418和pcdna3.1()真核表达载体购自invitrogen公司。新生牛血清(fbs)购自gibcobrl公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 为人xapc7基因克隆及半定量鉴定之用, 根据genbank的基因序列(nm_002792), 应用软件primer designer 5.0各设计一对克隆引物及半定量引物。克隆引物: 上游: 5′ctcgagatgagctacgaccgc3′; 下游: 5′ggatcctgatgctttcttttgtttc3′, 在上、 下游引物中分别引入xho i、 bamh i酶切位点, 扩增大小为747 bp的人xapc7 cdna全长序列; 半定量引物: 上游: 5′gccatcaccgtcttctcg3′; 下游 5′gcccattgctctgcgtat3′, 扩增片段长度为355 bp。内参照βactin的引物序列为: 上游: 5′tgtgacgtggacatccgcaaag3′; 下游: 5′tggaaggtggacagcgaggc3′, 扩增片段为206 bp。所有引物均由invitrogen公司合成。
1.2.2 目的基因cdna的获取 以pet28b/xapc7原核重组表达质粒为模板进行pcr扩增, 反应体系, 质粒模板0.1 μl, 10×extaq pcr buffer 5 μl, dntp(2.5 mmol/l) 4 μl, 灭菌蒸馏水38.65 μl, takara extaq (5 u/μl) 0.25 μl, 上游引物(20 μmol/l) 1 μl, 下游引物(20 μmol/l) 1 μl; 反应条件: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 40 s扩增25个循环; 72℃延伸7 min。pcr产物电泳后, 切胶回收目的片段。
1.2.3 t载体克隆 用凝胶回收试剂盒回收纯化pcr产物, 并用pmd18t载体连接试剂盒将目的片段与pmd18t载体连接。连接反应体系为: solutioni 5 μl, pmd18t dna 1 μl(约50 ng), pcr产物 1 μl(约50 ng), dh2o 3 μl, 置于16℃连接2 h后, 用大肠杆菌dh5α感受态进行转化。随机挑取几个单菌落, 用xapc7克隆引物进行菌落pcr检测, 将阳性克隆菌落扩大培养, 送至invitrogen公司测序。测序正确的克隆命名为: pmd18t/xapc7。
1.2.4 真核表达载体pcdna3.1()/xapc7的构建 用bamh i、 xho i分别双酶切重组pmd18t/xapc7质粒及pcdna3.1()空载体, 凝胶电泳后回收目的基因片段, 连接、 转化并挑取单菌落, 用xapc7克隆引物进行菌落pcr检测, 将阳性克隆菌落扩大培养, 提取重组质粒pcdna3.1()/xapc7。
1.2.5 细胞培养 smmc7721细胞在含100 ml/l新生牛血清的rpmi1640培养液中, 于37℃ 50 ml/l co2饱和湿度的孵箱中培养。
1.2.6 smmc7721细胞的基因转染和筛选培养 将处于对数生长期的smmc7721细胞重悬于完全培养液中, 以3×105个细胞/孔接种于6孔板中, 培养24 h, 使细胞达到80%～90%融合。用脂质体lipofectamine2000分别介导空质粒及重组质粒转染细胞, 并设空白未转染组作对照（参照说明书）。转染24 h后采用不同浓度g418进行筛选, 以对照组细胞全部死亡时的g418浓度（800 mg/l）作为参照, 2周后g418改为400 mg/l维持筛选。用选择培养液（400 mg/l g418）培养4周后, 分离出存活的抗g418的阳性克隆, 最后用含100 ml/l新生牛血清的选择培养液扩大培养备用。
1.2.7 转染后真核表达的rtpcr鉴定 以βactin为内参照, 采用rtpcr法用半定量引物扩增xapc7基因, 对转染细胞内目的基因的mrna表达情况进行鉴定。扩增产物用25 g/l的琼脂糖凝胶电泳观察图像。转染细胞总rna的提取、 rtpcr的具体操作均按试剂盒说明书进行。
2.1 xapc7目的基因的pcr产物鉴定 经20 g/l琼脂糖凝胶电泳, 在约750 bp处有明亮条带, 与预期目的片段大小一致（图1）。
图1 pcr产物20 g/l琼脂糖凝胶电泳（略）
m: dl 2000 dna marker; 1: xapc7.
2.2 t载体克隆的鉴定 目的基因与t载体连接后, 菌液pcr扩增产物经20 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定与目的基因大小相符, 表明所挑选的几个单菌落均为阳性克隆。菌液测序结果示: 装入t载体的序列与genbank上登录的人xapc7 cdna序列比较完全相符。
2.3 真核表达载体的构建与鉴定 将用bamh i、 xho i双酶切重组质粒pmd18t/xapc7得到的目的基因插入pcdna 3.1()空质粒, 获得pcdna3.1()/xapc7真核表达质粒, 该质粒再经bamh i、 xho i双酶切鉴定, 得到了747 bp的目的片段和约5400 bp的载体片段（图2）, 送测序证实该质粒含有完全正确的xapc7 cdna序列。
图2 重组质粒pcdna3.1()/xapc7双酶切鉴定（略）
m: dl 2000 dna marker; 1-3: pcdna3.1()/xapc7.
2.4 稳定表达株的筛选与鉴定 在6孔板中将pcdna3.1()/xapc7质粒转染入人肝癌细胞系smmc7721, 经4周选择性培养（400 mg/l g418）后, 得到了稳定表达目的基因mrna的阳性细胞株。筛选后的xapc7稳定表达细胞经半定量rtpcr方法分析, 结果显示, 转染了pcdna3.1()/xapc7的smmc7721细胞与对照转染空载体及未转染的smmc7721细胞相比, 三者的βactin表达水平差别不大, 说明rna总量基本一致。在25个循环内, 转染了pcdna3.1()/xapc7的smmc7721细胞扩增后得到一条大小为355 bp的清晰条带, 而对照转染空载体及未转染的smmc7721细胞则条带非常弱, 几乎看不到, 说明重组子已成功转入smmc7721细胞并得到表达(图3)。
图3 各转染组细胞xapc7基因的mrna水平变化（略）
m: dl 2000 dna marker; 1: 空白未转染smmc7721细胞组; 2: 转染pcdna3.1()空载体组; 3: 转染pcdna3.1()/xapc7组.
3 讨论
人类基因xapc7(又称c6、 hspc或rc61)编码人类蛋白酶体α7亚基psma7。其编码成员属于肽酶a t1a家族, 是蛋白酶体20s核心结构的α亚基。1996年huang等[3]以hbx为探针, 采用双酵母杂交法筛选hela细胞的cdna文库, 获得了xapc7的cdna, 并将其命名为xapc7。含248个氨基酸的xapc7与hc8(psma3)有33%的一致性, 并与果蝇的蛋白酶体亚基有高度的同源性。
研究表明xapc7可通过与hbx、 hif1、 cabl及arg等蛋白相互作用, 参与病毒复制、 蛋白酶体及转录因子的活性调控。有作者[4]研究证实, xapc7可与hbx相互作用。hbx与xapc7的相互作用是病毒复制的关键, hbx可能通过与xapc7相互作用干扰蛋白酶体复合物的活性, 从而导致hbv病毒的持续感染状态。另有研究报道xapc7与丙肝病毒内部核蛋白体进入位点的活化调节(ires)有关[5], 并在控制丙肝病毒翻译和下游的复制中发挥重要作用。同时有研究[6]提示hif1α是xapc7的细胞靶标。xapc7通过与hif1α的转录抑制区结合, 将底物hif1α募集至蛋白酶体复合物中, 促进其转录子的非氧依赖性蛋白酶体途径的降解, 从而抑制hif1α的转录。可见xapc7在hif1的活性调节中发挥重要作用。liu等[7]则发现cabl和arg的sh2区域可通过与xapc7结合而使其磷酸化,进而调节蛋白酶体介导的蛋白质的降解活性。表达磷酸化突变的xapc7细胞将出现g1/s过渡和s/g2进展受损, 氧化应激和电离照射可导致cablxapc7复合物和磷酸化xapc7的形成增加。可见, cabl和arg介导的xapc7的磷酸酪氨酸修饰调控着26s和20s蛋白酶体的活性。
尽管xapc7参与多种重要的肿瘤相关蛋白的表达及活性调节（如hbx、 hif1、 cabl及arg）, 但其本身在肿瘤的发生、 侵袭及迁移中究竟起怎样的作用？ 在肿瘤的发生中, xapc7是作为这些重要肿瘤相关蛋白的上游调控因子, 还是仅作为蛋白质降解的“垃圾处理站”而接受其他因子的调控？ shi等[8]采用serex技术在cdna表达文库中筛选到psma7阳性克隆, 进一步的表达谱芯片表明psma7在hcc样本中呈现表达上调, 实时定量rtpcr结果16个配对原发性肝细胞癌标本和癌旁非肿瘤组织标本中有7个在肿瘤组织中高表达（44%）, 初步提示psma7是一个原发性肝细胞癌的肿瘤相关抗原。但psma7在肝癌中究竟充当何种角色目前尚不清楚。为此, 本实验中成功构建了能在人肝癌细胞系smmc7721中表达的人xapc7基因真核表达载体, 为进一步研究xapc7基因对肿瘤细胞生物学功能的影响奠定了实验基础。同时本课题组正在制备抗xapc7 mab, 并构建rna干扰重组质粒, 从细胞增殖、 细胞周期、 细胞凋亡及对肿瘤细胞的侵袭迁移的影响等多方面考察本基因及其编码蛋白的功能。
致谢: 感谢上海复旦大学生命学院遗传所季朝能教授对本课题的协助和支持！
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