【摘要】 hcn4基因编码超级化激活阳离子电流（if）通道结构蛋白，具有调节心脏起搏的功能，心脏上注射hcn4基因转染的心肌细胞可以起到生物起搏作用。hcn4与各种心律失常关系密切，家族性窦性心动过缓等遗传性心律失常患者 hcn4基因外显子碱基的缺失或颠换突变导致hcn4通道蛋白的改变，引起if幅度减少，属于常染色体显性遗传。心力衰竭、心肌肥厚、心房颤动等获得性心律失常患者hcn4基因的表达上调，可以使if增大，导致心律失常发生。
【关键词】 hcn4基因；心律失常；心脏起搏机制
hcn4基因属于超级化激活环核苷酸门控阳离子通道基因家族（hcn），参与编码超极化激活阳离子电流（if）通道结构蛋白，是心脏动作电位的缓慢的舒张期自动去极化激活的一个重要组成部分，参与窦房结细胞自发性舒张期膜去极化过程，具有调控起搏的功能。1999年 ludweding等［1］在筛查cdna文库时，通过探针发现hcn4基因的cdna。随后，seifert等［2］从人类丘脑cdna文库中使用pcr技术和重组体质粒构建成功克隆出hcn4基因。2003年，seifert等［3］又通过原位杂交和免疫组织化学分析，发现hcn4基因在发育中的胚胎心脏上高表达。hcn4基因突变可能与病态窦房结综合征（sick sinus syndrome;sss）,心房颤动（atrial fibrillation, af）的多种心律失常相关。Www.133229.CoM现笔者就hcn4基因的结构功能、心脏起搏机制及其与多种心律失常发生发展关系的最新进展做一综述。
1hcn4基因及其蛋白的结构特点
1.1 hcn4基因的定位与结构
hcn4基因位于人染色体15q23q24，全长5065bp,含有8个外显子，分子量为129.1kda［4］。hcn4基因cdna的全长为6.8kb，有1个序列标签位点（sts）。hcn4基因3’末端的未翻译区长度为2.6kb，具有特征性的限制区域和碱基序列。5’末端的转录序列中有相当高的gc含量（77%），其周围有一个明显的gpc岛，这反映出hcn4蛋白n端可大量出现脯氨酸和甘氨酸的氨基酸残基。northern杂交和pcr分析表明，hcn4基因主要在心室及心房表达。
1.2 hcn4蛋白的结构
hcn4基因的编码产物hcn4蛋白是由1203个氨基酸组成，包含6个跨膜片段(s1 s6 )，一个孔道区以及一个环核苷酸结合域（cnbd）。其中s4片段有一群带正电荷的氨基酸 ,具有电压感受器作用 ,类似于在去极化激活的电压门控 k+通道中的作用。hcn4通道的激活元件包括s1,s1s2的联结子，s2及s6的c末端区域［5，6］。位于 s5和 s6间的一段氨基酸序列部分贯穿细胞膜内 ,是形成亲水性孔道而使离子选择性通过的部分 ,称为孔道区(pore region)或 p区 ,有大多数k+选择性通道所特有的 gyg标志序列。不过除gyg标志之外的氨基酸序列和 k+选择性通道是不一样的 ,是造成对 k+选择性低的原因。hcn通道还表现出与环腺苷酸门控通道的高度同源性 ,即在 c末端存在一个120个氨基酸的 cnbd ,它的作用是调节通道对camp反应［7］。将 cnbd切除后可模拟 camp效应 ,即 hcn门控的电压依赖性被移向更正的电压水平 ,其幅度类似于camp饱和浓度时的最大效应。hcn4基因的转录产物可在大脑、心脏和睾丸中表达。
2hcn4基因的功能及其心脏起搏机制
2.1 hcn家族基因产物的功能
hcn通道属于电压门控阳离子通道超家族，hcn家族的基因产物hcn1、hcn2、hcn3、hcn4，是“特种电流”（funny current,if）通道的分子组成元件；if是心脏起搏电流，并间接起到调控心率自发递质活动的作用。尽管hcn4个家族成员大约60%基因序列相同，但他们的生物学功能各不相同［8-10］：hcn通道在神经细胞和心肌细胞中均被发现。hcn基因家族的 4个成员在心脏中存在的有3个 ,即 hcn1、hcn2和 hcn4。hcn2主要作用在于维持起搏节律的稳定。hcn4主要作用是使起搏的频率维持在一定水平以上并随着机体不同的生理状态而对频率进行调整。有研究发现在兔窦房结的某些单个细胞有 hcn1基因的表达 ,证实心肌细胞上存在 hcn通道蛋白。hcn1和hcn2及 hcn4分别组装形成的异源多聚体 ,这可能提供一个具有稍快起搏电流的中心细胞 ,这些细胞将具有比周围细胞稍快的搏动频率 ,这是真正心脏起搏点的重要特征。hcn3主要分布于神经纤维上 ,在心房肌组织上则以 hcn2和 hcn4亚型表达为主，在窦房结细胞中hcn4是最主要的hcn亚型。ishii 、stieber等［3，11］对部分心肌组织中 2种亚型对起搏通道的贡献的比较,认为起搏通道由单独的hcn2或 hcn4亚型组成 ,即起搏通道的同源构成学说 ,但也有报道起搏通道由 hcn2和hcn4共同组成 ,为起搏通道的异源构成学说。notomi 、shigemoto等［12］也在实验中发现，在大脑，hcn家族的4中亚型均被检测到，但是各个不同的hcn亚型通道的mrnas的表达水平和分布情况却截然不同。hcn2是最丰富的神经通道，在大脑中可以普遍找到。与此对照的是，hcn1和hcn4在特定的区域表达量高：hcn4主要在丘脑表达，hcn1主要在海马表达。hcn3在大脑的大部分地方的表达量低，但是在嗅球和下丘脑的一些核团表达量较高。hcn通道也在肾脏和外周神经元，例如脊神经根等处表达。基因敲除显示：hcn2的缺失可以出现窦性心律失常和癫痫［13］，hcn1的缺失可以出现运动神经学习和记忆的障碍［14］，hcn4的突变已经在病人中发现表现为自发性窦房结功能失常［15，16］。
2.2 hcn4的心脏起搏机制
hcn4在窦房结细胞的舒张期去极化中起到重要作用。hcn4阳离子通道是六个跨膜超级家族之一［6，17］。通过对人胚胎肾293（hek293）细胞的研究，hcn4在hek293细胞比心肌细胞的激活阈值更低。与其他电压门控通道相比，hcn4通道在超级化时开放，在正电位时关闭。hcn4的平均激活曲线的半最大电压为-72.5mv，环核苷酸camp和cgmp通过使通道的激活曲线向更高的正电位转移11mv从而提高hcn4通道的活动性。if最为人所知的作用是通过在窦房结的产生的起搏电流控制心脏的心率和节律［18］。if在紧随动作电位终止的细胞膜超级化时激活，并产生一个使细胞膜缓慢去极化的内向na+电流。此时，窦房结细胞交感神经刺激将升高camp的水平和增加if，从而加速舒张期去极化和心率。相反，毒蕈碱样乙酰胆碱受体兴奋降低camp的水平和减少if，使心率减缓。在窦房结，hcn4通道的激活产生一个内向的阳离子电流if，他可以重复的使起搏点电位从70mv向-40mv去极化，最终导致动作电位的发生。王泽文等［19］的实验结果表明，hcn4基因修饰大鼠间充质干细胞心脏起搏样细胞具有窦房结细胞类似的动作电位。steiber等［3］的实验研究结果表明，hcn4+/-的小鼠是能存活的，能够正常喂养，与正常的小鼠无区别。但是，hcn4-/-的小鼠胚胎在胚胎期的9.5天时死亡。可见，心脏hcn4基因的特定缺失会造成与普遍缺失一样的胚胎致死率。hcn4基因缺失的胚胎比正常的胚胎心率慢，同时心脏上没有产生动作电位的成熟的起搏点，心率和动作电位不能通过camp水平升高而增加。steiber等［3］推断hcn4基因在新生儿窦房结中对起搏电位的产生起着至关重要的作用。qu j等［20］以腺病毒为载体将鼠hcn4（mhcn4）直接注射入狗左心耳根部，同时右心房缝一参考电极，3-4天后，迷走神经刺激抑制窦性节律，显示左心房部位有异位起搏点产生，增加刺激亦可抑制该起搏点，对离子通道进一步研究发现，在没有表达 hcn4基因的细胞 if为 7±4pa(电压-130mv时)，而表达有 mhcn4基因的心房肌细胞起搏电流增大 500倍以上，在电压-125mv时电流达 3823±713pa，阈值约为-75mv，平均最大半激活电压为-95.2±0.4mv，而膜电容在两组没区别。在另一个实验中,研究小组通过导管将 mhcn2注入狗的左前分支上，在注射点形成较快的逸搏心率,提示在哺乳动物心肌细胞转染编码起搏电流的 hcn基因可以形成有效的生物起搏［21］。这些研究均提示hcn4基因具有特征性的表达模式和缓慢门控作用，参与控制心脏起搏细胞的节律性活动。
3 hcn4基因与心律失常发生的相关性
3.1hcn4与遗传性心律失常
在hcn4与各种心律失常的关系中，研究的最早、最多的当属其与遗传性心律失常发生发展的关系。ueda等［16］分析了6名窦房结功能障碍患者，3名进展性心脏传导阻滞患者和14名自发性的心室颤动患者的hcn4基因，发现这些患者6个已知的离子通道出现阴性突变。同时，ueda等通过对一名43岁病态窦房结综合症的女性患者研究，鉴定出hcn4基因第5个外显子的一个ga转换的杂合现象，导致了核跨膜区域和环核苷酸连接区域的联结部位的一个保守残基asp553asn（d553n）的替换。这名患者的姐姐和儿子也患有同种疾病，而在他们的hcn4基因也发现突变的杂合现象，但是在对照组380组染色体中未发现的突变。体外分析提示因为一个显性负相型的hcn4通道运输障碍，出现膜表达下降和if减低。该实验研究结果表明转染的cos7细胞中突变通道的共表达通过显性负相方式减少细胞表面正常通道，同时膜片钳检测证实伴有if幅度的减低。
milanesi等［22］发现窦性心动过缓与hcn4离子通道的编码基因突变相关。窦房结的起搏通道自动产生电流和间接调控camp依赖的心率自动调节。与心动过缓相关的突变发生在靠近camp结合处的部位，功能分析表明突变的通道正常回应camp，与正常的通道相比在一个更负的电位激活。这些变化类似模仿轻微的迷走神经刺激，通过减少内向的舒张期电流而减慢心率。因此，减少起搏通道的作用而导致家族性心动过缓。milanesi等筛查了52名心脏起搏点hcn4基因编码区突变的窦性心动过缓患者。他们鉴定出一个患有无症状性窦性心动过缓的意大利家庭（心率43次/分），携带一个hcn4基因第7个外显子ser672 到arg (s672r)的错意突变，而这个突变是由于第2016个核苷酸ca的颠换所引起。然后，他们对这个家族所有27名成员的dna进行检查，pcrsscp分析表明所有心动过缓表型中有s672r突变的共分离，这个结果提示该突变为常染色体显性遗传。出现基因突变的家族成员的心率范围为43次/分至60次/分，而正常基因的家族成员的心律范围为64次/分至81次/分，同时计算出hcn4基因与窦性心动过缓的最大优势对数评分为5.47。
nof等［23］对一个有8名患有无症状的窦性心动过缓的患者的四世同堂的家庭的鉴定中检测出一个hcn4基因第4个外显子的1439gc的杂合现象，碱基的颠换导致跨膜核成型区域gly480arg(g480r)保守残基替换。这个突变在8个未受影响的家族成员和100个不相关的对照基因中未发现。基因功能分析表明突变通道的电压激活比正常通道低；基因表达分析表明与正常通道相比，突变通道出现合成和运输的障碍。
schulzebahr等［15］对一名66岁具有晕厥症状的典型窦性心动过缓和间歇性心房颤动的老年女性患者的鉴定中发现hcn4基因第5个外显子有一个1bp的缺失(1631缺c)的杂合现象，碱基的缺失引起密码子573框移导致从而导致c端环核苷酸连接区域的蛋白缩短。这个突变在其3个未患病的孩子及对照组362对染色体中未发现。cos7细胞的膜片钳实验表明突变通道介导的if对细胞camp水平升高不敏感；共同表达研究表明hcn4基因的突变可以导致显性负相效应。
以上研究均表明，hcn4基因与遗传性心律失常，尤其是家族性窦性心动过缓的发生发展密切相关。外显子碱基的缺失或颠换而导致的杂合现象是hcn4基因突变的主要机制，同时hcn4基因突变符合常染色体显性遗传。
3.2 hcn4与获得性心律失常
robinson rb［17］等研究指出，高血压大鼠和心力衰竭病人的心室肌上有if的明显变化。在老年自发性高血压大鼠 if 增大，用血管紧张素ii at1受体阻断剂罗沙坦可降低增大的if电导。在β2肾上腺能过表达的老年小鼠，伴随心肌肥厚心室的 if 增大5倍，同时有 hcn 4基因上调优势表达。michels等［24］的实验研究结果表明，通过单通道分析hcn4基因和if，单通道hcn4基因阈电位比hcn家族多种亚型共存在细胞膜上多通道作用时阈电位高。这个观察结果支持一种假设if在心力衰竭、心肌肥厚和心房颤动等这些获得性心律失常存在时的过度表达导致心律失常的发生，同时提示特定if阻滞剂的电位治疗作用可以改变疾病病理变化过程。故hcn4基因在获得性心律失常的发生中可能是一个关键性的起搏通道基因，且其致病机制为hcn4基因表达上调和if的增大。
4 结束语
hcn4基因作为一种新近发现的编码心脏if的通道基因，关于其突变机制、心脏起搏机制及其与心律失常关系的研究正在不断深入。目前，研究较多的仍是hcn4基因心脏起搏机制及其与窦房结功能障碍的关系，尤其是家族性窦性心动过缓已表现出hcn4基因突变缺失或颠换常染色体显性遗传的特征。同时越来越多的研究已经揭示该基因在多种心律失常的发生、发展和预后及生物起搏等方面都发挥了举足轻重的作用。
hcn4基因与其他一些心律失常如风湿性心脏病心房颤动等的研究也正在继续，我们需要更多的实验数据来阐明其发生机制。通过对其结构功能研究，可以得知hcn4自然发生突变是如何影响if通道功能，将为心律失常的诊断和治疗的提供理论基础。
【参考文献】
1 ludwig a, zong x, stieber j, et al. two pacemaker channels from human heart with profoundly different activation kinetics[j]. embo, 1999, 18（23）: 2323-2329.
2 seifert r,scholten a, gauss r, et al. molecular characterization of a slowly gating human hyperpolarizationactivated channel predominantly expressed in thalamus, heart, and testis[j]. proc natl acad sci, 1999, 96: 9391-9396.
3 stieber j, herrmann s, feil s, et al. the hyperpolarizationactivated channel hcn4 is required for the generation of pacemaker action potentials in the embryonic heart[j]. proc natl acad sci, 2003, 100: 15235-15240.
4 hofmann f, biel m, kuapp ub. international union of pharmacology. li. nomenclature and structurefunction relationships of cyclic nucleotideregulated channels[j].pharmacol rev, 2005, 57（4）: 455-462.
5 ishii t m, takano m, ohmori h,et al. determinants of activation kinetics in mammalian hyperpolarizationactivated cation channels[j].j gen physiol 2001, 53(1): 93-100.
6 wang j, chen s, siegelbaum s. regulation of hyperpolarizationactivated hcn channel gating and camp modulation due to interactions of cooh terminus and core[j].transmembrane regions. j gen physiol, 2001,118（2）: 237-250.
7 gauss r, seifertr, kaupp ub, et al. molecular identification of a hyperpolarization activated channel in sea urchin sperm[j]. nature, 1998, 393（4）:583-587.
8 biel m, schneider a, wahl c, et al. cardiac hcn channels: structure, function and modulation[j]. trends cardiovasc med, 2002, 12（2）: 206-212.
9 ludwig a, zong x, jeglitsch m, et al. a family of hyperpolarization activated mammalian cation channels[j]. nature, 1998, 393（4）:587-591.
10 santoro b, liu dt, yao h, et al. identification of a gene encoding a hyperpolarization activated pacemakerchannel of brain[j]. cell, 1998, 93（5）:717-729.
11 ishii tm, takano m, xie lh, et al. molecular characterization of the hyperpolarizationactivated cation channel in rabbit heart sinoatrial node[j].j biol chem,1999, 274（4）:12835-12839.
12 notomi t, shigemoto r, et al. immunohistochemical localization of ih channel subunits, hcn1 4, in the rat brain[j]. j comp neurol, 2004, 471（2）: 241-276.
13 ludwig a, budde t, stieber j, et al. absence epilepsy and sinus dysrhythmia in mice lacking the pacemaker channel hcn2[j]. embo j, 2003, 22（2）:216-224.
14 nolan mf, malleret g, lee kh, et al. the hyperpolarization activated hcn1 channel is important for motor learning and neuronal integration by cerebellar purkinje cells[j]. cell, 2003, 115（4）: 551-564.
15 schulzebahr e, neu a, friederich p, et al. pacemaker channel dysfunction in a patient with sinus node disease[j]. j clin invest, 2003, 111（11）,1537-1545.
16 ueda k, nakamura k, hayashi t, et al. functional characterization of a trafickingdefective hcn4 mutation, d553n, associated with cardiac arrhythmia[j]. j biol chem, 2004, 279, 27194-27198.
17 robinson rb, siegelbaum sa, et al. hyperpolarizationactivated cation currents: from molecules to physiological function[j]. annu rev physiol, 2003, 65（4）:453-480.
18 stieber j, hofmann f, ludwig a, et al. pacemaker channels and sinus node arrhythmia. trends cardiovasc med, 2004, 14（1）: 23-28.
19 王泽文,宋治远,姚青. hcn基因修饰大鼠mscs体外诱导获得的心脏起搏样细胞动作电位检测[j].第三军医大学学报, 2007, 29(22): 2139-2141.
20 qu j, plotnikov an, danilop jr, et al. expression snd function of a biological pacemaker in canine heart [j]. circulation, 2003, 107(8):1106-1109.
21 plotnikov an, sosunov ea, qu j, et al. biological pacemaker implanted in canine left bundle branch provides ventricular escape rhythms that have physiologically acceptable rates [j]. circulation, 2004, 109(4):506-512.
22 milanesi r, baruscotti m, gnecchiruscone t, et al. familial sinus bradycardia associated with a mutation in the cardiac pacemaker channel[j]. new eng j med, 2006, 354（1）:151-157.
