【关键词】 瘦素;椎间盘;免疫组织化学
【摘要】 目的 探讨瘦素及其受体在椎间盘组织表达及意义。方法 采用免疫组织化学技术检测正常椎间盘(21个)与退变椎间盘(39个)组织中瘦素及其受体的表达，用免疫细胞化学技术检测体外培养的纤维环细胞中瘦素及其受体的表达。结果 退变椎间盘组织中瘦素及其受体的表达高于正常椎间盘组织，差异有显著性(t=3.223、5.553,p<0.05)。体外培养的纤维环细胞中可以检测到瘦素及其受体表达。结论 椎间盘组织存在瘦素及其受体;瘦素可能在椎间盘退变中发挥作用。
【关键词】 瘦素;椎间盘;免疫组织化学
significance of the expression of leptin and its receptor in intervertebral disc li kepeng, li shuzhong (department of spinal surgery, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china); [abstract] objective to study the expressions and their significance of leptin and leptin receptor in intervertebral disc. methods expressions of leptin and its receptor protein were detected in 21 normal intervertebral discs and 39 degenerative discs, and in human cells of annular fibrosus cultured in vitro, immunohistochemically and immunocytochemically, respectively. resultsthe expressions of leptin and its receptor in degenerative discs were stronger than that of the normal discs (t=3.223,5.553;p<0.05), and that expressions could also be determined in the cells cultured in vitro. conclusion leptin and leptin receptor exist in the intervertebral disc tissue, which might play an important role in the process of the disc degeneration.
[key words] leptin; intervertebral disc; immunohistochemistry
瘦素是肥胖基因编码的肽类激素，体内许多组织中有瘦素及其受体的表达。wWW.133229.CoM瘦素具有很多重要的生理作用，包括调节食欲、控制体质量、调节机体炎性反应和免疫功能及促细胞增殖等[1]。瘦素在肥胖的发生过程中扮演重要的角色。同时，研究证明肥胖也是椎间盘蜕变的重要危险因素。椎间盘退变与骨性关节炎发病过程极为相似，其机制除了传统的生物力学因素外,目前研究较多的生物化学因素可能也起着比较重要的作用。现已证明关节软骨细胞可以表达瘦素及其受体，并且瘦素可以刺激软骨细胞的体外增殖，通过促进骨赘形成参与骨性关节炎的发病过程[2]，而瘦素在椎间盘退变过程中的作用报道很少。本实验旨在探讨瘦素系统在椎间盘中的表达及其在椎间盘退变发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 标本及其来源
腰椎间盘标本60个,l3,4椎间盘6个，l4,5椎间盘31个，l5s1椎间盘23个。均来自于青岛大学医学院附属医院2008年4月—2009年1月因腰椎间盘突出症、腰椎外伤爆裂骨折经手术治疗的病人。所有病人均知情同意。病人中男27例,女24例;年龄21～59岁，平均41岁。所有病人术前均未行过硬膜外封闭、化学溶核及经皮穿刺髓核切吸术。所取标本包括纤维环和髓核。正常组21个，纳入标准为：①术前mri显示所取的椎间盘组织t2加权像上pfirrmann分级ⅰ～ⅲ级;②术前无神经根刺激症状。退变组39个，纳入标准为：①术前mri显示所取的椎间盘组织t2加权像pfirrmann 分级ⅳ～ⅴ级;②术前存在明显神经根刺激症状。各标本取出后置于40 g/l甲醛溶液中固定,carnoy 液4 ℃过夜,不同梯度的乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。4～5 μm厚连续切片,以备苏木精伊红染色和免疫组化检测用。
1.2 方法
1.2.1 切片光镜观察 用苏木精伊红常规染色。
1.2.2 免疫组织化学染色 瘦素兔抗人多克隆抗体和瘦素受体羊抗人多克隆抗体购自santa cruze公司;immunostain sp kit试剂盒和dab显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。载玻片均经多聚赖氨酸浸泡24 h防脱片处理,60 ℃烤箱烘烤干燥。切片常规进行脱蜡、阻断内源性过氧化酶的活性、抗原修复和封闭，采用sp法进行免疫组织化学染色，dab显色。实验中采用pbs代替一抗作为阴性对照，以脂肪组织的染色结果作为阳性对照。结果判定：瘦索及其受体表达阳性物质位于细胞内，阳性结果为棕黄色。每张切片随机选取纤维环区域10个高倍镜视野，计数每个视野的阳性细胞数，再将10个高倍镜视野细胞数相加，得出每个样本阳性纤维环细胞数。
1.2.3 纤维环细胞培养 椎间盘标本取自25岁男性腰椎间盘突出症病人，在离体30 min内取回实验室。仔细分离出纤维环组织， 把纤维环组织剪成1 mm大小的碎块，用胰蛋白酶及胶原酶消化后，细胞用hamf12培养液冲洗3次，低速离心5 min，计数板进行细胞计数。将细胞接种于培养瓶内，置于培养箱中进行培养。细胞爬片行苏木精伊红染色，见细胞为梭形或多角形，胞核卵圆形，胞浆淡染。然后进行瘦素检测：40 g/l多聚甲醛固定10 min;pbs冲洗3次，每次3～5 min;2 g/l tritonx100透化，室温5 min;pbs冲洗3次，每次3～5 min;封闭液阻断，室温60 min;pbs冲洗3次，每次3～5 min;滴加兔抗人瘦素一抗，37 ℃ 1 h;pbs冲洗3次，每次3～5 min;滴加山羊抗兔igg抗体，37 ℃ 30 min;pbs冲洗3次，每次3～5 min;滴加hrp，37 ℃ 30 min;pbs冲洗3次，每次3～5 min;dab显色15 min，封片，观察。同法检测瘦素受体。
1.3 统计学处理
所测数据采用±s表示, 以微软公司excel 2000 student test作样本均数t检验,p<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 苏木精伊红染色
退变组椎间盘组织表现为胶原纤维增多，排列紊乱，血管组织浸润，纤维环板层状结构破坏，肉芽组织形成。正常组均表现为纤维环板层状结构明显，软骨细胞多见，且较均匀，基质较少。
2.2 瘦素及其受体在椎间盘组织表达
正常椎间盘组织，瘦素在纤维环中表达较均匀，从纤维环外层向内层表达逐渐减弱，而在髓核的软骨样细胞中无表达;退变椎间盘纤维环细胞中瘦素表达增强，且不均匀，以细胞簇及纤维软骨细胞增生的区域明显，髓核细胞无表达。瘦素受体的表达情况与瘦素相似。退变组与正常组比较差异有显著意义(t=3.223、5.553，p<0.05)，见表1。 表1 两组瘦素及其受体的表达情况
2.3 瘦素及其受体在体外纤维环细胞中的表达
体外培养的纤维环细胞中可以检测到瘦素及其受体的表达，位于细胞浆内。
3 讨 论
人群中椎间盘退变现象相当普遍。退变椎间盘的组织学特点包括髓核脱水，糖蛋白降解，纤维环的板层状结构破坏等。椎间盘蜕变的危险因素包括吸烟、饮酒、遗传因素、过劳、糖尿病、高血压等，这些因素导致了椎间盘细胞代谢水平的改变，干扰椎间盘细胞增殖与凋亡的平衡[3]。使得椎间盘中一些炎性递质过表达，影响椎间盘的修复能力。最终导致椎间盘蜕变。
近来肥胖与椎间盘退变的关系备受关注，大量研究证明肥胖在椎间盘退变过程中发挥作用。但肥胖促进椎间盘退变的确切机制尚不清楚，纯机械应力因素难以解释肥胖与椎间盘蜕变之间的关联。瘦素作为一种脂肪因子于1994年发现，继而瘦素的作用被广泛研究。瘦素通过与中枢神经系统及周围器官的瘦素受体直接结合来调节体内的能量平衡、脂肪代谢及某些内分泌功能，并可能参与了骨与软骨的发育过程[4]。瘦素受体是一单跨膜的细胞表面受体，它至少由5种异构形式，其中只有长型受体obrb具备完整的胞内区而具有信号转导功能，它属于ⅰ级细胞因子受体家族，可以激活酪氨酸蛋白激酶家族的信号转导子和转录激活子，故称为功能性受体。瘦素受体在大脑脉络丛、下丘脑、肝脏、胰脏、肺脏、肾脏、关节软骨等多个部位均有表达[5]，此与瘦素具有广泛的生物学效应有关。最近研究发现，瘦素是一种有丝分裂促进剂。它能够显著促进t淋巴细胞、角朊细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、软骨细胞等多种细胞的生长增殖。瘦素还具有抗t细胞、单核细胞、成神经瘤细胞、海马神经元细胞凋亡作用[6]。同时，瘦素作为一种细胞因子样激素在免疫系统中所发挥的作用越来越受到关注。它可为血细胞和淋巴细胞的生成提供增殖信号，活化单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞，调节t、b细胞介导的适应性免疫应答，促进细胞因子的合成，刺激炎性反应，而且作为一种新型的免疫调节因子，瘦素在多种自身免疫病中也发挥重要作用。
目前认为椎间盘退变的关键因素为椎间盘在纤维环反复损伤后引起损伤修复的炎症反应，导致巨噬细胞和肥大细胞聚集，释放大量的细胞因子，使椎间盘内的细胞增生和分化，血管、神经和纤维沿撕裂的纤维环裂隙长入，最终导致椎间盘退变。组织学上病理椎间盘中存在自纤维环外层到内层的肉芽组织条带区，对应于腰椎间盘造影术显示的裂隙。正常椎间盘仅纤维环表层有血管分布，这些肉芽组织条带区最可能起源于外层纤维环的机械性创伤和随之的创伤修复过程。
瘦素可直接参与创伤组织的修复过程，其与促进创伤修复细胞因子结构上的相似性提供了瘦素可能参与创伤愈合反应的物质基础，瘦素调控血管生成及免疫反应的外周作用也与创伤愈合过程关系密切[7]。 murad等[8]认为，瘦素由于在组织修复时促进了新血管的生成从而参与了伤口组织修复的调控。他们发现不仅肉芽组织中的免疫细胞及修复细胞有瘦素受体的表达，而且皮肤组织受损后伤口中的细胞就积极参与瘦素的合成，说明瘦素是创伤愈合过程的自分泌或旁分泌调节物。 本研究中体外培养的纤维环细胞中同时检测到瘦素及其受体的表达，提示椎间盘细胞生长增殖过程中可能存在自分泌或旁分泌机制。
退变椎间盘细胞比正常椎间盘细胞在体外培养时能产生更多的化学因子，说明椎间盘退变存在炎症反应机制[910]。瘦素作为一种新型的免疫调节因子[11]，很有可能参与椎间盘退变过程。有研究表明，瘦素能活化单核巨噬细胞，促进其产生促炎因子，增强致炎细胞因子、肿瘤坏死因子以及白细胞介素6的致炎作用，并且抑制t细胞向th细胞的转化而表达白细胞介素2，从而发挥其促炎作用，瘦素还可以诱导th细胞分化和活化，促进炎性细胞因子如白细胞介素2、肿瘤坏死因子d和白细胞介素18的合成分泌[12]。本实验结果显示，瘦素系统在退变椎间盘中的表达强度与正常椎间盘相比明显增强，表达分布情况又以参与纤维环损伤修复形成的细胞簇区域为主，因此我们推测瘦素系统很有可能参与了椎间盘蜕变过程。
综上所述，椎间盘组织中有瘦素系统的表达，蜕变椎间盘组织中瘦素表达的程度与模式均与正常椎间盘有明显差异，并且体外培养的细胞同时检测到瘦素及其受体的表达。提示瘦素系统很有可能通过自分泌或旁分泌机制参与了椎间盘蜕变过程。瘦素系统有可能成为椎间盘退变生物学治疗新的靶点。
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