【摘要】 研制了磁弹性金黄色葡萄球菌无线传感器，用于检测不同液体介质中的金黄色葡萄球菌。取0.2 ml一定浓度菌液加到含2 ml无菌液体介质的检测玻璃管中，磁弹性传感器共振频率随细菌的生长而改变。通过改变牛肉膏和蛋白胨的浓度，得出传感器在含有2×105 cells/ml金黄色葡萄球菌的培养基cm 2-2中共振频率响应最大。结果表明，此传感器可以测定的金黄色葡萄球菌浓度范围在cm 2-2中是3×103~2×107cells/ml，在牛奶中是1×104~2×107 cells/ml，检出限分别是１×103 cells/ml和１×104 cells/ml。传感器共振频移大小与金黄色葡萄球菌的浓度呈线性相关关系，相关系数在牛奶中是0.98，在培养基中是0.99。
【关键词】 磁弹性无线传感器； 金黄色葡萄球菌； 培养基； 牛奶
detection of staphylococcus ａureus in different liquid medium using wireless magnetoelastic sensorhuang si-jing，wang yi-jie，cai qing-yun，fang jian-de(south china institute of environmental sciences，environment protection department，guangzhou 510655 (state key laboratory of chemo/biosensing and chemometrics，and department of chemistry,hunan university，changsha 410082)(pearl river hydraulic research institute，guangzhou 510611)abstract a magnetoelastic staphylococcus aureus(s.aureus) wireless sensor was fabricated to detect s.aureus in different liquid medium.after 0.2 ml bacteria with proper concentration was taken into the testing cuvette containing 2 ml liquid medium，the resonance frequency of magnetoelastic sensor changed with the bacteria growth.via changing the concentration of beef extract and peptone，sensor had the most frequency response in culture medium cm2-2 incubated with 2×105 cells/ml s.aureus.the results indicated that this sensor can be used to determine s.aureus concentrations of 3×103 to 2×107cells/ml in culture medium and 104 to 107 cells/ml in milk，with the detection limits of 103 cells/ml and 104 cells/ml，respectively.the sensor frequency shift was correlated to the logarithmic value of the s.aureus concentration，and the correlation coefficient was 0.98 in milk and 0.99 in culture medium.
keywords magnetoelastic wireless sensor； staphylococcus aureus(s.aureus)； ｃulture medium； ｍilk
1 引言
金黄色葡萄球菌（staphyloccocus aureus）是一种重要的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等，甚至导致败血症、脓毒症等全身感染[1]，因此，检测金黄色葡萄球菌具有实际意义。www.lw881.com目前，检验该菌的方法主要有血浆凝固酶试验[2]， 检验金黄色葡萄球菌肠毒素采用血清学反应[3]、直接落射荧光滤膜技术[4]、生物发光法[5]、压电石英晶体技术[6]等，这些方法中检测器都需要与电源连接，不能进行无线检测。
近年来，一种新型无线磁弹性传感器得到迅速发展[7~18]。图1a为传感器工作原理：在外加交变磁场中，传感器产生磁致伸缩。当外加交变磁场频率与传感器振动频率相等时，传感器产生共振，对应的振动频率为传感器共振频率。当传感器表面性质发生变化，其共振频率随之改变。其伸缩振动产生的磁通可由检测线圈检测到，从而实现无线传感[7]。目前，这种传感器已在遥感监测胃液ph值[8]、葡萄糖浓度[9]、湿度[10]、内毒素[11]、磷酸酯酶[12]、有机磷农药[13]、血液凝结[14]等方面得到广泛应用。基于抗体与抗原结合构成的磁弹性免疫传感器，用于检测沙门氏菌[15]、大肠杆菌[16]等。还有表面无任何化学及生物修饰的磁弹性传感器用于结核杆菌[17]、大肠杆菌[18]的生长实时检测。
本实验研制了一种磁弹性金黄色葡萄球菌无线传感器，用于检测金黄色葡萄球菌。将传感器置于含有细菌的液体介质中，对细菌进行实时在线定量检测。这种无线无源磁弹性传感器基于传感器对溶液性质（主要是粘度）改变的响应，可直接检测不同液体介质中的金黄色葡萄球菌含量。
2 实验部分
2．1 仪器与试剂
磁传感器是一种带状非晶态铁磁合金2826mb（fe40ni38mo4b18，美国honeywell公司），尺寸为18 mm×6 mm×28 μm，修饰前在空气中的共振频率约为105 khz； 磁弹性传感器检测装置为实验室自制（见图1b）； lrh-250a 型生化培养箱（广东省医疗器械厂）；dsx-280a 手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；乌氏粘度计（上海申立玻璃仪器有限公司，直径0.53 mm）；sw-cj-1bu超净工作台和hhs-11-1电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）。
金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus， 湖南师范大学）；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、植物胨和琼脂粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）；聚氨酯（bayhydrol 110，水性羟基聚丙烯酸分散体，美国bayer公司）；巴斯德灭菌纯牛奶（当地商店）。所有试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
2．2 实验方法
2．2．1 传感器制备 将传感器放入丙酮中超声清洗20 min，再用水反复清洗3次，用氮气吹干；然后将10 μl bayhydrol 110均匀涂在传感器两面，自然干燥后放入150 ℃烘箱中烘2 h，使传感器表面形成一层牢固的保护膜。此膜可以防止磁片腐蚀生锈，又为细菌正常生长提供了合适的表面。
图1 传感器测定原理(a)及装置(b)（略）
fig.1 sensor principle(a) and device(b)
传感器置于装有检测溶液的小管中，小管置于恒温水浴锅内，检测装置通过端口rs232与电脑相连来显示和储存数据（the sensor is placed within a vial containing the test solution，which is then placed inside a coil in a thermostate.the detecting device is interfaced to a computer via a rs232 port for data display and storage）。
2．2．2 储备培养基cm 1配制 大豆肉汤（trytic soy broth，tsb）培养基的成分是：胰蛋白胨3.4 g，植物胨0.6 g，葡萄糖0.5 g，k2hpo4 0.5 g，nacl 1 g，二次蒸馏水200 ml，用1 mol/l naoh调ph至7.3，121 ℃高压灭菌20 min。将金黄色葡萄球菌接种至已灭菌的tsb中，在37 ℃培养箱中培养18 h后放入冰箱，4 ℃条件下保存备用。用传统平板记数法测得菌液浓度是4.6×109 cells/ml。
2．2．3 检测培养基cm 2配制 营养肉汤（nutrient broth，nb）培养基的成分是：牛肉膏1 g，蛋白胨2 g，nacl 1 g，二次蒸馏水200 ml，用1 mol/l naoh调至ph 7.2，121 ℃高压灭菌20 min。cm 2-1，cm 2-2和cm 2-3分别是将标准检测培养基的牛肉膏和蛋白胨浓度增加1，2和3倍。
2．2．4 测量 菌液经无菌水梯度稀释到一定浓度，取0.2 ml加入到含2 ml无菌液体介质的检测玻璃管中，用棉塞塞上管口，将玻璃管插入磁传感器检测线圈中。检测线圈置于37 ℃恒温水浴锅中开始测量，每1 min采集数据一次，存储在计算机中。最后经数据处理，得到传感器共振频移响应曲线，所有实验重复6次。
3 结果与讨论
3．1 培养基浓度的影响
牛肉膏和蛋白胨是影响nb培养基粘度的主要成分，通过改变它们的浓度来改变培养基的粘度，分别增加到标准浓度的2，3和4倍。
磁弹性传感器在含有2×105 cells/ml金黄色葡萄球菌的不同浓度检测培养基中的典型频移响应曲线如图2。图2显示，传感器在cm 2-2中共振频率响应最大，在cm 2和cm 2-1中响应较小，说明传感器对粘度较高的溶液共振频移响应较大。但并不是溶液粘度越高越好，当物质浓度增加3倍时，传感器在cm 2-3中响应反而比cm 2-2小，说明培养基营养物质含量过高不利于细菌生长，也可能是溶液粘度过高对传感器的性能不利。因此后面的实验中使用cm 2-2。
3．2 不同液体介质中金黄色葡萄球菌的测定
实验根据金黄色葡萄球菌在液体介质中的生长曲线对它进行定量分析。图3 显示了传感器对cm 2-2中不同浓度的金黄色葡萄球菌的典型共振频移响应曲线。曲线反映了细菌的3个生长阶段：a复生阶段 金黄色葡萄球菌恢复其生理活性，传感器共振频移微小增加；b指数增长阶段 细菌按指数规律增殖，传感器共振频移显著增加；c稳定阶段 细菌衰亡，传感器共振频率不再变化。空白曲线没有明显响应，可知传感器在空白培养基中，其表面的聚氨酯膜不存在非特异性吸附，也说明实验所用培养基性质稳定。但是传感器的共振频移不仅取决于培养基粘度的变化，而且与细菌在传感器表面的粘附有关。细菌在传感器表面的吸附会使共振频率下降，需要寻找一种亲水膜使细菌粘附最小，从而改善传感器的灵敏度。本实验中金黄色葡萄球菌对聚氨酯亲水膜几乎不存在吸附，所以由质量引起的频率下降可不予考虑。
图2 磁弹性传感器在不同浓度培养基中典型频移响应曲线（略）
fig.2 typical frequency response curves of magnetoelastic sensor in different concentration culture medium
金黄色葡萄球菌浓度(staphylococcus aureus(s.aureus) concentration): 2×105 cells/ml，cm 2.标准培养基(ｓtandard culture medium)； cm 2-1.2倍标准培养基(ｄoubling culture medium)； cm 2-2.3倍标准培养基(ｔrebling culture medium)； cm 2-3.4倍标准培养基(ｑuadrupling culture medium)。
图3 不同浓度金黄色葡萄球菌在培养基中的典型频移响应曲线（略）
fig.3 typical frequency response curves in culture medium of different concentration of staphylococcus aureus
培养基(ｃulture medium): cm 2-2； 3倍标准培养基(ｔrebling culture medium)；金黄色葡萄球菌浓度(s.ａureus concentration): (1) 2×107； (2) 2.4×105； (3) 3×103； (4) 0 cells/mｌ。
图4是传感器对金黄色葡萄球菌在牛奶中生长的共振频移响应曲线。该曲线反映了牛奶的分解与凝固过程。细菌的增殖分解了牛奶中的大分子物质，导致牛奶粘度减小，传感器共振频率增加。进一步培养又使牛奶凝固，从而粘度显著上升，传感器共振频率减小。图4所示，细菌初始浓度越高传感器频率上升越快，达到最高点所需培养时间越短，即传感器频率开始下降的时间越短。传感器在无菌的牛奶中共振频移仅有所下降，是由于在37 ℃的培养条件下，牛奶自身凝固。为考察牛奶粘度的变化情况，将2×107 cells/ml金黄色葡萄球菌接种到牛奶中培养，在25 ℃水浴中用乌氏粘度计测定牛奶粘度。牛奶粘度从1.877 mpa·s降到1.576 mpa·s，又上升到2.037 mpa·s，所以传感器共振频率先增大后减小。
图5显示，传感器共振频移大小与金黄色葡萄球菌的浓度密切相关。金黄色葡萄球菌的浓度可以通过传感器共振频率的增大和减小进行定量分析，线性范围在牛奶中是１×104~１×107 cells/ml，检出限是１×104 cells/ml，在培养基中是１×103~１×107 cells/ml，检出限是１×103 cells/ml。
图4 不同浓度金黄色葡萄球菌在牛奶中的典型频移响应曲线（略）fig.4 typical frequency response curves in milk of different concentration of staphylococcus aureus
金黄色葡萄球菌浓度(s.aureus concentration): (1) 2×107； (2) 3.4×106； (3) 1.8×105； (4) 2.5×104； (5) 0 cells/mｌ。
图5 最大频移与金色葡萄球菌初始浓度与(1)牛奶，(2)培养基中的对数关系 （略）
fig．5 relationship between frequency shift and logarithmic initial s.aureus concentration in milk(1) and in culture medium(2)
【参考文献】
１ torres v j，stauff d l，pishchany g.cell host microbe, 2007, 1(2): 109～119
２ liu zhen-zhen（刘真真），lin tao（林 涛），li guang-wei（李光伟）.inspection and quarantine science（检验检疫科学）， 2005，15(5): 34～35
３ wang xiao-hong(王小红)， xu kang(徐 康)， wang yin(王 莹).j.food sci.（食品科学杂志）， 2006，27(8): 227～231
４ tortorello m l，stewart d s.appl.environ.microb., 1994，60(10): 3553～3559
５ costa p d，andrade n j，passos f j.braz.arch.biol.techn.，2004，4(3): 399～405
６ bao l l，tan h w，duan q.anal.chim.acta, 1998，369(1-2): 139～145
７ schmidt s，grimes c a.sens.actuat.a，2001，94(3): 189～196
８ cai q y，grimes c a.sens.actuat.b，2000，71(1-2): 112～117
９ cai q y，zeng k f，ruan c m，desai t a，grimes c a.anal.chem., 2004，76(14): 4038～4043
１０ grimes c a，kouzoudis d，dickey e c，qian d，anderson m a，shahidain r，lindsey m，green l.j.appl.phys.，2000，87(9): 5341～5343
１１ ong k g，leland j m，zen g k f，barrett g，zourob m，grimes c a.biosens.bioelectron.，2006，21(12): 2270～2274
１２ wu s h，gao x j，cai q y.sens.actuat.b, 2007，123(2): 856～859
１３ zourob m，ong k g，zeng k f，mouffouk f，grimes c a.analyst，2007，132(4): 338～343
１４ roy s c，paulose m，grimes c a.biomaterials，2007，28(31): 4667～4672
１５ guntupalli r，hu j，lakshmanan r s，huang t s，barbaree j m，chin b a.biosens.bioelectron., 2007，22(7):1474～1479
１６ ong k g，zeng k f，yang x p，shankar k，ruan c m，grimes c a.ieee sens.j., 2006，6(3): 514～523
１７ pang p f，cai q y，yao s z，grimes c a.talanta，2008，76(2): 360～364
