CTLA4基因多态性与特发性扩张型心肌病

【摘要】 目的：包括细胞和体液免疫在内的自身免疫机制至少参与了部分特发性扩张型心肌病（idiopathic dilated cardiomyopathy, idc）患者的发病，且前者介导的心肌损害在idc中更重要。ctla4是特异性细胞免疫的负性调节因子。本研究旨在探讨ctla4基因启动子-318c/t、外显子a/g多态性及3′非翻译区（at）n微卫星多态性与idc及血清可溶性ctla4(sctla4)水平的相关性。方法：采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphisms, pcrrflp)方法分析黑龙江省无血缘关系汉族人群（包括72例idc患者，100例正常健康人）ctla4基因-318c/t、49位点a/g多态性及3′微卫星多态性；elisa法检测血清sctla4水平。综合分析ctla4基因型频率、等位基因频率与idc及sctla4水平的相关性。结果：idc组外显子1 gg基因型和g等位基因频率显著高于正常对照组（p=0.012，p=0.008）；3′非翻译区共发现18种等位基因，106 bp等位基因频率在idc患者中显著增高（22.22% vs 1%，p=0.000 2，or=23.56，95%ci：9.65～83.74）；两组间-318c/t多态性分布无统计学差异。与对照组相比，idc组sctla4水平显著升高［（1.87±1.06）μg/l比（0.54±0.19）μg/l，p＜0.05］；直线回归分析显示，idc组gg基因型及g等位基因频率与血清sctla4水平（r=0.57，p=0.021）显著相关,而aa、a/g基因型及a等位基因频率与sctla4水平无相关性。wWW.133229.Com启动子318c/t多态性及3′非翻译区（at）n微卫星多态性与sctla4水平的亦无相关性。结论：ctla4基因外显子1 a49→g变异与idc相关，携带g等位基因者易患idc，其机制可能为该多态性造成ctla4信号肽中编码苏氨酸和甘氨酸的替换，从而影响蛋白翻译后加工、修饰，使sctla4功能发生变化。提示3′末端非翻译区（at）n重复序列中106 bp等位基因可能是idc的易感基因。

【关键词】 特发性扩张型心肌病 ctla4 限制性片段长度多态性 自身免疫

　　relationship of ctla4 polymorphisms with susceptibility for idiopathic dilated cardiomyopathy

　　liu ying，liu wei，li weimin, li yue, kong yihui, gan runtao, wang zheng, fan ying, geng jianqiang, shao qun, zhang mei, gao cheng, wang xiurong.

　　department of clinical laboratory cardiology, the fourth affiliated hospital, harbin medical university, heilongjiang 150001, china

　　［abstract］ objective:autoimmune mechanisms, including cellular and humoral immune, are likely to participate in the pathogenesis of at least a subgroup of idiopathic dilated cardiomyopathy(idc), in which cellular immunemediated one plays a more important role. cytotoxic t lymphocyte associated antigen4(ctla4) is the major negative regulatory factor of cellular immunity. this study was conducted to investigate the association of ctla4 gene promoter -318c/t polymorphism, exon 1 a/g polymorphism and 3′ untranslated region microsatellite polymorphism with susceptibility to idc in han chinese.methods:polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphisms(pcrrflp) techniques were used to analyze the polymorphisms of ctla4 promoter -318, exon 1 a/g and 3′ untranslated region in the unrelated han ethnic population in heilongjiang province(including 72 idc patients and 100 normal controls). serum sctla4 was tested by elisa. the relationship of ctla4 genotype and alleles frequencies with sctla4 was evaluated by linear regression analysis.results:compared with controls, the frequencies of gg genotype(0.604 2 and 0.739 6, p=0.012) and the g allele(0.360 0 and 0.560 0, p=0.008) were significantly increased in patients with idc. increased serum sctla4 was found in the idc group compared with the controls［(1.87±1.06)μg/l vs (0.54±0.19)μg/l, p＜0.05］. eighteen alleles of ctla4 microsatellite were found in idc patients and healthy individuals. long allele, 106 bp was apparently increased in patients with idc compared with healthy controls(22.22% vs 1%, p=0.000 2, or=23.56, 95%ci: 9.6583.74). linear regression analysis manifested a significant interrelationship between the gg genotype, g allele frequencies and serum sctla4(r=0.57, p=0.021).conclusion:ctla4 gene exon 1 a49→g substitution is associated with an increased idc risk, and “g” allele carriers had significantly increased idc risk, which implicated that the ctla4 gene exon 1 may have a significant role in idc, possibly via a thr→ala change in ctla4 signal peptide，which influences the synthesis and modification processes, with a result of functional change of sctla4.

　　［key words］ idiopathic dilated cardiomyopathy；ctla4；restriction fragment length polymorphism；autoimmune

　　特发性扩张型心肌病（idiopathic dilated cardiomyopathy, idc）是以左心室或双心室扩大伴收缩功能障碍的原因不明性心肌疾病，是年轻患者发生心律失常、心力衰竭及猝死的主要原因。除遗传易感性和嗜心肌病毒感染外，针对心肌组织的自身免疫应答在idc发病中起重要作用。研究表明，心肌炎和idc可能分别代表心肌特异性自身免疫病的急性和慢性阶段［1］。急性阶段的心肌局限性损害使部分患者在几年潜伏期后，出现左室功能广泛受损，此时虽不能检出病毒颗粒，但自身免疫应答造成了未感染心肌细胞非选择性溶解。其中，t淋巴细胞过度活化是idc弥漫性心功受损的关键环节。定位于染色体2q33的细胞毒性t细胞相关抗原4（cytotoxic t lymphocyte associated antigen 4, ctla4）基因变异或表达障碍可减弱对t细胞活化的抑制作用，导致自身免疫性心肌损伤。ctla4基因多态性可从基因表达调控水平影响ctla4蛋白功能，因而与多种自身免疫性疾病相关［2］。本研究采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphisms, pcrrflp）方法分析ctla4基因启动子-318位点c/t多态性、外显子1第49位点a/g多态性及3′非翻译区（at）n微卫星多态性，并探讨其与idc易感性及血清可溶性ctla4（sctla4）水平相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 病例取自2001年9月至2004年9月哈医大一院心内科住院的idc患者72例（男51例，女21例），诊断依据1995年世界卫生组织及国际心脏病学联合会（who/isfc）标准（idc组）；以100名体检健康人（男66例，女34例）为正常对照。两组间年龄、性别构成具有可比性。所有对象均为中国黑龙江省无血缘关系的汉族人群。有大量饮酒史、陈旧性心肌梗死史及克山病、糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、sle、ra、骨骼肌病等系统性疾病者未入选。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 所有研究对象9∶00～11∶00以trank 303肝素真空采血管采集空腹静脉血5 ml，离心分离血清。elisa法测定血清sctla4水平，试剂盒购自medsystem公司。指标以复孔测定，取均值为最后结果。

　　1.2.2 提取外周血白细胞基因组dna 采用血液基因组dna提取试剂盒（上海华舜公司）。

　　1.2.3 ctla4基因启动子-318c/t多态性 启动子引物序列：上游5′aaa tga att gga ctg gat ggt3′，下游5′tta cga gaa agg aag ccg tg3′。反应体系25 μl：模板dna 1.0 μl，dntp 0.2 mmol/l，引物0.3 μmol/l，taq dna聚合酶1 u。反应条件：94℃预变性3分钟后，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，35个循环后72℃延伸4分钟。扩增产物为162 bp，2%琼脂糖凝胶电泳检测。rflp 15 μl反应体系中，限制性内切酶mse ⅰ 0.1 u，pcr产物10 μl；37℃水浴2小时，产物于2%琼脂糖凝胶电泳，见三种酶切结果：基因型cc产生226和21 bp两种片段；基因型ct产生226、130、96和21 bp四种片段；基因型tt产生130 、96和21 bp三种片段，其中21 bp片段太小，难以分辨。

　　1.2.4 ctla4基因外显子1a/g多态性 外显子1引物序列：上游5′gct cta ctt cct gaa gac ct3′，下游5′agt ctc act cac ctt tgc ag3′。反应体系及条件同上。rflp 15 μl体系中，含限制性内切酶bbv ⅰ 2 u，pcr产物10 μl；37℃水浴4小时，产物于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见三种酶切结果：aa基因型为162 bp一种片段，ag基因型产生162、88和74 bp三种片段，gg基因型产生88和74 bp两种片段。

　　1.2.5 ctla4基因外显子3′非翻译区（at）n微卫星多态性 上游引物：5′gcc agt gat gct aaa ggt tg3′，下游引物：5′aac ata cgt ggc tct atg ca3′。pcr反应体系同上。反应条件：94℃预变性4分钟，94℃变性40秒，58℃退火50秒，72℃延伸40秒，35个循环后72℃延伸10分钟。扩增产物用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

　　1.2.6 统计学分析 直接计数法计算基因频率和基因型频率，采用χ2检验进行hardyweinberg平衡吻合度检验。以医学统计软件spss 11.0协助处理数据。各参数以x±s表示，计量资料组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，以直线回归分析进行两个资料间相关性分析。p＜0.05为有统计学差异。

　　2 结果

　　2.1 ctla4基因启动子-318c/t多态性 两组间cc、ct、tt基因型及c、t等位基因频率无统计学差异。

　　2.2 外显子1第49位点a/g基因多态性 ctla4基因外显子1全长652 bp，其中45～49位序列为cgtca。当第49位的a突变为g后，bbv ⅰ能够识别并酶切该处，从而形成限制性片段长度多态性。若基因序列为cgtcg，则为gg型；若序列为cgtca/(n)，则为a/g型或aa型。本研究扩增ctla4基因外显子1的pcr产物长度为162 bp，以2%琼脂糖凝胶电泳，见清晰dna条带。基因型分析表明，idc组gg基因型(p=0.012，or=2.282)和等位基因g（p=0.008，or=2.356）频率显著高于正常对照组，见表1。

　　2.3 ctla4外显子3′非翻译区（at）n微卫星多态性 两组ctla4外显子3′非翻译区共检出18种等位基因，idc患者106 bp等位基因频率显著高于正常对照组（22.22% vs 1%，p=0.000 2，or=23.56，95%ci：9.65～83.74），见表2。

　　2.4 idc组较对照组血清sctla4水平升高［（1.87±1.06）μg/l比(0.54±0.19)μg/l，p＜0.05］。

　　表1 ctla4基因外显子1 a/g基因型及等位基因频率分布的比较（略）

　　tab.1 comparison of the a/g genotype and alleles frequencies of ctla4 exon 1

　　note:1) gg genotype p=0.012，or=2.282 vs the control group;2) g allele p=0.008, or=2.356 vs the control group.

　　表2 ctla4微卫星等位基因频率分布（略）

　　tab.2 the frequencies of ctla4 microsatellite polymorphism

　　note:idc.idiopathic dilated cardiomyopathy;ci.confidence interval;or.odds ratio.

　　2.5 两组sctla4水平分别与a/g、c/t基因型及等位基因频率及18种微卫星等位基因作相关性分析 结果显示，idc组sctla4与gg基因型及g等位基因频率呈正相关（r=0.57, p=0.021）；idc组sctla4与aa、ag基因型、a等位基因频率及启动子c/t多态性、3′微卫星多态性无相关性。

　　3 讨论

　　随着越来越多idc患者体内检出特异性抗心肌自身抗体，自身免疫介导性心肌损伤在idc发病及进展中的作用日益受到重视。t细胞是自身免疫应答的主要效应细胞，其活化，需要双信号作用：第一信号为抗原识别；第二信号来自共刺激分子（costimulatory molecule）［3］。后者在t细胞活化中的重要性在于若t细胞识别抗原时无共刺激分子提供第二信号，则t细胞发生凋亡或被诱导呈无能状态（anergy）。t细胞表面cd28与apc表面b7家族成员是对重要的共刺激分子。ctla4是cd28的结构同源物，与cd28竞争性结合b7，从而发挥负性调节作用。ctla4基因敲除的小鼠出现广泛淋巴细胞增生，血清免疫球蛋白异常增高，易患自身免疫病，可见ctla4在调节自身反应性t细胞应答中的重要作用［4］。研究表明，ctla4表达障碍或基因变异可减弱对t细胞活化的抑制作用，导致自身免疫病［5］。

　　ctla4基因多态性从基因表达调控水平影响ctla4功能，因而与多种自身免疫病相关。已发现ctla4基因有3个多态性位点：启动子-318位点c/t多态性；外显子1第17密码子49位点a/g多态性；外显子4的3′非翻译区642位点二核苷酸（at）n微卫星多态性。根据现有资料，ctla4基因多态性的生物学意义为：①ctla4启动子与外显子1多态性可影响ctla4分子表达，当ctla4启动子第318位点为t，外显子1第49位点为a时，细胞表达ctla4水平增高［6］；②ctla4外显子1多态性与ctla4功能相关，ctla4外显子1中g等位基因频率增高时，ctla4的抑制功能降低。本研究中，idc组gg基因型及g等位基因频率显著增高，提示ctla4外显子1第49位点g等位基因可增加患idc的危险性，该基因可能是idc主要候选基因之一，或与其他重要致病基因存在连锁。ctla4基因多态性与idc发病关联的可能机制是：ctla4基因改变，造成t细胞激活后ctla4不能充分表达或发挥其抑制作用，导致自身反应性t细胞过度激活而引发自身免疫性心肌损害。

　　ctla4外显子1 a/g多态性的功能性作用，是在ctla4信号肽中苏氨酸和甘氨酸发生替换，导致成熟ctla4蛋白亚细胞定位的细微改变，或通过影响新生肽与分子伴侣间的相互作用，造成sctla4折叠过程中发生功能变化［7］。本研究发现，idc组gg基因型及g等位基因频率与血清sctla4水平显著相关。表明idc中a/g多态性这种遗传背景可能通过sctla4导致细胞免疫功能紊乱。有报道认为，g等位基因与内质网处理ctla4蛋白相关，使糖基化蛋白的产生及表达降低，从而导致t细胞增殖控制的减弱及ctla4抑制功能降低［5］。

　　1999年magistrelli等［7］首次报道了sctla4。它是ctla4 mrna发生选择性剪接，造成框移，并在转录终止前附加22个氨基酸的可溶性产物。sctla4 mrna组成性表达于未受抗原刺激的t细胞上，t细胞激活后其表达水平发生下调。idc病程中始终存在t细胞激活，理论上推测，idc患者sctla4应降低，但本研究idc组sctla4水平显著增高。结合ctla4外显子1基因多态性分析中，gg基因型及g等位基因频率与血浆sctla4水平显著相关，推测idc患者ctla4基因g49可能使sctla4功能活性发生变异，正常反馈性抑制缺失，t细胞激活后sctla4仍呈高分泌状态。

　　本研究中ctla4基因3′非翻译区106 bp片段与idc显著相关，提示该长片段可能是idc的易感基因。理论上推测，ctla4基因3′非转录区（at）n重复序列不会影响该基因mrna变异，但由于此微卫星多态性与ctla4其他基因多态性存在强烈连锁不平衡，可影响 mrna稳定性，从而可能在蛋白水平影响idc发病和病程。研究发现3′非翻译区（at）n多态重复性可能影响mrna稳定性，因为稳定转录的基因无此长序列at，将野生型兔β球蛋白mrna 3′非翻译区加上51个at序列后会变得极不稳定，但现在无证据表明106 bp等位基因mrna比其他等位基因更不稳定［8］。

　　鉴于ctla4在自身免疫性心肌损伤中的重要调控作用，且idc患者存在ctla4基因多态性，若能通过基因治疗手段对不同基因型患者外源性应用可溶性ctla4或使ctla4表达增强，以选择性阻断t细胞活化的初始阶段，将有可能为idc治疗提供新的思路。
　　

【参考文献】
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　　7 magistrelli g, jeannin p, herbault n et al. a soluble form of ctla4 generated by alternative splicing is expressed by nonstimulated human t cells ［j］. eur j immunol, 1999; 29: 35963602.