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不同肿瘤细胞表面MICA的表达及NK细胞杀伤活性的

2015-07-10 08:43 来源:学术参考网 作者:未知

【摘要】 目的:观察不同肿瘤细胞表面mica的表达及其对nk细胞杀伤活性的影响。方法:以体外培养的k562(人慢性髓原白血病细胞株)、mcf7(乳腺癌细胞株)、hr8348(直肠腺癌细胞株)、cne2(人鼻咽癌细胞株)、hela(人宫颈癌细胞株)为靶细胞,流式细胞仪检测细胞表面mica的表达,以k562细胞作为对照,应用ldh释放法检测不同效靶比情况下体外培养的nk细胞对靶细胞的杀伤活性。结果:k562、mcf7、hr8348、cne2、hela细胞表面均表达mica,体外杀伤试验表明nk细胞对上述肿瘤细胞均有杀伤活性,antimica单抗可部分封闭nk细胞对靶细胞的杀伤活性。结论:nk细胞对k562、mcf7、hr8348、cne2、hela细胞具有较高的杀伤活性,可作为一种生物治疗手段。

【关键词】 自然杀伤细胞 mica 自然杀伤细胞受体 细胞毒性试验

  analysis of the expression of mica on tumor cell lines of different histotypes and their sensitivity to nk cytotoxicity

  mei jiazhuan,guo kunyuan,wei hongmei,chang hong.

  department of hematology, zhujiang hospital,the southern medical university, guangzhou 510282, china

  [abstract] objective:to investigate the expression of mhc class ⅰ chainrelated gene a(mica) on different human tumor cells(k562,mcf7,hr8348,cne2,hela) and their sensitivity to nk cytotoxicity.methods:cytotoxicity of nk cells(isolated from 3 healthy persons) were detected by ldh releasing assay at different effecttotarget cell ratios(e∶t). the expression of mica was measured by facs.results:different level of mica was detected on surface of tumor cell lines, antimicamab could partially inhibit the cytotoxicity of nk cells.conclusion:nkg2dmica interaction can trigger the cytotoxicity of nk cells against tumor,nk cells can be a kind of effector cell for the treatment of some certain tumors.

  [key words] natural killer cell;cytotoxicity;mica;nk cell receptor

  nk细胞对靶细胞的识别无mhc限制性,可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞,是机体抗肿瘤免疫的第一道天然防线。WwW.133229.CoMmica是nk细胞表面重要活化受体nkg2d的配体,主要表达于应激条件下的肠粘膜上皮细胞及上皮源性的肿瘤细胞,如肺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌和结肠癌等,它通过与nkg2d结合可以直接活化nk细胞,提高nk细胞对靶细胞的杀伤活性。本文主要探讨不同肿瘤细胞表面mica的表达及其对nk细胞的杀伤活性影响。

  1 材料与方法

  1.1 材料 分离nk细胞用的缓冲液(磷酸盐缓冲液,ph 7.2,加入0.5%bsa,2 mmol/l edta,miltenyi biotec公司产品),抗cd56免疫磁珠(miltenyi biotec公司产品),鼠抗人mica单抗(amo1,igg1)由德国alexander.steinle教授惠赠,fitc标记的山羊抗小鼠igg(ebioscience公司产品),rpmi1640(gibco公司产品),淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂,rhil2为上海华新公司产品,杀伤活性检测试剂盒(cytotox96 nonradioactive cytotoxocity assay)购自promega公司,人鼻咽癌细胞株cne2购自军科院李春海教授,乳腺癌细胞株mcf7由我院苏国强博士惠赠,人慢性髓原白血病细胞株k562由我科冻存,直肠腺癌细胞株hr8348及宫颈癌细胞株hela购自中科院上海细胞库。

  1.2 nk细胞的分离纯化 用淋巴细胞分离液常规分离健康个体外周血单个核细胞, 经pbs洗涤2次,计数细胞,然后按每107细胞加入80 μl缓冲液及20 μl抗cd56免疫磁珠,4℃避光孵育15分钟后,然后每107细胞加入1 ml的缓冲液,300 r/min离心10分钟,去上清,每108细胞加入500 μl的缓冲液,将悬浮好的细胞倒入minimacs磁场中,进行磁珠分离,用一个无菌的试管收集流出的阴性细胞,加入500 μl的缓冲液冲洗分选的细胞,共3次,最后一次当缓冲液快要流出时将柱子从磁场取下,放在一个无菌的试管内,在柱子中加入1 ml的培养基,用柱子上的推注器将要分选的阳性细胞推出,获得cd3-cd56+的细胞即为nk细胞。本实验分离3例健康个体的外周血nk细胞分别培养用于以下实验。

  1.3 细胞培养 nk细胞用含10%胎牛血清和青霉素、链霉素分别为100 u/ml和100 μg/ml的rpmi1640培养基,调整细胞密度为1×106 ml-1,加于24孔培养板中,每孔加入1 000 u/ml rhil2培养。肿瘤细胞培养于含10%胎牛血清和青霉素、链霉素分别为100 u/ml和100 μg/ml的rpmi1640培养基,置37℃、5%co2培养箱中培养。

  1.4 肿瘤细胞表面mica的测定 采用常规免疫荧光法及流式细胞术检测,收集肿瘤细胞,pbs洗涤后,加入amo1,4℃、30分钟,pbs洗涤3次,以fitc标记的山羊抗鼠igg二抗4℃标记30分钟,pbs洗涤后上机分析, 同型igg1(bd pharmingen公司产品)作为相应的阴性对照抗体,流式细胞仪facs elite(美国couter公司产品)分析样本中1×104个细胞中阳性细胞数,计算表达率。为了减少和消除误差,实验设计者和检测人员采取双盲法,重复实验3次。

  1.5 nk细胞的细胞毒实验 以ldh检测试剂盒进行细胞毒实验(分别以3例健康个体的外周血nk细胞重复实验3次),操作按试剂盒说明进行,即取对数生长期的肿瘤细胞为靶细胞,用含5%的胎牛血清rpmi1640完全培养液调整细胞密度为2×105 ml-1,加于96孔板中,每孔50 μl。以培养后的nk细胞为效应细胞,按不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、30∶1)分别加入不同量的效应细胞各50 μl。效、靶细胞自然释放组(效应细胞或靶细胞50 μl,5%的胎牛血清rpmi1640液50 μl),靶细胞最大释放孔加10 μl裂解液,靶细胞、5%的胎牛血清rpmi1640各50 μl。各组均设3个平行孔,置37℃、5%co2条件下培养4小时后,1 000 r/min离心5分钟,小心吸取50 μl上清,加入96孔平底酶标板中,加入50 μl ldh底物反应液,室温下放置30分钟,每孔加50 μl反应终止液终止酶促反应。elx800酶标仪上波长490 nm处以空白组为基准测od值。抗体封闭试验以效靶比10∶1时,amo1与靶细胞室温孵育15分钟,然后再加入nk细胞测杀伤率。

  nk细胞杀伤活性(%)=(实验组od平均值-靶细胞自然释放组od平均值-效应细胞自然释放组od平均值)/(靶细胞最大释放组od平均值-靶细胞自然释放组od平均值)×100%。

  1.6 统计学处理 应用spss 10.0软件进行数据处理,同一肿瘤细胞不同效靶比之间nk细胞的杀伤活性及各效靶比时nk细胞对k562细胞的杀伤活性与nk细胞对其它靶细胞杀伤活性的比较采用单向方差分析,多重比较采用lsd法,mica表达与nk细胞对靶细胞杀伤活性的相关性分析采用双变量相关分析spearman法。

  2 结果

  2.1 肿瘤细胞表面mica的表达 采用facs对不同的肿瘤细胞表面mica的表达情况进行了检测,结果显示人k562、 mcf7、hr8348、cne2、hela细胞均表达mica,阳性率分别为57.30%±1.47%、52.83%±1.35%、65.86%±1.55%、89.30%±2.86%和99.47%±0.92%,见表1。

  2.2 nk细胞杀伤活性 ldh释放法测定nk细胞对k562、mcf7、hr8348、cne2、hela细胞的杀伤活性在效靶比5∶1时分别为29.52%±0.27%、7.64%±0.89%、10.04%±1.58%、9.40%±2.12%、16.64%±0.46%;效靶比10∶1时分别为36.37%±0.78%、19.60%±0.55%、24.45%±0.73%、27.19%±1.80%、31.73%±0.80%;效靶比20∶1时分别为57.57%±1.05%、30.93%±1.47%、35.08%±0.49%、36.42%±4.29%、41.39%±1.44%;效靶比30∶1时分别为70.64%±1.34%、42.70%±2.29%、45.13%±0.54%、54.70%±2.81%、60.30%±2.20%;同一肿瘤细胞不同效靶比之间nk细胞的杀伤活性有显著性差异(p=0.000);在各效靶比时nk细胞对k562细胞的杀伤活性与其它靶细胞相比有显著性差异(p<0.01);在效靶比10∶1时抗mica单抗( amo1)对上述肿瘤细胞进行封闭, nk细胞对k562、 mcf7、hr8348、cne2、hela 细胞的杀伤活性分别为27.04%±2.54%、15.37%±0.96%、18.14%±1.11%、22.10%±0.65%、22.19%±0.63%,与阻断前相比有显著性差异(p=0.000),见图1和图2。

  表1 不同肿瘤细胞表面mica表达的阳性细胞百分数(略)

  tab.1 positive cell ratios of mica in k562,mcf7,hr8348,cne2 and hela cells

  图1 nk细胞对不同肿瘤细胞的杀伤活性(略)

  fig.1 cytotoxicity of nk cells for different tumor cells

  图2 amo1的阻断作用(e∶t =10∶1)(略)

  fig.2 amo1 blocking experiment(e∶t =10∶1)

  2.3 mica表达与nk细胞对靶细胞杀伤活性的相关性分析 以k562细胞作为阳性对照,不同效靶比时nk细胞对靶细胞的杀伤活性与肿瘤细胞表面的mica表达均相关,在效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时相关系数分别为0.680(p=0.015)、0.939(p=0.000)、0.753(p=0.005)、0.935(p=0.000)。

  3 讨论

  nk细胞的活化和功能的发挥由其细胞表面的活化性受体和抑制性受体所传递的信号决定。nk细胞表面的活化性受体大致分为两大类,一类是mhcⅰ类分子特异的受体,其家族所属成员的基因也能编码相应的抑制性受体(kir及cd94/nkg2);第二类是非mhcⅰ类分子特异的受体,包括c型凝集素样家族成员nkg2d和自然细胞毒受体nkp46、nkp44、nkp30。nkg2d是c型凝集素超家族中的一员,不仅表达于所有的nk细胞,且表达于cd8+t细胞、活化的巨噬细胞表面和肿瘤浸润的vδ1γδt 细胞[1,2]。nkg2d的配体为mica、micb和ulbp。mica和micb是mhcⅰ类链基因相关分子,在正常情况下, mic蛋白的表达高度限制于人体肠道(小肠和大肠)上皮细胞中,但在病毒感染等情况下,可诱导mic蛋白的表达增强。在许多人类上皮源性肿瘤中(如黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等)检测到mic蛋白的高表达,并发现在高表达mic蛋白的肿瘤周围浸润的淋巴细胞上同时有nkg2d的表达[25]。nkg2d与其配体的交联可触发nk细胞的细胞毒活性,在肿瘤免疫监视中起着非常重要的作用, 靶细胞上nkg2d配体的表达水平几乎决定了机体nk细胞免疫应答的强弱。

  本研究表明人k562、 mcf7、hr8348、cne2、hela细胞均表达mica且对nk细胞杀伤敏感, 提示nkg2d介导的细胞溶解不仅限于上皮细胞来源的肿瘤,对k562细胞的杀伤也依赖nkg2d,说明mica的表达较广泛,不仅局限于上皮细胞来源的肿瘤,也可能有其它尚未被发现的不同组织细胞也表达mica。我们用抗mica单抗对靶细胞进行封闭,则nk细胞对靶细胞的杀伤能力明显降低,说明nkg2dmica间的相互作用确实参与nk细胞对靶细胞的杀伤,相关分析亦证实靶细胞表面的mica表达水平与nk细胞对靶细胞的杀伤活性相关,但抗体阻断试验并没有完全阻断nk细胞对靶细胞的杀伤活性,说明除了mica介导的杀伤活性外,尚有其它活化性配体参与nk细胞对该类肿瘤的杀伤作用。

  并非肿瘤细胞表面表达mica均能激发nk细胞的杀伤活性,friese等[6]发现正常情况下脑胶质细胞瘤虽然表达mica,但由于该类肿瘤细胞高表达hlaⅰ类分子,因而对nk细胞抵抗,将mica基因转染脑胶质瘤细胞,增强瘤细胞表面mica的表达,可明显提高nk细胞对转mica基因的脑胶质瘤细胞的杀伤活性,将mica基因转染的人胶质瘤细胞ln229/mica及未转染的ln229细胞接种于裸鼠皮下,发现ln229/mica肿瘤生长明显延迟,肿瘤体积明显缩小。转染mica基因的鼠源性胶质瘤细胞sma560/mica经放射线照射后接种于同系小鼠体内,当再次接种sma560细胞时,可产生免疫保护作用,该试验说明提高肿瘤细胞表面的mica分子表达,可克服hlaⅰ类分子传递的抑制性信号,增强nk细胞的杀伤活性。因此研究肿瘤细胞表面mica的表达,为寻找新的免疫治疗方案提供了新的思路。

【参考文献】
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  3 wu j, song y, bakker a b et al. an activating immunoreceptor complex formed by nkg2d and dap10 [j].science,1999; 285(5428):730732.

  4 stephens h a. mica and micb gene:can the enigma of their polymorphism be resolved [j]. trens immunol,2001;22(7):378385.

  5 groh v, rhinehart r, secrist h et al. broad tumor assosiated expression and recognition by tumorderived gamma delta t cells of mica and micb [j]. proc natl acad sci usa,1999;96(12): 68796884.

  6 friese m a, platten m, lutz s z et al. mica/nkg2dmediated immunogene therapy of experimental gliomas [j]. cancer res,2003;63(24):89969006.

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