【摘要】 目的: 探索甘露聚糖结合凝集素（mbl）基因gga57gaa点突变引起免疫缺损的机制。方法: 采用pcr从质粒pmblm57中扩增含gga57gaa点突变的mbl基因, 构建重组真核表达载体, 电转染cho细胞, 以zeocin筛选并克隆化培养, 用mab-sepharose 4b和ni2+-nta agarose层析纯化目的蛋白, 以sds-page、 western blot、 elisa、 配体结合试验、 c4d沉积试验等鉴定目的蛋白。结果: 重组真核表达载体pcdna4/hismax c-mblm57转染cho细胞后获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株; 37glu突变型mbl蛋白主要以双链（mr约60000）存在, 不能形成高聚体; 其配体结合能力低下, 与masp-2n端蛋白的结合能力也降低, 不能通过凝集素途径激活补体系统。结论: gga57gaa点突变产生结构有缺陷的mbl蛋白, 进而影响其识别功能和效应功能。
【关键词】 甘露聚糖结合凝集素 gga57gaa突变体 37glu突变型蛋白 识别功能 效应功能
甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin, mbl）是肝细胞分泌的血浆蛋白, 为c型凝集素超家族中胶凝素家族成员［1］。mbl的糖识别域（carbohydrate-recognition domain, crd）是其识别功能区, 可选择性识别多种病原体表面以man、 mannac、 glcnac等为末端糖基的糖结构; 胶原样区（collagen-like region, clr）为其效应功能区, 通过与mbl相关丝氨酸蛋白酶（mbl associated serine protease, masp）相互作用, 激活补体凝集素途径, 发挥溶菌和调理功能, 还能与吞噬细胞胶凝素受体结合而发挥直接调理作用［1, 2］。WwW.lw881.com已发现3个可引起调理吞噬缺损的mbl结构基因点突变, 分别位于外显子1 的第54、 57和52位密码: ggc54gac和gga57gaa, 其编码产物gly为asp或glu取代; cgt52tgt的编码产物arg变为cys。这些点突变为常染色体显性遗传, 其基因频率ggc54gac在欧亚人群中较高（≥0.11）, gga57gaa在次撒哈拉非洲人群中很高（达0.29）, 而cgt52tgt在所研究过的人群中较低（≤0.06）［3, 4］。我们对中国十余个民族的群体研究发现, 其mbl基因点突变的频率多在0.1以上。显然, mbl缺损是迄今所发现的最常见的免疫缺损病。因此, 阐明mbl基因突变引起免疫缺损的机制具有极其重要的意义。本课题组将人3种突变型mbl基因在cos7细胞中瞬时表达, 证明mbl这些点突变不影响mbl蛋白的合成与分泌［5］; 将cgt52tgt、 ggc54gac突变体基因在cho细胞中稳定表达, 发现32cys和34asp突变型mbl蛋白的寡聚化程度大大低于重组野生型和天然mbl蛋白［6, 7］。那么, gga57gaa突变的影响是否同52、 54位密码突变一样？ 本研究中, 我们将gga57gaa突变体基因在cho细胞中稳定表达, 并对37glu突变mbl蛋白进行初步的结构和生物学活性研究。
1 材料和方法
1.1 材料 含人gga57gaa mbl突变体全长编码区基因的质粒pmblm57［8］、 重组野生型mbl蛋白［9］、 人血浆天然mbl蛋白［10］、 重组人masp2-n端蛋白以及抗人mbl crd单克隆抗体（monoclonal antibody, mab）、 mbl缺陷型人血清（基因型为lypb/lypb）、 质粒pcdna4/hismax c和大肠杆菌top10f`为南方医科大学免疫学教研室构建、 制备和保存。限制性内切酶、 taq dna聚合酶、 t4 dna连接酶、 dna marker和逆转录试剂盒购自takara公司。高相对分子量（mr）和低mr蛋白marker购自晶美公司。hrp-羊抗鼠igg抗体购自鼎国公司。质粒小量快速抽提试剂盒和dna小量快速纯化试剂盒购自申能博彩生物公司。rpmi1640培养基、 新生牛血清和zeocin购自invitrogen公司。ni2+-nta agarose购自qiagen公司。抗人c4d单克隆抗体(mab)购自quedel公司。抗人mbl mab ［hyp 131-11］购自abcam公司。cnbr活化的sepharose 4b购自amersham biotech公司。抗his mab购自tiangene公司。centricon plus-20超滤膜（mr cut-off 10000）购自millipore公司。甘露聚糖购自sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 真核表达载体的构建与鉴定 上游引物5′-cgggatccatgtccctgtttccatca-3′, 含bamh ⅰ酶切位点; 下游引物5′-cggaattcactcacagacccttcagatagggaact-3′, 含ecor i酶切位点。引物由上海博亚公司合成。以pmblm57质粒为模板, 以上述引物进行pcr扩增带有gga57gaa点突变的mbl cdna片段, 回收、 纯化pcr产物。将cdna片段与pcdna4/hismax c质粒分别经bamh i和ecor i双酶切后, 以t4 dna连接酶于16℃连接8 h, 将目的基因片段插入pcdna4/hismax c质粒中, 转化大肠杆菌top10f′, 以25 mg/l zeocin筛选阳性克隆。小量提取质粒, 用bamh i和ecor i双酶切鉴定, 经双向测序（由上海博亚公司进行）确证后, 大量扩增。鉴定正确的重组质粒命名为pcdna4/hismax c-mblm57。
1.2.2 cho细胞的转染、 筛选及克隆化 于0℃在950 μf、 250 v电击下, 将重组表达载体pcdna4/hismax c-mblm57转染cho细胞。具体操作参照bio-rad公司电穿孔仪操作手册。将转染后的cho细胞置12孔板内培养24 h后, 以800 mg/l zeocin加压筛选。1周后, 挑取单克隆细胞以相同浓度zeocin继续加压筛选20 d。随后的1个月中, 每隔3~5 d换液1次, 维持zeocin的浓度为200 mg/l。稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株命名为cho-mblm57。
1.2.3 外源基因表达的rt-pcr分析 以1 ml trizol试剂提取1×107个cho-mblm57细胞总rna后, 采用逆转录试剂盒获取cdna产物。以cdna产物为模板, 上述1对特异性引物进行pcr, 用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
1.2.4 mbl-crd mab亲和层析柱的制备 参照文献［11］方法, 将mbl-crd mab与活化sepharose 4b偶联, 制备mbl-crd mab-sepharose 4b层析柱。
1.2.5 重组蛋白的纯化 (1)收集cho-mblm57细胞培养上清, 缓慢加入饱和 (nh4)2so4溶液至终浓度为60%, 于4℃搅拌2 h沉淀蛋白, 以8000 r/min于4℃离心30 min。将沉淀溶于0.01 mol/l pbs (ph7.4, 含0.5 mol/l nacl)中, 装透析袋, 在pbs中于4℃透析24 h, 每4~6 h换液1次。(2)以0.45 μm微孔滤膜过滤, 以1 ml/min速度上样mbl-crd mab-sepharose 4b柱, 重复3次后于4℃反应2 h。以10倍柱床体积pbs淋洗, 至a280<0.05; 用5倍柱床体积0.1 mol/l gly-hcl（ph2.4）洗脱, 流速为1.5 ml/min, 收集洗脱液, 立即以1 mol/l tris-hcl(ph9.0)中和ph值至7.0~7.2。(3)将初步纯化蛋白用平衡盐溶液（ph8.0）于4℃透析12 h, 每4~6 h换液1次。上样ni2+-nta agarose进行层析, 具体操作见ni2+-nta agarose层析柱说明书。目的蛋白于50 mmol/l pbs（ph7.2）中充分透析去除咪唑及盐类, 经超滤浓缩后即为37glu突变型mbl蛋白。
1.2.6 sds-page和western blot检测 将37glu突变型和重组野生型mbl蛋白上样进行sds-page, 部分胶进行常规染色; 另一部分用于western blot检测: 电转移后, 将硝酸纤维素膜膜置于30 g/l脱脂奶粉中于4℃封闭过夜; 加1∶3000稀释抗his mab于室温反应1 h, 洗膜5次; 加1∶4000稀释hrp-羊抗鼠igg, 室温反应1 h, 洗涤后以dab/nicl2底物液显色。
1.2.7 酶联免疫吸附试验（elisa） 将37glu突变mbl蛋白从20 mg/l倍比稀释至0.6 mg/l, 加入酶联板中, 100 μl/孔, 以天然mbl蛋白和重组野生型mbl蛋白为阳性对照,稀释液为阴性对照, 4℃包被过夜; 加入50 g/l脱脂奶粉, 37℃封闭2 h; 洗涤后, 分别加入1∶5000抗人mbl mab［hyp 131-11］、 1∶1000抗人mbl-crd mab或1∶5000抗his mab, 37℃反应1 h; 洗涤后加入1∶5000 hrp-羊抗鼠igg, 37℃反应30 min; 洗涤后, 加tmb底物液显色, 以2 mol/l h2so4终止反应, 在酶联仪上测a450值。
1.2.8 配体结合试验 将10 mg/l甘露聚糖加入酶联板中, 100 μl/孔, 4℃包被过夜; 加入50 g/l脱脂奶粉, 37℃封闭2 h; tbs-t（含10 mmol/l ca2+）洗涤后, 分别加入不同浓度（0.6 ~10 mg/l）的天然mbl、 重组野生型mbl和37glu突变mbl蛋白, 100 μl/孔, 37℃反应1 h; 洗涤后, 加入1∶5000抗人mbl mab, 37℃反应1 h; 洗涤后, 加入1∶5000 hrp-羊抗鼠igg, 37℃反应30 min; 洗涤后, 加tmb底物液显色, 以2 mol/l h2so4终止反应, 在酶联仪上测a450 值。
1.2.9 重组蛋白与masp2-n端蛋白结合试验 将10 mg/l纯化重组人masp2-n端蛋白加入酶联板, 100 μl/孔, 4℃包被过夜; 加入50 g/l脱脂奶粉, 37℃封闭2 h; tbs-t(含10 mmol/l ca2+) 洗涤后, 加入不同浓度（0.03~1 mg/l）人血浆来源天然mbl、 重组人野生型mbl和37glu突变型mbl蛋白, 37℃反应1 h, 对照组稀释液中含10 mmol/l edta; 洗涤后, 加入1∶1000鼠抗人mbl-crd mab, 37℃反应1 h; 洗涤后, 加入1∶5000 hrp-羊抗鼠igg, 37℃反应30 min; 洗涤后, 加tmb底物液显色, 以2 mol/l h2so4终止反应, 在自动酶联仪上测定a450值。
1.2.10 c4d沉积试验 将100 mg/l甘露聚糖加入酶联板, 100μl/孔, 4℃包被过夜; 加50g/l脱脂奶粉, 37℃封闭2h; tbs-t（含10mmol/l ca2+）洗涤后, 加不同浓度（0.6~10mg/l）重组野生型和37glu突变型mbl蛋白, 37℃反应1 h; 洗涤后, 加1∶50稀释mbl缺陷型人血清, 37℃反应1 h; 洗涤后, 加1∶5000鼠抗人c4d mab, 37℃反应1 h; 洗涤后, 加1∶5000 hrp-羊抗鼠igg, 37℃反应30 min; 洗涤后, 加tmb底物液显色, 以2 mol/l h2so4终止反应, 在酶联仪上测a450值。
2 结果
2.1 真核表达载体的构建 采用pcr获得长约750 bp的cdna片段, 将其定向插入真核表达载体中, 构建重组真核表达载体pcdna4/hismax c-mblm54。经bamhⅰ和ecorⅰ双酶切, 可见2条带, 其中约750 bp带为目的片段。以特异性引物进行pcr, 亦获得长约750 bp的片段（图1）。通过dna测序, 确认插入dna片段的序列与预期结果完全一致, 带有gga57gaa点突变。
图1 重组质粒的鉴定（略）
1: λecot14ⅰ dna marker; 2: 重组质粒pcdna4/hismax c-mblm57的ecor i酶切产物; 3: 质粒pcdna4/hismax c的ecor i酶切产物; 4: 重组质粒pcdna4/hismax c-mblm57的ecor i和bamh i双酶切产物; 5: 重组质粒pcdna4/hismax c-mblm57的pcr产物.
2.2 cho-mblm57细胞的筛选与克隆化培养 采用电穿孔法, 将重组表达载体pcdna4/hismax c-mblm57转染cho细胞, 经长达近2个月的zeocin加压筛选和维持培养, 获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株, 分别命名为b4-cho-mblm57、 c7-cho-mblm57、 f6-cho-mblm57、 g5-cho-mblm57和g9-cho-mblm57。
2.3 cho-mblm57细胞内目的基因mrna的表达 提取1×107个cho-mblm57细胞的总rna, 经rt-pcr扩增, 得到长约750 bp的片段, 与预期结果一致（图2）。
图2 rt-pcr鉴定目的基因mrna（略）
1: dl 2000 dna marker; 2: 质粒pcdna4/hismax c转染cho细胞的rt-pcr产物; 3: 重组质粒pcdna4/hismax c-mblm57转染cho细胞的rt-pcr产物.
2.4 37glu突变型mbl蛋白的分子质量与抗原性 经硫酸铵粗沉淀及两步亲和层析, 从1 l细胞培养上清中可得到约1 mg蛋白。sds-page分析发现, 在非还原状态下, 37glu突变mbl蛋白在mr 60000处有1条明显的带, 在mr 200000处见1条很弱的带, 而重组野生型mbl蛋白则在mr>200000处可见多条明显条带, 在60000处只有非常微弱的条带。western blot结果显示, 37glu突变型mbl蛋白在mr 60000处呈现1条能与抗his抗体反应的条带, 而重组野生型mbl蛋白的染色带则主要在mr>200000处（图3）。elisa表明, 重组37glu突变mbl蛋白能为抗his、 mbl-crd或mbl的mab所识别（图4）。
图3 sds-page和western blot分析纯化的重组表达产物（略）
1: 蛋白marker; 2: 重组野生型mbl; 3: 重组37glu突变型mbl; 4: 重组野生型mbl的western blot图; 5: 重组37glu突变型mbl的western blot图.
2.5 37glu突变型mbl蛋白的配体结合能力 配体结合试验结果显示, 37glu突变mbl蛋白无糖结合能力, 而天然mbl和重组野生型mbl蛋白与甘露聚糖有良好的结合活性（图5）。
图4 37glu突变型mbl蛋白与抗体的结合(n=3)（略）
图5 37glu突变型mbl蛋白与甘露聚糖的结合(n=3)（略）
2.6 37glu突变型mbl蛋白与masp2-n端蛋白的结合能力 结合试验显示, 人天然mbl和重组野生型mbl蛋白对masp2-n端蛋白有良好的结合活性, 但37glu突变mbl蛋白则否（图6）。
图6 37glu突变型mbl蛋白与甘masp2-n端蛋白的结合(n=3)（略）
2.7 37glu突变型mbl蛋白激活补体的活性 重组野生型mbl蛋白能通过凝集素途径激活补体, 裂解c4产生c4d, 而37glu突变型mbl蛋白激活补体的活性几乎完全消失（图7）。
图7 37glu突变型mbl蛋白激活补体的作用(n=3)（略）
3 讨论
人mbl肽链mr为27000~32000, 3条肽链构成结构单位, 完整的mbl分子是这种结构单位的寡聚体, 多至六聚体［1, 2］。mbl的结构如此复杂, 在原核系统是无法表达的。因此, 我们选用真核表达载体和哺乳动物细胞进行研究, 以期模拟mbl基因在人类细胞中表达的情况。本实验选择真核表达载体pcdna4/hismax c和cho细胞作为研究系统, 构建的重组表达载体经dna测序确证mbl基因中含gga57gaa点突变, 然后将其转染cho细胞中表达。真核表达的关键之一在于能否筛选到稳定高效的表达细胞株。由于pcdna4/hismax c含有zeocin抗性基因, 我们用zeocin持续加压转染细胞近2个月, 最终筛选到5株稳定表达株。采用mab-sepharose 4b和ni2+-nta agarose层析法纯化37glu突变型mbl蛋白, 效果比较满意, 获得了较高纯度的目的蛋白。
已发现3个可引起免疫缺损的mbl结构基因点突变, 但对其引起调理吞噬缺损的机制了解不多。我们先前的研究证明, mbl 结构基因的3个点突变均不影响mbl蛋白的合成与分泌［5］, 本实验成功地获得分泌性表达37glu突变mbl分子的cho细胞株和重组37glu突变mbl蛋白, 亦表明gga57gaa点突变并不影响其产物的表达及向胞外分泌的过程。应用sds-page和western blot分析, 发现37glu突变mbl蛋白主要是mr 60000的分子, 这应该是mbl肽链的双体, 其寡聚化程度大大低于重组野生型mbl, 高寡聚化的mbl分子极少。这与我们对32arg［6］和34asp［7］突变蛋白的研究结果相似。功能实验发现, 37glu突变型mbl蛋白不能与配体甘露聚糖结合, 亦缺乏与masp-2n端蛋白结合的能力, 从而导致其激活补体凝集素途径的活性几乎完全消失。mbl分子的寡聚化程度与其clr密切相关, 而寡聚化程度直接影响其功能, 只有四聚体以上的多聚体才具生物学活性［12］。因此有理由推论, 因gga57gaa点突变产生的带有巨大侧链和电荷的glu代替了无侧链且电中性的gly, 影响了3条肽链clr α-螺旋的形成, 从而妨碍了mbl结构单位和/或寡聚体的装配, 即产生了结构有缺陷的mbl分子, 并进而影响其功能活性。同时亦表明, mbl肽链第57位gly残基对于维持完整mbl分子的结构和功能是必需的。
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