【关键词】 关节病变;老年性淀粉样变;淀粉样变;刚果红
【摘要】 目的 调查老年性关节损害中是否存有淀粉样变以及淀粉样变的类型。方法 刚果红染色结合偏振光观察淀粉样变;免疫组织化学观察淀粉样变前蛋白类型;malditof/ms结合dna测序分析ttr蛋白基因是否发生突变。结果 关节组织内发现刚果红染色阳性以及偏振光观察发出绿色荧光，确定淀粉样变沉积。免疫组织化学染色证实淀粉样变前蛋白为ttr蛋白。ttr基因和蛋白两方面同时检测结果，提示未发生基因突变。结论 老年性关节损害患者关节组织内存有淀粉样变，淀粉样变前蛋白类型为ttr蛋白。
【关键词】 关节病变;老年性淀粉样变;淀粉样变;刚果红
【abstract】 objective to investigate amyloidosis in agerelated joint damage tissue and subtype of amyloid precursor proteins (app). methods congo red staining and polarized light microscope were used to find amyloid in joint section from elderly patients who need for joint replacement surgery. immunohistochemistry was to determine classification of app. combined with matrix assisted laser desorption ionisation timeofflight mass spectrometry(malditof/ms)analysis for serum transthyretin (ttr) and sequencing polymerase chain reaction(pcr), ttr gene mutation was analyzed. results congo red was found to be positive in joint tissue and green birefringence was observed under polarized microscope, indicating amyloidosis. with immunohistochemical staining, the amyloid protein was determined to be ttr which is wild type, as shown by both malditof/ms analysis for protein molecular weight and pcr analysis for gene sequencing. conclusions amyloidosis is happened in joint tissues from patients with agerelated joint damage and app is wild type ttr.
【key words】 arthropathy; senile amyloidosis; amyloid; congo red
关于转甲状腺素蛋白(transthyretin, ttr)相关淀粉样变的形成机制，多数学者认为作为聚合体存在的ttr复合体中，ttr单体分子发生立体结构的变化，结构发生变化的ttr单体聚合形成淀粉样变纤维。wwW.lw881.com由于ttr蛋白在酸性条件下能够形成淀粉样变纤维，但生理条件下难于形成淀粉样变纤维的聚合体〔1〕。因此，对于人机体内ttr淀粉样变的形成机制，难于利用实验进行证明ttr蛋白纤维的形成机制。对比家族性淀粉样多发性神经性损害(familial amyloidotic polyneuropathy，fap)与老年性淀粉样变(senile systemic amyloidosis, saa)患者研究结果，发现fap存在以下特点:(1)生活在不同国家地区携带有相同基因突变的患者的发病率不同〔2〕。(2)携带有基因突变的一卵双胎儿，因肌体代谢关系只有一胎发病〔3〕。(3)日本fap attr val30met患者的发病率和发病年龄比瑞典明显增高〔4〕。另外，携带人定点突变ttr基因的基因突变模型鼠，只有在12个月龄以后才能在消化道、心脏等组织出现淀粉样蛋白纤维沉积〔5〕。说明除ttr基因突变之外其他因子在淀粉样变纤维的形成过程中有重要的作用。本研究分析老年关节损害是否发生淀粉样沉积以及淀粉样变前蛋白(app)类型，探讨ttr相关淀粉样变形成机制。
1 资料与方法
1.1 对象
根据患者病史排除肾衰竭透析并发关节损害患者，收集无免疫等因素诱发关节损害终末期需要关节置换手术患者为研究对象，取关节手术关节组织，立即保存于-78℃保存试验备用。同时收集患者血清，60 min内分离血清用于分析转甲状腺素蛋白的突变。
1.2 质量分析
装置(matrix assisted laser desorption ionisation timeofflight mass spectrometry，malditof/ms)法测定ttr的突变类型 收集的患者血清100 μl中加入25 μl抗人血清ttr抗体(assaypro, winfiled,mo，usa)，4℃孵育24 h后9 000 r/min离心5 min得到沉降物，分别用生理盐水和重蒸馏水各洗涤2次，最后使ttr与相应抗体分离，提取所需ttr蛋白部分利用质量分析装置进行检测〔4〕。
1.3 pcr扩增结合测序分析ttr基因突变
设计ttr基因4对引物，pcr扩增ttr基因外显子。引物1: 5′cagattggcagggataagc3′;5′ gcaaagctggaaggagtcac3′;引物2: 5′cgttcctgataatgggatca3′;5′caaaaagagggcatccttca3′; 引物3: 5′tctgacttagttgaggggaaatg3′;5′agggaacctttggtcattca3′;引物4: 5′gccagcatatttgagcttttt3′;5′atgaaaagtgcctttcacagga3′。利用pcr扩增仪(mj ptc200)进行扩增，扩增产物利用amersham bioscience megabace 1000测序仪进行dna测序，分析ttr基因是否发生突变。
1.4 关节组织刚果红染色(congo red, cr)
利用甲醛固定关节置换术患者关节组织制备标准病理切片，系统脱蜡后经0.1%高锰酸钾溶液处理1 min，再用2%硼酸处理1 min。然后用苯酚刚果红试剂染色1 h，最后用0.1%氨水20乙醇溶液处理1 min。同时偏振光显微镜观察淀粉样变沉积。
1.5 淀粉样变沉积关节组织免疫组织化学染色
利用淀粉样变沉积阳性组织制备标准石蜡切片，然后与0.5%过碘酸钠pbs ph7.4缓冲液作用8 min，流水洗涤5 min。分别利用抗人血清ttr抗体、saa抗体、免疫球蛋白轻链(alλ)抗体、β2微球蛋白(β2m)抗体37℃条件下反应1 h，pbs洗涤3次。dabtrishcl ph 7.6缓冲液，h2o2混合液(dako, glostrup, denmark)作用3 min，显微镜观察免疫反应〔5〕。
2 结 果
2.1 淀粉样变患者心脏组织免疫组织化学染色
关节置换术患者关节组织cr染色组织可鲜艳红色染色，偏振光纤维镜观察在cr阳性部位可见绿色荧光。说明患者关节组织内有淀粉样变沉积。见图1。
2.2 免疫组织化学染色
上述淀粉样变沉积阳性组织经过ttr、alλ、alλ、saa、β2m等5种抗体免疫组织化学染色，患者关节组织内可见cr阳性和偏正光绿色荧光，同时与cr阳性部位一致发现ttr免疫反应阳性，提示淀粉样变沉积原因蛋白为ttr。见图2。
2.3 血清中ttr蛋白的突变型
收集60例关节置换术作为被研究对象，所有血清经过malditof/ms法检测均发现2个主要蛋白峰，相对度基本相似，经过与标准蛋marker核算，ttr蛋白为野生型ttr。见图3。
2.4 分析ttr基因突变
pcr测序结果显示ttr基因的4个外显子均未见有发生突变，为野生型，见图4。图1 患者关节组织病理切片he和刚果红染色图2 关节组织免疫组织化学染色图3 检测血清ttr蛋白变异图4 ttr基因扩增测序鉴定基因突变
3 讨 论
ttr是ssa和fap的淀粉样变沉积前蛋白〔6〕。在fap淀粉样变中，ttr基因发生突变，逐步聚合形成淀粉样变纤维，沉积于末梢神经、肠道、心脏、脑等组织器官的细胞间质，引起以末梢神经、自主神经感觉障碍为主的临床综合征。saa患者沉积淀粉样变为基因未发生突变型ttr蛋白。ttr是由127个氨基酸组成的小分子量蛋白。血清中ttr蛋白在生理条件下，四分子ttr单体与一分子甲状腺素单体形成聚合体，参与甲状腺素的运输〔6〕。已经证明基因未发生突变性ttr蛋白能够引起淀粉样变沉积，并且报道ttr相关淀粉样变沉积发生率随着年龄的增加呈现上升趋势〔7〕。本文首先确定淀粉样变沉积，进一步确定淀粉样变沉积前蛋白类型和分析ttr基因是否发生突变，发现关节损害中组织中存有ttr相关淀粉样变沉积。
所有关节组织经过h&e染色符合骨性关节病病理组织学特点，并可见无形紫红色染色物质，刚果红染色呈现红色，结合偏振光纤维镜观察发现为绿色荧光，可以确定为淀粉样变沉积。进一步利用免疫组织化学染色确定淀粉样变沉积前蛋白类型。已经报道有27种app能够形成淀粉样变纤维〔8〕，其中有些为局限性淀粉样变，因此本研究选择5种抗体作为鉴别前蛋白类型。结果发现ttr抗体能够与淀粉样变沉积发生免疫反应，提示为ttr淀粉样变。其他4种抗体未见有发生免疫反应，提示关节内淀粉样变为ttr相关淀粉样变。
众所周知，ttr蛋白能够引起fap和saa淀粉样变沉积，两者区别的本质是ttr蛋白是否发生突变。因此，在确定淀粉样变的基础之上需要鉴别ttr突变的发生。本组先前报道利用malditof/ms检测血清ttr蛋白的突变〔4〕，最近其他研究者也有报道，支持利用本方法用于检测ttr突变，方法简便和实用性强〔9〕。本实验检测研究对象血清发现ttr蛋白为双蛋白峰，提示ttr蛋白未见有发生突变。进一步利用基因扩增和结合dna测序分析ttr基因突变，4个外显子均未见有发生突变。
为了确定淀粉样变蛋白类型，在系统app中只有ttr抗体免疫反应阳性，提示淀粉样变为ttr淀粉样变沉积。刚果红具有与淀粉样变纤维具有亲和性，偏振光纤维能够确定淀粉样变沉积，免疫组织化学染色是公认的能够确定app类型的方法。本次利用血清蛋白和血液细胞dna扩增结合dna测序两种方法，同时从ttr基因和蛋白水平分析ttr是否发生突变，本实验的结果显示，所有研究对象均为野生型ttr基因。报道骨性关节损害患者关节组织内存有淀粉样变沉积，沉积app类型为ttr蛋白。
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