【关键词】 电针;镇痛;关节炎,实验性;生长抑素;β内啡肽
【摘要】 目的 观察鞘内注射抗生长抑素血清(asss)对佐剂性关节炎(aa)大鼠痛阈、电针(ea)镇痛及中枢β内啡肽(βep)水平的影响，探讨其可能的镇痛机制。方法 以aa大鼠为炎症痛模型，以痛阈为指标观察鞘内注射asss对痛阈和ea镇痛的影响;以放免法测定aa大鼠下丘脑、脊髓中βep含量，观察鞘内注射asss及ea镇痛对其影响。结果 鞘内注射asss可显著降低aa大鼠痛阈，并使ea镇痛效应明显降低;ea镇痛可提高下丘脑和脊髓βep含量，鞘内注射asss可使中枢βep水平进一步显著升高。结论 内源性生长抑素在痛觉调制中起重要作用，有显著的镇痛效果并与增强ea镇痛作用密切相关;其镇痛机制可能与中枢βep水平相关。
【关键词】 电针;镇痛;关节炎,实验性;生长抑素;β内啡肽
effects of intrathecal injection of antisomatostatin serum on electric acupuncture analgesia and βendorphins in rats with adjuvantinduced arthritis zhang hao, wang jian, chen xinyong, et al (shandong university of traditional chinese medicine, ji′nan 250014, china); [abstract] objective to observe the effects of intrathecal injection of antisomatostatin serum (asss) on electric acupuncture (ea) analgesia and βep in rats with adjuvantinduced arthritis (aa), and explore potential mechanism of analgesia. methods aa rats were taken as a model of pain caused by inflammation, and pain threshold as the index, the effect of intrathecal injection of asss on pain threshold and ea was observed; the levels of βep in spinal cord and hypothalamus were detected byusing radioimmunoassay. results intrathecal asss remarkably reduced the threshold of pain, lower the analgesic effects of ea. ea increased the βep level in spinal cord and hypothalamus, which further raised the levels of βep in central nervous system. conclusion endogenous somatostatin plays an important role in analgesic modulation with notable effect of pain relief and closely associated with enhancement of ea, the mechanism of analgesia might be related to βep level of central nervous system.
[key words] electroacupuncture; analgesia; arthritis, experimental; somatostatin; betaendorphin
生长抑素(ss)是在体内广泛分布的一种神经肽，文献报道ss有减轻癌痛作用，与痛觉调制关系密切[1]。wwW.133229.coM以往的研究结果显示，鞘内注射外源性ss有镇痛和增强电针(ea)镇痛的作用[2]。为进一步探讨内源性ss对镇痛的作用，本实验以佐剂性关节炎(aa)大鼠为炎症痛模型，观察鞘内注射抗ss血清(asss)对aa大鼠痛阈和ea镇痛的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与分组 健康雄性清洁级wistar大鼠40只，体质量(200±20)g，2～3月龄，购自山东大学实验动物部，许可证号为scxk鲁20090001，动物处理符合国际疼痛研究学会准则。按随机数字表法将大鼠分为4组：aa模型加正常兔血清(nrs)组(aa+nrs组)、aa模型加asss组(aa+asss组)、aa模型加ea镇痛加nrs组(aa+ea+nrs组)、aa模型加ea镇痛加asss组(aa+ea+asss组)，每组10只大鼠。实验过程中筛除不符合实验条件及死亡的大鼠9只。
1.1.2 主要试剂和药品 完全弗氏佐剂(cfa)，sigma公司产品; asss为sigma公司产品，购自北京博奥森生物科技有限公司(catalog number: bs1132)，效价为1∶13 000;β内啡肽(βep)放免试剂盒购自第二军医大学神经生理学教研室;100 g/l水合氯醛溶液购自山东大学齐鲁医院。
1.1.3 主要仪器及来源 针灸针(规格为15 mm×0.30 mm，苏州医疗用品厂有限公司);hans疼痛治疗仪(hans100a型，南京联创济生医疗科技有限公司); bwe410a型热痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所，光源为12v/35w卤素灯，刺激温度为45～60 ℃，可调);jy 1002型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);聚乙烯pe10导管(美国parsippany公司);微量进样器(上海光正医疗仪器有限公司);ddl5冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂生产;sn695b型免疫计数器：上海核所日环光电仪器有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 鞘内埋管与处理 100 g/l水合氯醛溶液腹腔注射(3 ml/kg)麻醉后，暴露大鼠髂前上棘对应l3～l4腰椎间的棘突间隙，刺破黄韧带后将聚乙烯pe10导管缓慢植入蛛网膜下隙，到达腰膨大。有黄色脑脊液流出后封住外口，缝合并将管固定于皮下。筛除术后运动障碍的大鼠。鞘内埋管后3 d造模，造模后第1～7天在相同时间捆绑、电针。第7天处理完毕后测痛阈，鞘内注射血清后测定即刻及15、30、45、60 min痛阈。鞘内注射时先吸取5 μl生理盐水(ns)，再吸取5 μl nrs或asss，将10 μl液体于3 min内注射入鞘内。aa+nrs组：捆绑7 d后鞘内注射5 μl nrs+5 μl ns;aa+asss组：捆绑7 d后鞘内注射5 μl ns+5 μl asss;aa+ea+nrs组：电针7 d后鞘内注射5 μl nrs+5 μl ns;aa+ea+asss组：电针7 d后鞘内注射5 μl ns+5 μl asss。测完痛阈后处死大鼠，迅速分离下丘脑和脊髓组织。分离脊髓腰段时检查鞘内注射位置，筛除定位不准大鼠的实验数据。
1.2.2 模型建立 无菌条件下，在大鼠右后足跖皮下注射cfa 0.1 ml(内含1 g/l灭活结核杆菌)，用指腹轻按注射点片刻松开。造模后大鼠关节活动受限，活动减少并跛行或抬腿不能着地，踝关节红肿，痛阈降低，形成aa大鼠模型。造模前、造模后1 d分别测定大鼠右后足的基础痛阈和造模后1 d痛阈。
1.2.3 针刺方法 取大鼠右侧腰3、5夹脊穴(脊柱正中旁开0.3 cm)，用15 mm×0.30 mm华佗牌针灸针直刺至肌层，觉沉紧后接hans疼痛治疗仪，电针为疏密波(疏波2 hz，密波100 hz)，强度为1 ma，持续30 min。每天1次，连续7 d。
1.2.4 观察指标 ①痛阈：大鼠稳定后，用bwe410a型热痛刺激仪强光照射其右侧足垫部，测定缩爪反射潜伏期(pwl)作为痛阈。每隔3 min测1次，取3次平均值。注射血清前及注射血清后即刻、15 min、30 min、45 min、60 min各测痛阈1次。测试要求环境安静，室温(22±2)℃，均在上午8∶00～12∶00进行。②βep水平：处死大鼠，迅速取下丘脑和腰段脊髓，在ns中煮沸5 min，称质量，置于1 mol/l冰醋酸中匀浆，放置100 min后，再加入1 mol/l的naoh，低温离心，上清置于-80 ℃冰箱保存待测。βep检测采用放射免疫法，在山东省中医院核放射科检测。
1.2.5 统计学处理 所有数据以±s表示，采用spss 17.0 for windows软件进行一般线性模型的重复测量资料的方差分析及调用多元方差分析、单因素方差分析等。
2 结 果
2.1 各组大鼠基础痛阈和造模后1 d痛阈比较
各组大鼠造模后1 d痛阈均显著高于基础痛阈(t=29.17～122.51,p<0.01)，说明造模成功。基础痛阈和造模后1 d痛阈各组之间比较差异无显著性(p>0.05)。见表1。 表1 各组大鼠基础痛阈和造模后1 d痛阈(t/s，±s)组别 n基础痛阈造模后1 d痛阈
2.2 鞘内注射asss对aa大鼠痛阈及ea镇痛的影响
aa+asss组鞘内注射asss 15 min后痛阈开始降低，aa+nrs组痛阈则无明显变化，aa+asss组注射后15、30、45、60 min与aa+nrs组相比，差异均有显著性(f=2.88～14.04，p<0.05、0.01)。aa+ea+nrs组大鼠痛阈稳定且高于aa+nrs组，注射后30、45 min时两组相比较差异有显著意义(f=4.35、14.04，p<0.05)。aa+ea+asss组注射asss后痛阈降低，注射后30、45 min与aa+ea+nrs组比较差异有显著性(f=4.35、14.04，p<0.05);aa+ea+asss组大鼠与aa+asss组比较，注射前及注射后即刻、30 min两组痛阈差异有显著性，aa+ea+asss组痛阈明显高于aa+asss组(f=2.88～4.35，p<0.05)。见表2。
2.3 鞘内注射asss对aa大鼠中枢βep水平的影响
aa+asss组与aa+nrs组相比较，下丘脑和脊髓βep水平显著升高(f=9.93、49.55，p<0.01)。aa+ea+nrs组大鼠下丘脑和脊髓βep含量显著高于aa+nrs组，aa+ea+asss组下丘脑和脊髓βep含量也明显高于aa+asss组(f=9.93、49.55，p<0.01)。见表3。表2 鞘内注射asss对aa大鼠痛阈的影响表3 鞘内注射asss及ea对aa大鼠中枢βep水平的影响
3 讨 论
ss的镇痛作用在临床和实验研究中均有报道。放射免疫测定和免疫组织化学检测显示，ss在脑和脊髓参与ea镇痛的部位非常广泛[3]。以往的研究表明，鞘内注射外源性ss可显著提高痛阈和ea镇痛作用。本实验观察到，鞘内注射asss中和其中的ss后，大鼠的痛阈明显降低，这表明当内源性的ss被免疫中和时，痛阈明显下降，提示内源性的ss在痛觉调制中起重要作用。齐鲁医学杂志2010年10月第25卷第5期 med j qilu, october 2010, vol.25, no.5
针刺镇痛是一种理想的镇痛方法，在临床广泛使用[4]。针刺时使用电针仪可加强镇痛效果，我们称为ea镇痛，其作用已被国际学术界公认。ea镇痛效应的电针参数涉及单次电针时间、频度等。研究结果表明,每天1次的ea频度和低强度的刺激是适宜的,其镇痛效应较佳，而不同频率ea镇痛可选择性地影响相关的神经递质的释放[56]。在本实验中，我们选用2100 hz的ea频率，电流强度1 ma，每次30 min的单次ea时间，每天1次、连续7 d的ea频度。结果表明，这种ea镇痛参数能很好地兼顾ea镇痛的即时效应、后效应及累加效应，同时能最大程度地激活中枢内与痛觉调制相关的各个部位并促进与实验相关的多数神经肽的释放，利于本研究的顺利完成。
本实验观察到，ea夹脊穴可显著提高大鼠痛阈，具有明显的镇痛作用，鞘内注射nrs并ea镇痛组和非ea镇痛组相比差异有显著性。当鞘内注射asss中和其中的ss后，ea镇痛的效果明显减弱，可见内源性的ss在ea镇痛作用中发挥重要作用。本文实验结果还表明，ea镇痛可使大鼠下丘脑和脊髓组织βep水平显著提高，当鞘内注射asss中和其中的ss后，可进一步升高其水平，说明内源性ss镇痛及ea镇痛的机制可能与中枢βep释放密切相关。
我们以往的研究证实，鞘内注射ss的镇痛作用可被纳络酮阻断，提示鞘内注射外源性ss可能通过激活阿片系统而实现。经典阿片肽家族包括脑啡肽、强啡肽和内啡肽，各种阿片肽都有镇痛作用。然而，纳洛酮并非某一种阿片肽的专一受体阻断剂，且纳络酮具有一定药理作用，如影响细胞膜ca2+流动、环磷腺苷酸代谢和潜在的抗γ氨基丁酸活力等，因此使用专一性更强的拮抗剂即抗血清，进一步研究内源性ss在镇痛和ea镇痛中与各种阿片肽之间的关系是十分有必要的。
【参考文献】
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