【摘要】 以对苯二胺（p-pd）为模板分子，分别以甲基丙烯酸（maa）和丙烯酰胺（aa）为功能单体，制备了p-pd的印迹聚合物p(maa)和p(aa)，采用色谱法考察了其分子识别特性。结果表明，p(aa)对p-pd无明显的印迹效应；而甲醇为流动相时，p(maa)能够选择性结合p-pd分子（k′=3.57），对p-pd有显著的印迹效应（印迹因子if=2.95），p(maa)柱可以实现p-pd与邻苯二胺（o-pd）和对氨基苯甲酸（p-aba）的色谱分离。通过光谱实验及hf/6-31g*量化理论计算方法，对比研究了p-pd与maa和aa之间的相互作用。maa与p-pd能够形成更稳定的复合物，p(maa)对p-pd具有更好的分子识别能力。研究表明紫外吸收光谱法和荧光光谱法以及量子化学理论计算法可作为功能单体筛选的有效手段；对于荧光模板分子，荧光光谱法具有简便、灵敏等特点。
【关键词】 对苯二胺；分子印迹聚合物；分子识别；分子光谱法；量子化学计算法
molecular recognition properties of p-phenylenediamine-imprinted polymerszhang tie-li*，meng xiang-jun，jia jun-fang，han li-ling(department of chemistry，tangshan teachers college，tangshan 063000)abstract two p-phenylenediamine(p-pd)-imprinted polymers，p(maa) and p(aa)，were synthesized using methacrylic acid (maa) and acrylamide(aa) as functional monomer，respectively，in order to prepare molecular recognition material with high selectivity for p-pd and explore the feasibility of methods such as molecular spectrometry and computational approach of quantum chemistry for the selection of functional monomer with high imprinting efficiency.the molecular recognition properties of the imprinted polymers were evaluated by high performance liquid chromatography.the results indicated that p(aa) exhibited no imprinting effect for p-pd，while p(maa) can bind p-pd selectively(k′=3.57)，which showed remarkable imprinting effect (if=2.95)，and p-pd and its analogues o-phenylenediamine and p-aminobenzoic acid can almost realize baseline separation on p(maa) column in the mobile phase of methanol.furthermore，we made a comparative study on the interaction of p-pd with maa and aa by spectroscopic techniques such as uv and fluorometry as well as hf/6-31g* computational approach.the results demonstrated that the complex of p-pd-maa was more stable than that of p-pd-aa，which can give a good explanation for the molecular recognition properties of p(maa) and p(aa).the study indicated that both molecular spectrometry（uv and fluorometry）and computational approach of quantum chemistry can be employed as efficient means for the selection of efficient functional monomer.the results showed that fluorometry is sensitive and convenient for the choice of functional monomer if the template molecule is fluorescent.
keywords p-phenylenediamine； ｍolecularly imprinted polymer； ｍolecular recognition； ｍolecular spectrometry； ｃomputational approach of quantum chemistry
1 引言
分子印迹聚合物（mip）是具有分子识别能力的高分子材料，对目标分子具有“预定的选择性”。wWW.133229.Com分子印迹技术是一种通过化学手段合成对小分子化合物具有抗体结合性质仿生材料的有效方法[1，2]。mip的制备一般包括3个步骤：（1）在预聚合混合物溶液中，模板分子（t）与功能单体(m)通过共价键或非共价键结合形成m-t复合物；（2）在大量交联剂存在下，通过光或者热引发进行共聚反应，m-t复合物被固定在高度交联的高分子母体中；（3）通过物理或化学方法，将模板分子从聚合物中洗脱，得到mip。mip中留有形状、大小以及功能单体作用基团排列与模板分子的空间结构相匹配的空穴，这种印迹空穴是mip对模板分子具有分子识别能力的根源。与生物抗体相比，mip具有化学性质稳定、对环境耐受性强、容易制备、能够反复使用及在有机溶剂中具有高选择性等优点。目前，mip在各种基于选择性配体结合的应用中，如手性物质的色谱分离、传感器、固相萃取等方面，已显示出了广泛的应用前景[3~6]。
对苯二胺（p-pd）是苯胺类染发剂的主要成分，长期使用苯胺类化学染发剂染发会导致体内蓄积毒素，当蓄积毒素超过1%时，就会导致各种癌症的发生[7]。因此，研究对p-pd有特异亲和力的分子识别材料具有实际意义。此外，针对目标化合物，如何选择适宜的功能单体，以制备对其具有高选择性和高亲和力的mip，是mip研究中最受关注的问题之一[8，9]。本研究以p-pd为目标化合物，分别以甲基丙烯酸(maa)和丙烯酰胺（aa）为功能单体，制备了对应的p-pd印迹聚合物。用色谱法对其分子识别特性进行了表征，并通过光谱实验及hf/6-31g*量化理论计算方法[10，11]，研究了p-pd与maa和aa之间的相互作用，阐明了其印迹和识别机理。研究表明，uv光谱法、荧光光谱法和量子化学理论计算法可作为筛选功能单体的有效手段。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
uv2600分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；f-4500荧光分光光度计（日本日立公司）； hp1200高效液相色谱仪（美国agilent公司），包括四元泵、紫外检测器和20 μl进样阀。对苯二胺（p-pd）、邻苯二胺（o-pd）、对氨基苯甲酸（p-aba）、1-萘胺（1-na）和丙烯酰胺（aa）（分析纯，北京化学试剂公司）；甲氧氯普胺（mp，分析纯，acros公司）；甲基丙烯酸(maa，天津市化学试剂厂)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(egdma，分析纯，acros公司)使用前减压蒸馏除去阻聚剂；甲醇（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）；乙腈（mecn，色谱纯，acros公司）；偶氮二异丁腈(aibn，化学纯，上海试剂四厂)使用前用乙醇重结晶。
2.2 印迹聚合物的制备
将1 mmol(108 mg) p-pd和4 mmol 功能单体（0.34 ml maa或 284 mg aa）加入到180 mm×18 mm硬质玻璃管中，溶于10 ml mecn。然后，加入20 mmol(3.78 ml) egdma和20 mg aibn，混匀，通氮气10 min，液氮条件下真空封管，60 ℃水浴中反应24 h。将聚合物研磨、过筛，得到粒径小于50 μm的颗粒。用丙酮反复沉降并弃掉过细颗粒后，60 ℃真空干燥，得到印迹聚合物p(maa)和p(aa)。空白聚合物bp(maa)和bp(aa)的制备和处理，除聚合时不加入p-pd外，其余步骤同上。
2.3 色谱法评价印迹聚合物的分子识别性能
将印迹聚合物装填于100 mm×4.6 mm不锈钢色谱柱中，以hac-ch3oh(2∶8，v/v)溶液为洗脱液，将其中的p-pd等洗出；然后用ch3oh洗去聚合物上残留的hac。bp的洗脱与之相同。然后，改变流动相，测定p-pd及各类似物在色谱柱中的保留时间tr，并用丙酮测定死时间t0。组分浓度0.1 mmol/l，进样量20 μl。容量因子k′按公式k′=(tr-t0)/t0计算，相对保留值α按α=k′t/k′i计算，其中k′t和k′i分别为p-pd和各结构类似物的k′。
2.4 紫外光谱法研究模板分子与功能单体的作用
取一系列10 ml比色管，分别加入1.00 ml 1.0 mmol/l p-pd乙腈溶液，然后再加入适量maa或aa的乙腈溶液，用乙腈稀释至刻度，摇匀。以相应浓度的maa或aa的乙腈溶液为参比，在190~400 nm波长范围内扫描其uv光谱。
2.5 荧光光谱法研究模板分子与功能单体的作用
取一系列10 ml比色管，各加入1.00 ml 1.0 mmol/l p-pd溶液，配制maa和aa与p-pd的摩尔比均为4∶1的p-pd-maa和p-pd-aa的乙腈混合溶液。固定激发波长为258 nm，在260~400 nm之间分别扫描混合物溶液及相应的p-pd、maa和aa乙腈溶液的荧光光谱。
2.6 计算法研究模板分子与功能单体的作用
采用hf/6-31g*计算方法，研究p-pd与maa及aa之间的相互作用。寻找p-pd、maa和aa各个分子的最稳定构象；然后，选取p-pd的最稳定构象，分别与1~2个功能单体分子的最稳定构象形成可能的复合物，优化各复合物的稳定构型，找出最稳定构型；计算复合物的结合能： δe =e复合物 -e模板分子-∑e功能单体。根据结合能的大小，判断复合物的稳定性。
3 结果与讨论
3.1 色谱法表征印迹聚合物的分子识别特性
分别以p(maa)和p(aa)为固定相填料，用色谱法考察其分子识别性能。结果表明，以乙腈为流动相时，p(maa)和p(aa)对p-pd均未产生明显的印迹效应。当以甲醇为流动相时，p(aa)对p-pd的结合很弱（k′=0.22），而p(maa)对p-pd有较强的结合能力（k′=3.57），表现出了印迹效应。
3.1.1 p(maa)的分子识别性质 选择邻苯二胺（o-pd）、对氨基苯甲酸（p-aba）、1-萘胺（1-na）和甲氧氯普胺（mp）为p-pd的结构类似物，分别进行了色谱保留实验。采用印迹因子（if）和选择性因子（f）评价模板分子的印迹效率。计算公式：if=k′p/k′bp； f=αp/αbp；式中k′p， αp和k′bp，αbp分别表示组分在印迹和空白聚合物上的容量因子和分离因子。if反映了印迹效应使印迹聚合物对t的亲和能力的提高程度；f反映了印迹效应使印迹聚合物对模板分子的选择性的提高程度。以甲醇为流动相，测定了p-pd及其类似物在p(maa)和bp(maa)上的保留值（表1）。
由表1可见，p-pd的if值最大，说明p(maa)对p-pd产生了印迹效应。由p-pd在p(maa)上的k′和if值远大于各类似物的值可知，p(maa)对p-pd具有良好的特异结合能力。各结构类似物的f值较大，表明由于p-pd的印迹效应，p(maa)对p-pd的选择性识别能力得到了较大提高。实验的
表1 p-pd及其结构类似物在p(maa)和bp(maa)上的保留（略）
table 1 retentin of p-pd and its analogues on p(maa) and bp(maa)
流动相(ｍobile phase)：ch3oh；流速(ｆlow rate)： 0.8 ml/min；if=k′p(maa)/k′bp(maa)； f=αp(maa)/αbp(maa)。maa：methacrylic acid；aba：aminobenzoic acid.
化合物中，除了p-pd外，mp在p(maa)上的k′值最大，这主要是由于mp的碱性最强（比p-pd强），mp与p(maa)的非特异性结合最大（这可由mp在bp(maa)和p(maa)上的k′值相近得到说明）。由于mp的分子较大，难以进入p-pd的印迹空穴中，因此，其if接近1。说明在p(maa)中存在与p-pd分子大小互补的印迹空穴。
考察了流动相甲醇中加入少量hac对p(maa)结合能力的影响。实验发现，当hac含量为0.6%时，p(maa)对p-pd基本不再保留。这是由于hac能与p-pd竞争结合p(maa)上的羧基基团的缘故。这表明静电作用在p(maa)的分子识别过程中起重要作用。
3.1.2 混合物溶液在p(maa)柱上的色谱分离 为了直观反映印迹效应使p(maa)对p-pd选择性和亲和力的提高，分别用p(maa)和bp(maa)为色谱柱填料的印迹柱和空白柱，对p-pd＋o-pd和p-pd＋p-aba进行了色谱分离（图1和图2）。图1是p-pd及o-pd混合物的甲醇溶液在bp(maa)和p(maa)上分离的色谱图。由图1可见，在bp(maa)上只出现了一个宽峰，此二组分在bp(maa)上不能分离；而在p(maa)上，二者接近基线分离。实验结果表明，由于p-pd的印迹效应，在p(maa)中存在与p-pd功能基团及空间结构相匹配的印迹空穴，能选择性结合p-pd，对p-pd具有很好的分子识别能力，可区分苯环上不同位置的氨基。
图1 p-pd(0.1 mmol/l)和o-pd(0.1 mmol/l)混合物溶液在bp(maa)柱(a)和p(maa)柱(b)上的色谱图（略）
fig.1 chromatograms of mixture of p-pd(0.1mmol/l) and o-pd(0.1mmol/l) on bp(maa) column(a) and p(maa) column (b)
流动相(mobile phase)： ch3oh；流速(flow rate)： 0.8 ml/min；检测波长(detection wavelength)： 251 nm；样品体积(sample volume)： 20 μl。
图2 p-pd(0.1 mmol/l)和p-aba(0.1 mmol/l)混合物溶液在bp(maa)柱(a)和p(maa)柱(b)上的色谱图（略）
fig.2 chromatograms of mixture of p-pd(0.1 mmol/l) and p-aba(0.1mmol/l) on bp(maa) column(a) and p(maa) column(b)
实验条件同图1（experimental conditions are the same as in fig.1）。
图2是p-pd和p-aba混合物的甲醇溶液在bp(maa)和p(maa)上分离的色谱图。由图2可知，p-pd和p-aba在bp（maa）上不能分离；但在p(maa)上，二者几乎达到了基线分离。由于p-pd的印迹效应，p(maa)对p-pd具有特异结合能力，能够实现p-pd及其结构类似物的色谱分离。
3.2 模板分子与功能单体相互作用的研究
3.2.1 紫外光谱法研究相互作用 uv光谱法常用于模板分子与功能单体相互作用的研究[12]。通过比较模板分子溶液中加入功能单体后，其uv光谱的变化情况，可判断不同功能单体与模板分子作用的强弱。实验时，固定p-pd的浓度，按照预聚合反应物溶液中模板分子与功能单体的浓度比，配制模板分子与功能单体混合溶液，以相应浓度功能单体的乙腈溶液为参比，绘制了p-pd、p-pd-maa和p-pd-aa乙腈溶液体系的uv光谱（图3）。
图3 不同功能单体对p-pd紫外光谱的影响（略）
fig.3 influence of different monomers on uv absorption spectra of p-pd
cp-pd=0.1 mmol/l；caa=cmaa=0.4 mmol/l；1.p-pd；2.p-pd+acrylamide(aa)；3.p-pd+maa.
由图3可见，p-pd乙腈溶液有3个紫外吸收峰，分别位于206，251和321 nm。当加入相同浓度的maa或aa后，p-pd对应的3个吸收峰强度均有所降低，且加入maa后吸光度降低程度较大。这表明maa与p-pd之间产生了更强的作用，maa与p-pd能生成更稳定的复合物。由此可以推断：与aa相比，maa作为功能单体应更有利于得到对p-pd有高选择性的印迹聚合物。uv光谱的实验结果支持前述色谱法的表征结果。实验还发现，固定p-pd的浓度为0.1 mmol/l，当maa的浓度为0.4 mol/l时，吸收峰强度降到最低；当maa的浓度继续增加时，吸收峰的强度会随之升高。可以推测，由于maa本身形成分子间氢键的能力随其浓度的升高而增强，导致了maa与p-pd之间的相互作用减弱，从而呈现上述变化。对于本身能形成分子间氢键的功能单体，由于功能单体本身的分子间氢键作用与功能单体和模板分子之间的相互作用存在竞争，如果功能单体加入过多，会降低功能单体-模板分子复合物的稳定性，不利于得到高选择性印迹聚合物。此外，当[功能单体]/[模板分子]值过高时，mip中存在大量随意分布的功能单体，产生较多无选择性的位点，会降低印迹聚合物的印迹效率[13]。因此，在制备印迹聚合物时，为了得到选择性高的mip，[功能单体]/[模板分子]值应适宜。
图4 不同p-pd乙腈溶液体系的荧光光谱（略）
fig.4 fluorescence spectra of various p-pd systems in mecn solutions
cp-pd=0.1 mmol/l；caa=cmaa=0.4 mmol/l；λex=258 nm；1.p-pd；2.p-pd+aa；3.p-pd+maa；4.maa；5.aa.
3.2.2 荧光光谱法研究相互作用 基于p-pd能发射荧光的性质[14]，采用荧光光谱法对p-pd与maa和aa的作用进行了研究。测定时，固定p-pd乙腈溶液的浓度，固定激发波长为258 nm，不同体系的荧光光谱如图4所示。
由图4可知，p-pd在391 nm处有荧光发射峰。当加入maa或aa后，体系的荧光强度均有所降低，说明p-pd与maa及aa均发生了作用。扣除maa或aa发射的背景荧光，可反映出maa和aa对p-pd荧光光谱的实际影响程度。显然，加入maa后，p-pd的峰强度下降程度会更大，这与uv光谱法的测定结果一致，即p-pd与maa的作用更强。对于能发射荧光的模板分子，用荧光光谱法研究其与不同功能单体的作用情况，简便、灵敏，是一种筛选功能单体的可行方法。
上述uv光谱和荧光光谱测定结果均证明，p-pd与maa的作用较之与aa的作用更强，即在实验条件下，p-pd与maa通过静电作用形成了更稳定的复合物。因此，p(maa)具有更好的印迹效果，对p-pd显示了良好的分子识别能力。
3.2.3 理论计算法研究相互作用 计算机模拟量化计算法已用于mip的研究。chianella等[15]通过计算机模拟，从包含多个功能单体的虚拟库中成功筛选了功能单体，并制备出了对模板分子有高选择性的mip。孙宝维等[9]采用pm3计算方法，探讨了模板分子-功能单体复合物的结合能与容量因子之间的相关性。本研究采用hf/6-31g*计算方法，研究了p-pd与maa及aa之间的相互作用，计算得到复合物的稳定构象如图5所示。
图5 p-pd与maa及aa形成复合物的构象（略）
fig.5 conformations of the complexes formed between p-pd and maa or aa
由各组分的稳定构象，计算得到各复合物的结合能δe（表2）。表中δezp为经零点能校正的结合能。从表2中δezp的数据可知，p-pd与maa的结合能较之与aa的大，即p-pd-maa复合物较p-pd-aa复合物更稳定。计算法所得结果与光谱法实验结果一致。
表2 各稳定构象体系的能量e和结合能δezp（略）
table 2 energies(e) of various stable conformation systems and their binding energies (δezp)
3.3 分子印迹及识别机理
p-pd是有机碱，在预组装过程中，其芳环两端的nh2可以和酸性功能单体maa的cooh通过静电作用结合，形成稳定的p-pd-maa复合物，加入交联剂并引发聚合后，复合物被固定在聚合物骨架上，洗掉p-pd后，聚合物母体中留下了空间形状及基团排布与p-pd互补的立体空穴，此空穴的三维形状与其中的作用位点协同影响p(maa)的分子识别特性。
【参考文献】
１ vlatakis g，andersson l i，müller r，mosbach k.nature，1993，361(6413)：645~647
２ lai jia-ping（赖家平），he xi-wen（何锡文），guo hong-sheng（郭洪声），liang hong（梁 宏）.chinese j.anal.chem.（分析化学），2001，29(7)：836~844
３ sellergren b.j.chromatogr.a，2001，906(1/2)：227~252
４ hillberg a l，brain k r，allender c j.advanced drug delivery reviews，2005，57：1875~1889
５ tamayo f g，turiel e，martín-esteban a.j.chromatogr.a，2007，1152(1/2)：32~40
６ zhou yuan-yuan（周媛媛），meng zi-hui（孟子晖），dong mei-ling（董美伶）.chinese j.chromatogr.（色谱），2009 ，27(3)：359~363
７ xiao zi-ying（肖子英）.china cosmetics review（中国化妆品（行业）），2007，(9)：90~93
８ karim k，breton f，rouillon r，piletska e v，guerreiro a，chianella i，piletsky s a.advanced drug delivery reviews， 2005，57(12)：1795~1808
９ sun bao-wei（孙宝维），wu li-qing（武利庆），li yuan-zong（李元宗）.acta chim.sinica（化学学报），2004， 62(6)：598~602
１０ luo ming-dao（罗明道），yan xiao-ci（颜肖慈），ouyang li（欧阳礼）.principles of quantum chemistry and their applications（量子化学原理及其应用）. wuhan（武汉）：wuhan university press（武汉大学出版社），1999： 230~242
