【摘要】 目的：研究白杨素（cr）体外对人类免疫缺陷病毒（hiv1）感染和复制的影响及对植物血凝素（pha）刺激的正常人外周血cd4+t细胞活化的影响。方法：以cr对calceinam标记的慢性感染hiv1ⅲb的h9细胞（h9/hiv1ⅲb）和mt2细胞的融合、对hiv1诱导的mt2细胞形成合胞体及对感染hiv1的mt2细胞产生p24抗原的影响，探讨其抗hiv1活性；以pha刺激人外周血单个核细胞，利用流式细胞术，检测cd4+t细胞cd69表达的百分率，分析cr对免疫活化的影响。结果：cr抑制h9/hiv1ⅲb细胞与mt2细胞融合、hiv1诱导的mt2细胞形成合胞体和p24抗原产生的选择指数分别为7.24±0.43、6.74±0.47和8.16±0.30；cr降低pha刺激的cd4+t细胞cd69的表达。结论：cr体外对hiv1的感染和复制有一定的抑制作用，且可抑制抗原刺激的cd4+t细胞的活化。
【关键词】 白杨素 hiv1 细胞融合 慢性免疫活化 流式细胞术
inhibitory effect of chrysin on hiv1 and immune activation in vitro
zhao lingzhai, zeng yaoying, zeng xiangfeng, lin changle, li haixian, huang xiuyan, wang tong.
institute of tissue transplantation and immunology, jinan university, guangzhou 510632, china
［abstract］ objective:to investigate the effects of chrysin(cr) on the infection and replication of hiv1 ,and activation of cd4+ htl in response to pha in vitro.methods:the effect of chrysin on hiv1 infection and replication in vitro were detected by cell fusion of mt2 cells and hiv1ⅲb/h9 cells labeled calceinam and the inhibition study of syncytia formation and p24 production monitored in culture supernatant of mt2 cells infected by hiv1ⅲb, respectively. flurescence conjugated monoclonal antibodies and flow cytometry were used to detect the expression of cd69 by activated cd4+t in response to pha.results:the cr inhibit the cell fusion of h9/hiv1ⅲb cell and mt2 cell, the formation of syncytia and production of p24 was 7.24±0.43, 6.74±0.47 and 8.16±0.30. cr inhibited the expression of cd69 in activated cd4+t in response to pha in a concentrationdependent manner.conclusion:chrysin can inhibit the infection and replication of hiv1 and activation of cd4+t in vitro.
［key words］ chrysin；hiv1；cell fusion；chronic immune activation；flow cytometry
艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome, aids）是由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, hiv）引起的一种致死性传染病，其流行范围广，致死率高，严重威胁着人类生命安全。WWW.133229.cOMaids最主要特征是cd4+t淋巴细胞渐进性丢失，最终导致感染者的免疫缺陷。研究表明，hiv介导的普遍性免疫过度活化是导致cd4+t细胞不断丢失、推动aids发展的重要因素［1］。在hiv感染过程中，病毒复制与免疫细胞活化相互联系、互为因果。病毒持续高水平复制不断产生抗原，反复刺激t细胞，引发宿主普遍性免疫过度活化；而活化的cd4+t细胞对hiv又更加易感，增加了hiv的复制。因此，既能有效抑制病毒感染和复制，又能抑制免疫活化的药物，在hiv感染/aids的临床治疗方面可能有一定的应用前景。
白杨素（chrysin, cr），化学名为5，7二羟基黄酮，是从紫薇科植物木蝴蝶中提取的一种具有广泛药理作用的黄酮类化合物，在蜂胶和蜂蜜中含量较高，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用［24］。我们研究发现cr对免疫系统有一定的抑制作用，是一种潜在的免疫抑制剂（结果未显示）。因此，本文以cr作为免疫活化抑制剂，探讨其对hiv1感染和复制的影响，从而为其可能的临床应用提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂 白杨素、四甲基偶氮唑盐（mtt）和植物血凝素(phytohemagglutinin , pha)购自sigma；叠氮胸苷（3′azido3′deoxythymidine, azt）购自美国biochemika fluka；钙黄绿素（calceinam）购自molecular probe公司；hiv1p24抗原检测试剂盒购自zeptometrix公司；antihcd69fitc(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)和antihcd4pe(phycoerythrin，藻红蛋白)和antihcd3apc(allophycayanin)为becton dickinson公司产品；rpmi1640、胎牛血清(fetal bovine serum, fbs)及β巯基乙醇等细胞培养试剂购自gibco brl公司。
1.2 细胞和病毒 hiv1ⅲb慢性感染的h9细胞（h9/hiv1ⅲb）和mt2细胞由南方医科大学免疫教研室惠赠;c8166细胞由中国科学院昆明动物所郑永唐教授惠赠；外周血采自健康志愿者。
1.3 方法
1.3.1 实验毒株的制备 处于对数生长期的h9/hiv1ⅲb细胞和c8166细胞以1∶1的细胞数目比混合培养。待80%以上细胞形成合胞体时，再加入3倍数量的c8166细胞，继续培养3天，离心收集上清（4℃、7 000 g×15分钟），其上清再次离心（4℃、17 000 g×1小时），病毒沉淀用rpmi1640培养基重悬，分装，-80℃冻存。
1.3.2 病毒滴度的测定 以tcid50为病毒定量指标。取1.3.1的病毒，以rpmi1640培养基10倍倍比稀释(10-1～10-10)，每孔150 μl接种于96孔板，然后加入终浓度为2×109 l-1的mt2细胞悬液50 μl，同时设mt2细胞空白对照。每样本设6个复孔，37℃、5%co2孵箱中培养，第3天开始观察细胞病变(cpe)，直到cpe不再形成。计算各稀释度病毒液出现cpe的孔数，按reedmuench法计算tcid50为10-5.1。
1.3.3 cr对细胞的毒性实验 将浓度为1×109 l-1的mt2细胞、1×108 l-1的h9/hiv1ⅲb细胞悬液按每孔100 μl分别接种于96孔板，然后加入2倍倍比稀释的cr，每孔100 μl，设3个复孔，另设溶剂对照及mt2细胞、h9/hiv1ⅲb细胞空白对照。37℃培养，第4天mtt法用酶标仪读取吸光度a490值，计算细胞生长抑制率（%）＝(1-实验孔a值/对照孔a值)，按reedmuench法计算ic50［5］。
1.3.4 cr对h9/hiv1ⅲb细胞与mt2细胞融合的影响 用1 mmol/l的calceinam按每1×105细胞2.5 μl量标记h9/hiv1ⅲb细胞，37℃孵育30分钟，pbs离心洗涤2次。用含10%fbs的rpmi1640培养基重悬，调整细胞密度为2×108 l-1，每孔50 μl接种于96孔板。然后加入50 μl倍比稀释的cr，同时设不加药物的细胞对照，每样本设3个复孔，37℃培养30分钟。然后每孔加入密度为1×109 l-1 mt2细胞100 μl，37℃培养2小时。倒置荧光显微镜下对融合细胞进行计数(n)，每孔随机计数4个视野，取均值［6］。计算抑制率（%）=（1-实验孔n值/对照孔n值），按reedmuench法计算ec50，并算出选择指数（si）。
1.3.5 cr对hiv1诱导mt2细胞形成合胞体的影响 将密度为2×109 l-1 mt2细胞悬液每孔50 μl接种于96孔板，每孔滴加200 tcid50的hiv1ⅲb 病毒液50 μl，然后加入5倍倍比稀释的cr，每孔100 μl。同时设细胞空白对照、病毒对照和azt（250 μg/l）对照各3个复孔，37℃、5%co2培养。第3天在倒置显微镜下对hiv1诱导形成的合胞体进行计数(n)，计算方法同1.3.4。
1.3.6 cr对hiv1 p24抗原产生的影响 以1 000 tcid50 hiv1ⅲb病毒攻击mt2细胞（细胞密度为1×109 l-1），细胞悬液与病毒容积比为1∶1，37℃孵育2小时。离心，弃上清，pbs洗涤2次，用含10%fbs的rpmi1640培养基重悬，调整细胞密度为1×109 l-1。每孔100 μl细胞悬液加入96孔板，然后加入5倍倍比稀释的cr，37℃、5%co2培养。3天后更换培养液，继续培养3天。收集上清用p24抗原检测试剂盒测定hiv1p24抗原。计算抑制率（%）=（1-实验孔a值/对照孔a值），同1.3.4算出ec50和si。
1.3.7 cr对pha刺激的人外周血cd4+t细胞cd69表达的影响 无菌条件下，将人血液收集到加有肝素钠抗凝剂的试管内，以ficollurografin密度梯度离心法制备pbmc，重悬于含10%fbs的rpmi1640培养液(含50 μmol/l β巯基乙醇)，调整细胞密度为6×109 l-1，96孔板每孔加100 μl，然后加入100 μl稀释好的cr，cr终浓度为5、25和50 μmol/l，37℃、5%co2培养箱中温育2小时 。然后加入终浓度为10 mg/l的pha培养20小时，分别收集各孔细胞，分别收集各孔细胞进行3色荧光标记，加入antihcd69fitc、antihcd4pe和antihcd3apc抗体，混匀后4℃避光作用30分钟。pbs离心洗涤细胞1次，重悬于300 μl的pbs中，进行流式细胞仪检测。全部数据经facscalibur流式细胞仪和cellquest软件获取。fitc为荧光1（fl1），pe为荧光2（fl2），apc为荧光4（fl4），先在前散射（fsc）对侧散射（ssc）二维散点图中划出淋巴细胞区r1，在fl4对ssc中划出cd3+细胞区r2，然后在fl2对ssc中划出cd4+细胞区r3，再在fl2对fl1的散点图中划出cd4-cd69-、cd4-cd69+、cd4+cd69+和cd4+cd69- 4个象限，该散点图细胞群来自r1×r2×r3区的细胞，即cd4+t细胞，对cd4+cd69+区和cd4+cd69-区细胞群进行荧光强度检测，用cd4+cd69+/cd4+cd69++cd4+cd69-，即获得活化的cd4+t细胞占总的t细胞的比例。每管样品检测10 000个细胞，获得的数据用cellquest软件分析。
1.4 统计学处理 数据以x±s表示，用spss 10.0统计软件进行分析，统计作图用microsoft excel，统计方法用单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 cr的细胞毒性 cr对mt2细胞和h9/hiv1ⅲb细胞的生长抑制率，见图1a。对mt2细胞的ic50为（82.61±4.48）μmol/l；对h9/hiv1ⅲb细胞的ic50为（82.08±2.68）μmol/l。
2.2 cr抑制h9/hiv1ⅲb细胞与mt2细胞融合的作用 倒置荧光显微镜下calceinam标记的h9/hiv1ⅲb细胞较强的均匀绿色荧光，体积较小，见图2a，与mt2细胞共同培养2小时后，可发生细胞融合，融合细胞荧光强度稍弱于未融合的h9/hiv1ⅲb细胞，细胞体积较大且形状不规则，见图2b。由融合细胞数目结果算出cr抑制两种细胞融合的ec50=（11.47±0.66）μmol/l，si=7.24±0.43。
2.3 cr抑制hiv1诱导的mt2细胞形成合胞体和减少p24抗原产生的作用 cr对hiv1诱导的mt2细胞形成合胞体和降低p24抗原产生的抑制率，见图1b和图1c，其ec50分别为12.33±0.90 μmol/l和10.14±0.37 μmol/l，si分别为6.74±0.47和8.16±0.30。50 μmol/l的cr对hiv1ⅲb诱导mt2细胞形成合胞体抑制率为89.18%和250 μg/l的azt对照（抑制率为91.61%）相比没有显著差异（p＞0.05），对p24抗原产生的影响（抑制率分别为87.95%和94.38%）两者比较有显著差异（p<0.05）。
图1 cr对mt2细胞和h9/hiv1ⅲb细胞的毒性（a），对h9 / hiv1ⅲb细胞与mt2细胞融合抑制作用（b），抑制hiv1ⅲb诱导mt2细胞形成合胞体作用（c）和p24抗原产生的抑制作用（d）（略）
fig.1 cytotoxicity of chrysin on mt2 cell and hiv1ⅲb cell(a), inhibitory effect of chrysin on the fusion of hiv1ⅲb/h9 cell and mt2 cell(b), hiv1ⅲb induced syncitia formation inhibition(c) and p24 antigen in culture supernatants inhibition(d)
图2 倒置荧光显微镜下calceinam标记的hiv1ⅲb/h9细胞及其与mt2细胞发生融合的细胞(×400)（略）
fig.2 h9/hiv1ⅲb cell labeled by calceinam and the fusion of h9/hiv1ⅲb cell and mt2 cell observed under reverted fluorescent microscope(×400)
图3 流式细胞术分析cr对人外周血cd4+t细胞cd69表达的影响（以其中一次实验为例）（略）
fig.3 the expression rate of cd69 on human cd4+t cells analysed by flow cytometric(take one of examples)
note:a.control;b.pha;c.pha+cr(5 μmol/l);d.pha+cr(25 μmol/l);e.pha+cr(50 μmol/l).
2.4 cr对pha刺激的人外周血cd4+t细胞cd69表达的抑制效应 人外周血cd4+t细胞在静息状态下cd69的表达率为1.52%±0.08%，经pha刺激20小时后cd69的表达增加到70.58%±1.35%，加入cr（终浓度为5、25和50 μmol/l)后cd69表达的百分率依次为63.66%±2.22%、50.34%±1.12%和33.74%±1.08%，见图3。cd69的表达百分率各加药组与pha对照相比p<0.05。
3 讨论
hiv基因编码蛋白通过其抗原和超抗原作用反复刺激t细胞，引发宿主普遍性的免疫过度活化，活化的cd4+ htl对hiv更加易感，加速了cd4+ htl的损耗，而且还可以通过“旁观者”效应和活化诱导的细胞凋亡机制导致感染和非感染的细胞死亡，进而发展成为aids［7］。目前临床治疗hiv感染/aids的最有效方法是高效抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy，haart）。haart使用两种或三种逆转录酶抑制剂和至少一种蛋白酶抑制剂，主要作用于病毒生命周期的两个不同阶段，可以使hiv感染者维持低血浆病毒载量，减少处于活化和增殖状态的t淋巴细胞数目，部分重建免疫功能［8］；有研究发现，haart与以t细胞为靶向的经典免疫抑制剂环孢素a（cyclosporine a，csa）联合应用不但有助于降低病毒载量，而且可以明显提高外周血cd4+ htl的数目。其原因就在于，csa能显著降低细胞的过度活化状态，减少活化的cd4+ htl数目，从而减少hiv的感染和复制［9］。遗憾的是，csa有较强的肾毒性而且haart还存在抗药性形成、对潜伏病毒不起作用、费用高以及副作用大等问题，这都限制了其临床应用。因此，辅助治疗药物的研发一直是hiv感染/aids临床治疗研究的热点之一。
黄酮类化合物（flavonoids compounds）是一类广泛存在于植物体内的低分子多酚类物质，多以游离态或与糖结合成甙的形式存在，是许多药用植物的主要活性成分。现已发现数百种不同类型的黄酮类化合物具有广泛的药理活性。大量研究表明，该类化合物通过调节神经细胞、免疫细胞、心肌细胞、平滑肌细胞的功能而发挥抗炎、抗过敏、抗氧化及抗癌等作用［10］。1989年，日本ono等［11］首次报道了黄芩素的抗hiv活性，此后，黄酮类化合物的抗hiv作用研究不断取得进展，发现了很多具有抗hiv作用的天然化合物。白杨素（cr）是一种天然的黄酮类化合物，本研究以pha刺激人外周血为研究活化模型，发现cr对cd4+ htl cd69（cd69又称aim或leu–23，是t细胞的早期活化标志分子之一，在静息的t细胞上不表达）的表达有明显的抑制作用，而且该抑制效应呈剂量依赖性，提供了cr抑制cd4+细胞活化的直接证据，证明了cr是一种有效的免疫活化抑制剂。而且我们对其抗hiv1活性研究发现，0.4 μmol/l时，对hiv的急性感染和病毒在细胞内的复制都没有作用，当浓度增加到2 μmol/l时即有作用，随着药物浓度增加，作用越来越强，最高实验浓度（50 μmol/l）时，对h9/hiv1ⅲb细胞与mt2细胞融合抑制率接近90%，对hiv1诱导的合胞体形成抑制作用与250 μg/l的azt（分子量为267.25）对照相当，对hiv在胞内的复制也有较强的抑制作用。
cr不仅对hiv1的感染和复制有一定的抑制作用，而且能够有效地抑制免疫活化，有研究发现cr可以竞争性结合酪蛋白激酶ⅱ（casein kinase ⅱ，ckⅱ）的核苷酸结合位点，抑制ckⅱ的活性，从而抑制hiv的转录；对潜伏感染的hiv也有一定的抑制作用［12，13］。cr对hiv感染的多个位点发挥作用使其不容易产生耐药性，而且具有多种生物活性，值得进一步探索。
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