【摘要】 目的 探讨hif-1和cox-2在高原重症急性胰腺炎(sap)中的作用以及二者之间的关系，初步探讨高原sap 的发病机制，为更好的诊治sap提供理论基础。方法 将72只spf级健康雄性wistar大鼠随机根据海拔不同分为3个大组(每组24只)，再将每个大组随机分成4个小组(每组6只)。采用向胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠的方法建立sap动物模型。sap组(p组)在造模后的第6、12、24 h分批处死大鼠，假手术组(n组)在造模后6 h处死大鼠，分别测定血清淀粉酶(amy)、胰腺组织缺氧诱导因子(hif-1)和环加氧酶-2(cox-2)含量，观察胰腺组织病理变化并评分。结果 p组各时点的胰腺病理评分及amy、cox-2、hif-1均较n组显著增高(p<0.05)。三个海拔的p组相比，胰腺病理评分及hif-1、cox-2的表达具有显著性差异(p<0.05)。hif-1、cox-2、 he评分呈正相关(p<0.05)。结论 ①hif-1、cox-2在sap的早期即被激活，被激活因子可能在sap的始发阶段起重要作用;② hif-1与cox-2密切关联;③hif-1、cox-2在高原sap的发生发展中起重要作用。
【关键词】 重症急性胰腺炎 高原 缺氧诱导因子-1 环氧合酶-2
severe acute pancreatitis at plateau
an yanming1, wu xinmin1, guo yamin1, zhang xiaofeng2
(1.qinghai province people’s hospital;2.linfen city of shanxi province people's hospital)
abstract objective to investigate the effect of hypoxia-inducible factor-1(hif-1) and cyclooxygenase-2(cox-2) in severe acute pancreatitis (sap) at plateau area and discuss the relationship between hif-1 and cox-2 in order that clarifying the mechanism of sap and providing the basis for treatment of this disease. methods 72 specific pathogen free (spf) wistar male rats were divided into three groups randomly (n=24 in each group). every group was subdivided into four subgroups(n=6 in each group). pancreatitis model was induced by intra-duct administration of 5% natc. the experimental group was treated at 6h, 12h and 24h after natc injection and the sham group at 6th after operation. the contents of amylase in serum, histological scores of pancreatic tissues and the contents of hif-1 and cox-2 in pancreatic were measured respectively. results compared to sham group, serum amylase level，hif-1 and cox-2 in pancreatic tissues and histological scores of pancreatic tissues were significantly increased(p<0.05) in sap group. there was a significant difference (p<0.05) in histological scores, content of hif-1 and cox-2 among three altitude's sap group. there was shown a positive relationship (p<0.05) among histological scores, hif-1 and cox-2. conclusion the expression of hif-1 and cox-2 may play an important role in early stage of sap and the two factors show a positive relationship. hif-1 and cox-2 may closely relate with pathogenesis and prognosis of plateau sap, too.
key words severe acute pancreatitis plateau hypoxia-inducible factor-1 cyclooxygenase-2
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，sap)起病急、进展快、病情危重、并发症多、死亡率高。www.133229.CoM众多学者致力于其发病机制的研究，并不断取得新的进展，但至于具体发病机制仍不明晰。在高原地区的sap由于低氧血症和血液粘稠度增高，致使病情更加严重，治疗更棘手 [1]。因此高原胰腺炎有其自身的特点。对于高原sap发病机制的研究在国外很少，国内尚属空白。
近来的研究认为sap早期即有缺血缺氧情况，并因此发生一系列的病理生理变化，致sap加重，然而这一具体过程如何发生尚未清楚。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,hif-1)作为在缺氧的适应性反应中的核心因子 [2]，最初的研究重点在机体耐受缺氧、维持肿瘤细胞的能量代谢、新血管生成 [3]等方面。随着研究的深入，发现hif-1调节的靶基因数目逐渐增多，对hif-1所发挥的作用认识也逐渐全面。gramer等 [4]人证实了hif-1在炎症中的重要作用。因此，hif-1可能在sap，尤其在高原sap中发挥重要作用。环加氧酶-2(cyclooxygenase-2,cox-2)与炎症关系密切，ethridge等 [5]利用cox-2基因敲除的小鼠来制造sap的动物模型，结果发现胰腺几乎没有炎症改变。本实验通过在不同海拔建立sap动物模型，观察在不同海拔动物sap中的hif-1、cox-2表达水平、血液生化指标和胰腺组织病理变化，旨在探讨hif-1、cox-2在高原sap中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料及试剂
健康雄性spf级wistar大鼠72只，体重(200±20)g，购于甘肃中医学院实验动物中心(动物合格证号：scxk2004-0006)。牛磺胆酸钠(natc)购于意大利inalco spa公司，兔抗大鼠hif-1多克隆抗体、cox-2酶标偶合液、sabc试剂盒、dab显色剂均购于北京博奥森生物公司。
1.2 动物分组
72只大鼠随机分成3个大组：海拔1500 m组(l组)、海拔3300 m组(m组)、海拔4300 m组(h组)。每个大组随机分成4个小组：假手术组(n组)、胰腺炎6 h组(p6h)、胰腺炎12 h组(p12h)、胰腺炎24 h组(p24h)。l组从兰州(海拔1500m)购买回后立即进行造模，其余大鼠送入河卡(海拔3300m)、温泉(海拔4300m)地区习服20天后在当地造模。
1.3 动物模型的制作
各组实验大鼠术前禁食12 h，自由饮水。用1%苯巴比妥钠(4ml/kg)行腹腔注射麻醉。n组大鼠打开腹腔后，仅对胰腺翻动数次后关腹。p组探查到肝总管后，用无创血管夹夹闭。术者右手用4.5 号钝头注射器从十二指肠肠系膜对侧选一无血管区进针，刺穿外侧肠壁，自乳头插入胰胆管，左手轻轻捏住进针处胰胆管，防止针头滑脱。缓慢注入5% natc(1ml/kg)。30 s后可见胰腺充血，拔出针头，松开血管夹，压迫肠管穿刺点5 min后关闭腹腔。n组于造模后6 h全部处死，p组在造模后第6、12、24 h三个时点分批处死。分别自腹主动脉采血;切取胰腺组织。
1.4 测定项目及方法
用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清淀粉酶(amylase ,amy)含量，大鼠胰腺组织常规以苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,he)染色并行光镜观察，然后根据grewal [6]评分标准进行评分(见表1)。应用免疫组化sp法分析各组大鼠胰腺hif-1染色程度，以细胞浆或细胞核有棕黄色颗粒为阳性细胞，否则为阴性，根据牛彦锋 [7] 等评分标准进行评分。取部分胰腺组织匀浆后，用elesa法测定各组大鼠胰腺组织cox-2含量。首先测定出标准浓度值，绘出标准曲线，根据标准曲线计算样本的浓度。cox-2含量标准曲线见图1。
图1 cox-2的标准曲线
表1sap胰腺病变严重程度评分标准(改良grewal法)
组织病变评分标准01234水肿无轻度叶间隙增宽重度叶间隙增宽腺泡间隙增宽细胞间隙增宽坏死面积比无1%～10%11%～20%21%～30%>30%炎症每5个炎症细胞计0.5分，超过30个计4分出血无有出血--- 注：得分=水肿评分+坏死评分+炎症评分+出血评分.
1.5 统计学处理方法
所有数据均用spss11.5统计软件完成，实验数据均以均数±标准差 (x± s)表示。组内及组间比较用one-way anova，并用snk进行两两比较;病理评分及cox-2、hif-1的相关关系采用pearson相关分析。检验水准取α = 0.05。
2 结果
2.1 胰腺组织病理改变及评分结果
n组大鼠基本正常;p6h组胰腺水肿、血管周围有炎性细胞浸润;p12h组腺泡细胞变性、大片出血、腺泡间有炎性细胞浸润;p24h胰腺广泛出血、坏死，胰腺及网膜组织有多处皂化斑。评分统计见表2。表2三组大鼠胰腺he病理评分
2.2 amy检测结果(见表3)表3三组大鼠amy活性(u/l，x±s)注：*表示与n组比较p<0.05;#表示与p6h组比较p<0.05.
2.3 胰腺hif-1含量检测结果
免疫组化染色图显示：n组几乎没有棕黄色颗粒;p6 h组和p12 h组可见部分细胞胞浆有棕黄色颗粒;p24 h组几乎满视野的细胞胞浆内均有棕黄色颗粒，部分细胞核上有棕黄色颗粒。评分统计见表4，免疫组化情况见图2～8。表4三组大鼠胰腺hif-1免疫组化评分注：*表示与n组比较p<0.05;#表示同一海拔内p组各时点两两比较p<0.05;▲表示三个海拔间p组同一时点两两比较p<0.05.
2.4 胰腺cox-2含量检测结果(见表5)表5三组大鼠胰腺cox-2含量注：*表示与n组比较p<0.05;#表示同一海拔内p组各时点两两比较p<0.05;▲表示三个海拔间p组同一时点两两比较p<0.05.
2.5 hif-1、cox-2及病理评分的相关关系
在hp组：① hif-1与病理评分呈正相关关系(r=0.733，p<0.05);②cox-2与病理评分呈正相关关系(r=0.780，p<0.05);③hif-1与cox-2呈正相关关系(r=0.942，p<0.05)。在mp组、lp组大鼠胰腺组织hif-1、cox-2及病理评分三者彼此间都呈正相关关系。
3 讨论
目前公认的sap的始动因素是胰酶的异常激活与释放、胰腺的自身消化 [8,9]，而后引起炎症介质瀑布样级联反应，大量炎症介质进入血流，引发全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrom，sirs)，最终导致其他脏器及全身组织受损。由于在始动因素之后，参与的因子众多，机制复杂，至今sap的发病机制尚未完全阐明，但细胞因子(cytokine,ck)在sap中的重要作用是不容质疑的 [10]。
3.1 hif-1 、cox-2与sap
hif-1是迄今为止发现的惟一一种在缺氧情况下发挥特定作用的转录因子，由120kd的hif-1α亚基和91～94kd的hif-β亚基两个亚单位组成，其中hif-1α则为hif-1所特有 [11]。hif-1α蛋白链c-末端由约200个氨基酸序列构成，被称为氧依赖性降解区(oxygen-dependent degration domain,odd)。odd区内的两个脯氨酸残基pro402和pro564羟基化调节对于vhl表达的pvhl介导的hif-1降解起关键作用，这就需要氧依赖的脯氨酸羟化酶的参与 [12]。脯氨酸残基羟化后，pvhl才能与hif-1α的odd发生相互作用，其功能是作为泛肽配体使得hif-1α泛素化，从而被降解。这个过程依赖hif-1α降解的增加，而不是其转录的减少 [11]。因此，hif-1在常氧及正常生理情况下在人体内的表达量极少。低氧可以减少hif-1α蛋白的降解使hif-1α含量增加，而在某些病理情况下，白细胞介素-1β(interleukin-1β, il-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, tnf-α)等能通过诱导hif-1α表达的增加使hif-1α含量增加 [13]。环加氧酶(cox)又称前列腺素合酶(pgs)，存在“稳定型”(cox-1)和“诱导型”(cox-2)两种异构酶。cox-2基因与cox-1基因明显不同，与cox-2相比，cox-1基因启动子不含众多增强子元件，因此，可诱导性弱。而cox-2基因的启动子则含有许多与转录有关的序列。因而cox-2可被多种刺激因子诱导。cox-2在正常生理情况下仅在肾小球及胃肠粘膜有微量表达，只有在受到刺激后cox-2才大量表达。
现已发现hif-1能够调节vegf、epo、et-1、cox-2及转铁蛋白等60多种靶基因 [14]，其功能也不仅仅限于缺氧调节，在炎症中也有重要作用。cox-2与炎症性疾病关系密切，各种炎性疾病和动物模型的炎性渗出液中均发现cox-2mrna和蛋白表达的增强。cox-2是一种即早基因模式，在炎症早期即被激活，多项研究也证实cox-2是早期炎症阶段较上游的反应酶之一 [15,16] 。hif-1和cox-2在炎症中的作用必然也将出现在sap中。
我们的研究观察到，hif-1、cox-2在正常大鼠胰腺组织几乎没有表达，而在sap组6 h有表达，随后逐渐增高，提示在sap的早期，即有hif-1、cox-2活化。吴浩等 [17]的研究发现，过久的应用抑酶物质，对于sap大鼠病情并无明显改善作用，反而抑制了后期抗炎ck的释放，而致病情加重，说明sap发展至重症阶段，炎症因子的作用已经超过了胰酶的自身消化作用。我们从实验中观察到，在sap组，从6 h到12 h，淀粉酶是持续升高的，而12 h到24 h淀粉酶却没有明显变化;与此同时，12 h到24 h胰腺病理评分不断提高，表明胰腺损害仍在继续;hif-1、cox-2的12 h到24 h的表达量也是持续升高的，且与胰腺病理评分呈正相关关系。提示到了炎症的后期阶段，胰酶的损害已不是主要原因，hif-1起着很重要的作用。这也解释了为什么胰酶的高低并不能完全反映sap的严重程度。
3.2 cox-2与hif-1在sap中的关系
lukiw [18]等研究发现，hif-1表达先于cox-2，推测前者是cox-2表达的调节因子。夏若寒 [19]等人发现在用氯化钴(cocl2)诱导的缺氧时，cox-2的表达是增加的，而加入epo3′-增强子野生片段之后可阻断cox-2的表达增加，而epo3′-增强子野生片段是hif-1的结合序列，从而证明了hif-1和cox-2在缺氧中的联系。他们在随后进一步的研究中发现了cox-2基因序列中含有5′-tacgtgtc-3′片段，而该片段正是hif-1在基因上的结合位点 [20]。我们在实验中观察到，cox-2与hif-1在sap组，从6 h即有升高，并随着时间的延长，表达量持续增加，二者都与胰腺病理评分呈正相关，说明二者都参与了胰腺的继续损害，且都发生在胰腺细胞损伤后的环节。二者都与炎症关系密切，去除其中的任何一个都能在一定程度上阻断炎症的发展。因此我们推断可能存在一条这样的途径：sap时，机体以低氧和非低氧的方式诱导hif-1表达，hif-1活化后作用于cox-2等众多靶基因，使其表达水平上调，这些因子加重了胰腺微循环障碍，促进了全身的炎症反应。
3.3 hif-1、cox-2和高原sap的关系
和其他的sap一样，高原sap的始动因素也应是胰酶的异常激活与释放，但由于明显的低氧血症和血液粘稠度增高，使sap病情更加严重，常早期就出现sirs。高原地区由于气压低，空气氧含量低，人体动脉血pao2普遍较低。低氧还导致红细胞增多、红细胞压积(hct)升高。hct升高与sap关系密切 [21]，红细胞的增多导致血液粘滞度增加，血流阻力加大，使胰腺及其他重要脏器更容易发生微循环障碍，而微循环障碍是sap加重的一个重要因素。hif-1可以上调vegf、et-1等目标基因的转录和蛋白合成。vegf、et-1等均能使微循环通透性增加，微循环阻力加大，微血栓形成，最终致微循环障碍，加重胰腺损伤。我们知道，hif-1可调控cox-2的表达，而cox-2所刺激表达的vcam-1(血管内皮粘附分子-1)、icam-1(细胞间粘附分子-1)更是加重微循环障碍的重要因素。因此，理论上，hif-1、cox-2可能与高原sap病情严重程度有着密切的关系，但目前对于这方面的研究尚属空白。
从实验中我们观察到，三个海拔的n组相比，病理评分及hif-1、cox-2均没有明显差异，而在sap组，上述三个指标有显著性差异，提示上述三个指标在发生sap之后才发挥重要作用。高海拔sap组与低海拔sap组、中海拔sap组与低海拔sap组的胰腺病理变化有明显差异，说明高海拔地区sap病情较之低海拔严重。同时，三个海拔的sap组相比，hif-1、cox-2都有明显的差异，而且随着海拔梯度的增高，hif-1、cox-2的表达量增加。高原出现sap时hif-1表达增高的可能机制为：高原本身的缺氧环境诱导胰腺组织表达更多的hif-1。相关性分析显示，hif-1、cox-2都与胰腺病理评分呈正相关，这就提示hif-1、cox-2在高原sap加重的环节上发挥了重要作用。而在三个海拔sap组比较中，amy并无明显差异，提示高原sap病情加重与amy没有直接的关系，amy的高低不能作为高原sap严重程度的重要特征。实验中，我们还观察到高海拔sap组与中海拔sap组相比，胰腺病理变化没有显著性差异。我们考虑可能与海拔梯度不够、高原习服时间太短及样本偏少有关。究竟多大的海拔梯度才会有差异，高原习服时间多长才能使机体变化达到高原水平，这些问题尚需在今后的研究中继续探寻。
总之，通过本实验可得出以下结论：⑴hif-1、cox-2在sap的早期即被激活，被激活的因子可能在sap的起始发病阶段起重要作用，二者在sap后期全身炎症阶段也起重要作用。⑵hif-1与cox-2在sap中关系密切，二者共同参与sap的损害。⑶由于低氧、血液粘稠度增高，高原sap患者胰腺损害、全身病情更加严重。hif-1、cox-2在低氧、血液粘稠度增高的情况下微循环障碍加重，全身炎症反应加重，其在高原sap病情进一步发展的过程中产生重要影响。
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