【关键词】 2型糖尿病;大鼠;强化胰岛素治疗;胰岛;凋亡
【摘要】 目的 观察强化胰岛素治疗对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的影响。方法 将36只wistar大鼠随机分为正常对照组和高脂组，正常对照组给予基础饲料喂养，高脂组给予脂肪乳灌胃+基础饲料喂养10 d，然后给高脂组大鼠腹腔注射链脲佐菌素，3 d后再将高脂组大鼠随机分为2个亚组，即糖尿病对照组和糖尿病胰岛素治疗组，治疗4 w。脂肪乳灌胃第10天、注射stz第3天和治疗4 w末测大鼠各项指标;实验结束时采用tunel技术和流式细胞术检测胰岛β细胞的凋亡。结果 大鼠在强化胰岛素治疗4 w末，分别采用tunel和流式细胞术检测凋亡，与糖尿病对照组比较，糖尿病胰岛素治疗组胰岛β细胞凋亡率明显下降，分别为(0.73±0.02)% vs (0.19±0.04)%和(13.50±0.12)% vs (3.56±0.71)%，差异均有统计学意义(p<0.05)。结论 强化胰岛素治疗可减轻2型糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡。
【关键词】 2型糖尿病;大鼠;强化胰岛素治疗;胰岛;凋亡
胰岛β细胞功能缺陷作为2型糖尿病(t2dm)发病的重要环节之一，近年来受到越来越多的重视，有观点认为细胞凋亡导致胰岛β细胞功能受损，比胰岛素抵抗(ir)在t2dm的发病过程中起着更为重要的作用〔1，2〕。wWw.133229.cOm本研究旨在观察强化胰岛素治疗对t2dm大鼠胰岛β细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 动物模型的建立和分组
清洁级远交群雄性wistar大鼠36只，体重180～220 g，由河北医科大学实验动物中心提供。适应性喂养1 w后，随机分为正常对照组(nc组，n=12)和高脂组(hf组，n=24)，正常对照组给予基础饲料喂养(能量比：碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白质24.2%);高脂组给予脂肪乳灌胃(能量比：碳水化合物43%，脂肪41%，蛋白质16%)+基础饲料喂养10 d。在ir形成后，给高脂组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(stz)，注射剂量30 mg/kg，注射3 d时若空腹血糖(fpg)>7.8 mmol/l及胰岛素敏感指数(isi)降低，提示t2dm大鼠造模成功〔3〕。将造模成功大鼠再随机分为2个亚组，即dm对照组(dc，n=12)，腹部皮下注射生理盐水;胰岛素治疗组(di，n=12 )，每日17～18时在腹部皮下注射诺和灵n 2～3 u/d。根据上午8时血糖结果，每3 d调整胰岛素用量，使血糖维持在nc组的水平，治疗共4 w。
1.2 试剂与方法
1.2.1 指标测定
分别在脂肪乳灌胃第10天、注射stz第3天和治疗4 w末测定大鼠体重(bw)、fpg、空腹血清胰岛素(fins)、c肽(cp)，在1%戊巴比妥钠麻醉下(30 mg/kg)，从心脏取血获得标本。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，fins、cp采用放免法测定，游离脂肪酸(ffa)采用试剂盒测定。
1.2.2 动物处死及组织标本采集
治疗4 w末，给大鼠用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉，仰卧位固定于手术台，打开腹腔，立即分离并取出胰腺，一部分置于10%多聚甲醛中固定，另留取少量标本切成约1×1×1 mm3大小的组织块，置于70%酒精内。
1.2.3 胰岛β细胞凋亡的测定
分别采用dutp缺口标记技术(tunel)和流式细胞术(fcm)检测胰岛β细胞的凋亡。
1.3 统计学分析
用spss12.0统计软件进行处理，数据以x±s表示，测定结果进行正态性及方差齐性检验，偏态分布变量胰岛素取自然对数转为正态分布后进行统计学处理，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 大鼠脂肪乳灌胃第10天的bw、fpg、fin、cp及ffa含量变化
hf组的bw、fins、cp和ffa较nc组升高，差异均有统计学意义(p<0.05，p<0.01);fpg与nc组比较差异无统计学意义(p>0.05)。见表1。
2.2 大鼠注射stz第3天的bw、fpg、fin、cp及ffa含量变化
hf组的bw、fpg和ffa较nc升高，差异均有统计学意义(p<0.05);fin、cp与nc组比较差异无统计学意义(p>0.05)。见表2。
2.3 大鼠治疗4 w末的bw、fpg、fin、cp及ffa含量变化
dc组和di组大鼠各死亡1只。fin、cp在nc组、dc组和di组之间差异均无统计学意义(p>0.05)。与dc组比较，di组的bw升高，fpg、ffa降低，差异均有统计学意义(p<0.01，p<0.05)。与nc组比较，dc组的bw降低，fpg、ffa升高，差异均有统计学意义(p<0.05，p<0.01)。见表3。
2.4 胰岛β细胞凋亡结果
凋亡细胞的核呈棕褐色着染，dc组有大量tunel阳性细胞，散在分布，为(0.73±0.02)%，明显高于nc组 (0.17±0.05)%，差异有统计学意义(p<0.05);与dc 组比较，di组偶见tunel阳性细胞，为(0.19±0.04)%，差异有统计学意义(p<0.05)。见图1。dc组大鼠胰岛β细胞凋亡率升高，为(13.50±0.12)%，明显高于nc组(2.77±0.53)%，差异有统计学意义(p<0.05);与dc 组比较，di组胰岛β细胞凋亡率明显下降至(3.56±0.71)%，差异有统计学意义(p<0.05)。见图2。表1 两组大鼠脂肪乳灌胃第10天的各项指标表2 两组大鼠注射stz第3天的各项指标表3 两组大鼠治疗4 w末的各项指标图1 治疗4 w末tunel技术检测的各组凋亡胰岛β细胞(×400)图2 治疗4 w末fcm检测的各组凋亡胰岛β细胞
3 讨 论
研究证实，无t2dm的肥胖者通过增加胰岛β细胞的数量来适应ir，而肥胖的t2dm患者则有60%的胰岛β细胞数量缺失。无论是肥胖还是非肥胖的 t2dm患者，与其体重指数相当的非t2dm人群相比，胰岛β细胞数量明显减少，胰岛β细胞凋亡发生率也明显高于正常人群，在肥胖和消瘦的t2dm患者中胰岛β细胞的凋亡频率分别增加了3倍和10倍〔4〕。上述结果提示胰岛β细胞凋亡使其数量减少在t2dm患者胰岛β细胞功能衰竭中发挥了重要作用。
细胞凋亡的检测方法有多种：①形态学观察;②流式细胞术;③原位末端标记技术，包括tunel和inst技术;④琼脂糖凝胶电泳;⑤凋亡相关蛋白分析;⑥凋亡酶学分析等。在进行凋亡有关的研究时，需要2～3种以上的方法联合应用〔5〕。tunel技术是1992年由gavrieli等〔6〕首次提出的一种可进行原位检测凋亡细胞的分子生物学免疫组织化学方法，它比琼脂糖凝胶电泳法更加直观、准确和快速〔7〕。fcm是目前用于检测凋亡细胞最灵敏的方法之一，可以达到同时定性定量的要求。
li等研究发现，糖尿病大鼠予以胰岛素治疗后，β细胞的胰岛素分泌功能及β细胞的凋亡明显改善〔8〕。本研究显示在强化胰岛素治疗4 w后，与nc组低胰岛β细胞凋亡率比较，dc组胰岛β细胞凋亡率明显增加;与dc组比较，di组胰岛β细胞凋亡率均明显减少。提示强化胰岛素治疗能有效保护胰岛β细胞凋亡，起到延缓t2dm发生的作用。
在t2dm，高血糖、高脂血症等都是诱导胰岛β细胞凋亡的主要因素。研究表明，血脂紊乱、血清ffa升高，既引起细胞胰岛素分泌功能缺陷，又导致ir的发生和胰岛β细胞凋亡增加。本研究显示大鼠注射stz第3天，与nc组比较，dc组血清ffa出现上升趋势，表明t2dm大鼠出现了高ffa血症;di组血清ffa显著低于dc组，提示强化胰岛素治疗能够改善与胰岛β细胞功能关系密切的高ffa血症，改善t2dm大鼠的血脂紊乱。另有研究表明脂质对β细胞的毒性作用随葡萄糖浓度的增加而增加，降低血糖水平脂毒性也随之减弱〔9，10〕，即高脂对组织的损伤作用不是独立存在，而是与之共存的高糖环境密切相关。有研究证明〔11，12〕ffa对胰岛素基因表达的影响取决于葡萄糖浓度，在低糖浓度时，胰岛素的基因表达正常，而在高糖浓度时却明显下降。
综上所述，强化胰岛素治疗可保护t2dm大鼠胰岛β细胞凋亡，其作用机制与降低脂毒性、糖毒性相关，具体机制仍有待进一步研究。
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