【关键词】 med19;shrna慢病毒;细胞增殖;细胞周期
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【摘要】 目的 研究慢病毒med19shrna包装颗粒感染胃癌sgc7901细胞后对其细胞增殖和细胞周期的影响。方法 应用med19shrnaplvthm慢病毒载体感染胃癌sgc7901细胞，采用rtpcr和western blot的方法检测med19基因的沉默效率，通过mtt和克隆形成实验研究med19基因在sgc7901细胞增殖中的作用，并用流式细胞技术试验检测med19基因沉默后对细胞周期的影响。结果 成功构建的med19shrna慢病毒载体并使med19基因沉默成功，感染sgc7901细胞后细胞增殖能力显著降低、细胞克隆形成能力明显减弱、细胞周期阻滞于s期。结论 med19基因沉默后对胃癌sgc7901细胞增殖和细胞周期均有显著影响。
【关键词】 med19;shrna慢病毒;细胞增殖;细胞周期
study on the function of med19 gene in sgc7901 cells ding xiangfu*, li jun’an,huang guomin*,et al.*department of general surgery,the second hospital of jilin university,changchun 130041,china
【abstract】 objective to observe the changes of cell proliferation and cell cycle of sgc7901 cells after infected by med19shrna packaging lentivirus.methods western blot and realtime pcr were used to detect the silence efficiency of med19 in the infected sgc7901 cells by med19shrnaplvthm lentiviral vector,then mtt assay and colony formation assay were used to detect the effect of med19 on cell proliferation,and fcm technology was applied to test the changes of cell cycle after the gene med19 silence.results the recombinant med19shrna lentiviral expressing vector was successfully constructed and the med19 gene was silenced efficiently. the cell proliferation and colony numbers were decreased by med19 expression after infected by sgc7901 cells, and the cell cycle was arrested in phase s by med19 silence. conclusion the silence of med19 gene can obvious affect the cell proliferation and cell cycle in sgc7901 cells.
【key words】 med19;shrna lentivirus;cell proliferation;cell cycle
rnai技术是近年来发展起的一门新技术，其基本原理是通过人工合成的双链rna介导特异性的相应靶标mrna的降解，阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制，具有特异性、高效性和操作简单的特点，目前，rnai技术已广泛应用于基因功能、基因治疗、药物筛选等的研究中，研究者通过小分子干扰rna来抑制特定细胞中基因的表达得到很多重大发现，并将在疾病发生机制和治疗方法的研究中发挥更重要的作用。wWW.133229.COm中介体(mediator)是真核生物转录起始过程中的基因特异调控蛋白和rna聚合酶ⅱ重要的转录组成部分[1]，酵母的中介体(med)由25个亚单位组成，从结构和功能上可分为4个部分，即头部、中部、尾部和cycc部分，其中前三部分组成核心中介体，cycc部分通过多样的方式与核心中介体结合并调节其功能[2,3]。中介体的结构模式从酵母到多细胞动物中高度保守[4]。研究表明中介体在促进转录的激活、增强基础转录和增强tfⅱh对rna聚合酶ⅱ中的c末端结构域(cterminal domain，ctd)的磷酸化中发挥重要作用。本研究通过慢病毒感染的方法在胃癌sgc7901细胞中rna干扰中介体亚单位med19基因，使med19基因表达沉默，观察sgc7901细胞中med19基因引起的相应变化，从而对med19基因在癌细胞中的功能进行探讨研究。
1 材料与方法
1.1 材料 293t 和胃癌sgc7901细胞株由中科院上海生化细胞所提供;med19 shrna序列由上海吉凯基因技术有限公司合成;慢病毒载体系统相关质粒plvthm、pspax2、pmd2g购自tronolab公司;用于细胞培养的培养液rpmi 1640、dmem和胎牛血清均来自gibco公司; lipofectamine 2000细胞转染试剂购自invotrogen公司;采用takara公司产品;med19基因单克隆抗体购于abcam公司，hrp标记二抗购于daco公司;med19基因来源于吉林大学第二医院;realtime pcr试剂盒、dna分子marker、限制性内切酶、连接酶及其他常规分子生物学试剂购自takara或neb公司。
1.2 方法
1.2.1 med19基因shrna序列的设计：针对酵母med19基因的mrna序列(ncbi编号nm014062)，采用ambion公司的rna干扰引物设计软件，设计4条sirna序列，同时设计一条无义序列为阴性对照，两端分别添加bamhi和ecori酶切位点，将这些序列的正向和反向片段90℃水浴15 min退火成有粘性末端的双链dna，shrna序列由上海生工合成。
1.2.2 med19基因的shrna慢病毒载体的构建：慢病毒质粒plvthm经bamhi和ecori双酶切后琼脂糖凝胶回收，载体片段与上述双链dna在t4 dna ligase作用下进行连接反应4℃过夜，转化大肠杆菌感受态细胞并挑选重组克隆进行菌落pcr鉴定，经dna凝胶电泳检测，对电泳结果显示连接成功的克隆子抽提质粒，并送上海英俊公司测序，此即得到了med19shrnaplvthm慢病毒质粒。
1.2.3 med19 shrna慢病毒颗粒的包装：将293t细胞接种于25 ml细胞培养瓶，37℃、5%co2培养箱中培养24 h，待细胞密度达到80%时，按照lipofectamine 2 000转染方法，将上述构建的med19shrnaplvthm慢病毒质粒与包装辅助质粒pspax2、pmd2g共转染至病毒包装细胞293t，培养12 h后弃去含病毒的培养液，加入5 ml新鲜的培养液继续培养，转染72 h后收集细胞，裂解液裂解细胞30 min，4℃，4 000 g离心10 min收集上清液并用0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃，25 000 kr/min离心90 min弃净上清液，用1 ml冰预冷的pbs液体重悬病毒沉淀，-80℃保存备用，此即得到了med19shrna慢病毒包装颗粒溶液。
1.2.4 shrna慢病毒沉默med19效率的检验：将sgc7901细胞接种入6孔培养板至80%融合度，取20 μl shrna慢病毒液加入各孔中，同时设置相应的空白对照试验(以未转染慢病毒载体的空细胞为空白对照，以转染含无义序列的慢病毒载体为阴性对照)，培养72 h后在荧光显微镜下观察gfp的表达情况。用trizol提取法抽提各组细胞的总rna，并以此rna为模板，通过rtpcr检测慢病毒感染后细胞中med19的mrna表达水平的变化;另一方面用ripa裂解液获得总蛋白，采用western blot方法检验慢病毒感染后med19蛋白表达的变化，分别在rna水平和蛋白质水平筛选有沉默效果的shrna序列，平行试验重复三次，抑制效果最好的shrna 片段用于后续试验。
1.2.5 mtt方法检测细胞增殖情况：实验共分为3组：shrna慢病毒感染组(med19sirna)、无shrna的空病毒感染组和空白对照组，每组平行设3个复孔，取对数生长期细胞sgc7901细胞船代于96孔板中，次日加入顺铂(终浓度10 μg/μl)，37℃、5%co2细胞培养箱中继续培养，按时间梯度每天取样一次，最长的培养5 d，在取样前4 h分别向细胞中加5 mg/ml mtt溶液20 μl，实验时间结束后吸弃培养液每孔加入150 μl dmso溶液终止反应，振荡10 min使formazan结晶充分溶解，酶标仪检测od 570 nm值。
1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期：实验同样分为上述3组，sgc7 901细胞接种于6孔板中，待感染72 h后收集sgc7901细胞，4℃，1 200 r/min离心5 min弃去上清液，4℃预冷的pbs溶液洗涤细胞沉淀2次，4℃预冷的70%乙醇固定细胞，1 500 r/min 离心5 min去固定液，200 μl pbs溶液重悬细胞沉淀，400目的筛网过滤1次，离心1 200 r/min 离心5 min弃去pbs溶液，加入1 ml pi荧光染料染色，4℃避光反应30 min，上机进行流式检测，通过与对照试验的变化，观察med19基因沉默后引起的细胞周期变化。
1.2.7 细胞克隆形成实验：实验分组同1.2.4，将被med19shrna慢病毒感染过的sgc7901细胞在37℃、5%co2培养箱中培养过夜，吸去含有病毒的培养基，覆盖含0.6%琼脂的dmem固体培养基，之后每隔1 d更换新鲜培养基至培养2～3周，实验终止时先用pbs溶液洗涤细胞2次，多聚甲醛固定细胞，pbs溶液洗涤细胞沉淀2次，用gimsa染液对细胞染色10 min，去离子水清洗细胞上残留的giemsa染色液，注意观察细胞形态变化并计算克隆形成数目和拍照。
1.3 统计学分析 应用spss 12.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 shrna慢病毒表达载体感染sgc7901细胞 测序结果显示med19shrna片段已正确克隆入载体中。在med19shrnaplvthm包装病毒颗粒感染胃癌sgc7901细胞图中(图1)，通过计算在白光下细胞总数与荧光显微镜下观察到的绿色荧光蛋白的比值，得到gfp的阳性表达率，可知med19shrna慢病毒对胃癌sgc7901细胞感染率达到80%以上，表明med19shrna慢病毒感染sgc7901细胞后成功沉默了med19基因。
图1 shrna慢病毒感染胃癌sgc7901细胞(左边为白光，右边为绿色荧光)2.2 med19shrna慢病毒干扰效果检验 将4条med19shrna序列包装的慢病毒颗粒及对照组分别感染sgc7901细胞后，rtpcr检测结果表明med19shrna慢病毒感染组的med19基因的 mrna表达量比无义序列的慢病毒感染组明显下降(表1);而在western blot实验结果中同样证实shrna组med19蛋白的表达量比对照组均有所减少(图中western blot检测所用的抗体是med19基因特异性抗体，下方的βactin为定量对照)，表明med19shrna慢病毒感染sgc7901细胞后能有效抑制med19蛋白的表达(图2)。
2.3 shrnamed19抑制了胃癌sgc7901细胞增殖 在mtt试验方法中，od 570 nm处的吸光值可间接反应出细胞增殖的情况，即od 570 nm值越大，细胞活力越强。mtt检测结果(图3)显示，med19shrna慢病毒组细胞的od 570 nm值明显低于其他2组，表明med19基因沉默后sgc7901细胞增殖明显受到抑制，细胞活力下降，而阴性对照组和空白对照组od 570 nm值基本一致，差异不大，表明慢病毒本身对sgc7901细胞增殖能力无影响，从而也进一步证实是由于med19shrna慢病毒感染sgc7901细胞后导致的med19基因沉默作用引起了细胞增殖变缓。表1 realtime pcr验证不同sirna靶点对于med19基因的沉默效率注：与阴性对照组比较，*p<0.05
2.4 med19基因干扰后阻滞sgc7901细胞周期于s期 为了研究med19基因对细胞周期的影响，我们用流式细胞仪观察med19基因rnai组和非rnai对照组分别转染细胞后的细胞周期变化。从细胞周期图(图4)中可以看出，相对非rnai组，med19基因rnai后对细胞周期的影响较大，被明显阻滞在s期，而对照组变化不大。
2.5 med19基因沉默降低了sgc7901细胞克隆形成能力 从3组试验的细胞克隆形成图片(图5)中可以看出，阴性对照组和空白对照组细胞数目较多且2组相差不大，而med19shrna慢病毒组的克隆细胞数比其他两组显著减少。同时，克隆计数结果表明，med19沉默组(14.7±1.2)比阴性对照组(54.0±14.1)和空白对照组(50.3±13.6)克隆数显著降低，表明med19shrna慢病毒感染sgc7901细胞后细胞的增殖能力明显受到抑制，这是与med19基因沉默特异相关的。
3 讨论
rna聚合酶ⅱ是三大rna聚合酶之一，存在于基因转录装置的核心位置，编码蛋白质基因的转录受到rna聚合酶的调控，这是一个基本的细胞过程。转录起始的精确性于核心启动子元件(如tata box)，而某些基因和组织特异的dna结合转录激活与中介体密切相关。med19(rox3)是中介体的一个亚单位，在转录激活和抑制中发挥重要作用，最初是在研究cyc7基因突变体中发现的[5]。med19基因刚开始发现时被认为是必需基因编码的蛋白产物，后来逐渐发现了缺失med19基因的酵母菌株。brown等[6，7]发现med19基因突变会阻碍gal4和gcn4诱导的基因活化作用，有研究还证实med19基因突变能导致热休克、葡萄糖抑制效应和ho基因的阻遏作用消失[8-10]，基因表达芯片研究显示med19基因剔除或缺失引起一系列基因的表达量上升或下降[11]。baidoobcmso等[12]研究发现med19在中介体复合物各部分内在相互作用中起着重要的调控作用，ding等[13]研究小组发现med19/med26在中介体复合物促进re1沉默转录因子诱导的神经基因表观沉默过程中发挥重要作用。中介体med19在基因转录过程中发挥着重要作用，与细胞的生长和周期调控关系紧密，因此本文对med19基因在胃癌sgc7901细胞中的相关功能进行了研究。
med19在人类中的同源基因为肺癌转移相关基因lcmr1，是2003年克隆到的一个新基因，目前对lcmr1的功能研究较少，从med19与lcmr1同源我们可以推知对med19的研究也将有助于揭示lcmr1基因的功能。
胃癌是目前常见的恶性肿瘤之一，与肝癌一样，我国也是胃癌的高发地区，癌症发生与癌基因的非正常活化和抑癌基因的非正常失活有关，如果能通过rna干扰的方法找到沉默癌基因表达的小片段序列，就有可能是抑制胃癌的新作用靶点。本文主要通过慢病毒感染的方法对med19基因进行rna干扰，获得了有效的med19shrna包装病毒，感染sgc7901细胞后其 mrna和蛋白表达水平抑制率分别为80%及81.8%，表明应用rnai可成功沉默med19基因。同时我们还发现med19基因的沉默能显著抑制胃癌sgc7901细胞的增殖和克隆形成能力，也能显著影响细胞周期，可将细胞阻滞在s期。本研究揭示了med19基因沉默后能明显影响胃癌sgc7901细胞的增殖和细胞周期变化，这些为后续继续研究med19基因在癌症中的作用机制和临床研究打下了基础。
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