0引言
脆性x综合征（fragile x syndrome, fxs）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的fxs是由脆性x智障基因1（fragile x mental retardation, fmr1）中5′端非编码区cgg三核苷酸重复序列不稳定扩增及其cpg岛异常甲基化导致. fmr1基因的表达产物fmrp的缺乏导致fxs的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与fmr1 基因5′ d (cgg)n3′重复序列特异性结合的蛋白cggbp1进行原核表达，并对其dna结合活性进行研究.
1材料和方法
1.1材料
大肠杆菌dh5α, bl21（ de3）和表达载体prset a均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自sigma公司； 限制性内切酶bamh i和kpni购自宝生物工程公司；t4 dna连接酶购自promega公司； ni2+nta金属螯合蛋白质纯化系统购自qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司.
1.2方法
1.2.1表达载体的构建
根据cggbp1基因起始密码子和终止子邻近序列设计pcr引物：cggbp1f cgc gga tcc gag cga ttg tag taa cag ca，cggbp1r ggg gta cct caa caa tct tgt gag ttg ag. 其上游及下游引物分别加入bamhi和kpni酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). pcr反应以人淋巴细胞cdna文库为模板，扩增编码cggbp1的基因序列. 设计pcr扩增体系25 μl，灭菌去离子水10 μl，10×反应缓冲液2.5 μl，25 mmol/l mgcl2 2.0 μl，dmso 2.5 μl，4× dntp混合物（每种2.5 mmol/l）2 μl，cggbp1f和cggbp1r各10 pmol，模板3.5 μl（50 ng/μl）， taq dna（5 μ/μl）聚合酶0.5 μl. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. pcr产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用bamhi和kpni酶切pcr产物和prset a，酶切产物电泳后回收，在ｔ4连接酶作用下，目的片段定向克隆至prset a的bamhi和kpni克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌dh5α，接种到含氨苄青霉素的lb培养基平板并挑取单菌落.
1.2.2融合蛋白的诱导表达
将测序正确的重组质粒转入bl21（ de3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/l氨苄青霉素的lb培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 ml/l比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入iptg至终浓度1 mmol/l，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，sdspage分析重组蛋白的表达.
1.2.3蛋白表达形式的分析
取5 ml菌液离心，用500 μl的裂解液（10 mmol/l 咪唑，300 mmol/l nacl及50 mmol/l磷酸二氢钠 ph 8.0）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/ml，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行sdspage分析.
1.2.4融合蛋白的纯化
将1 ml 500 ml/l ni2+nta悬液和4 ml细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱结束后，用4 ml漂洗液（20 mmol/l 咪唑，300 mmol/l nacl及50 mmol/l 磷酸二氢钠 ph 8.0），洗脱未和ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用0.5 ml洗脱液(250 mmol/l 咪唑，300 mmol/l nacl及50 mmol/l 磷酸二氢钠 ph 8.0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集. 取收集液，进行sdspage分析.
1.2.5cggbp1与（cgg）29重复序列双链dna结合
实验取10 μl磁珠用1 ml的无rna酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/l trishcl，2 mol/l nacl，1 mmol/l edta，1 g/l tween 20）15 μl重悬磁珠，各5 μl分3组实验. 其中一组加入25 μl（100 ng/μl）生物素化的（cgg）29重复序列双链dna，另外两组分别加入25 μl（100 ng/μl）非生物素化的（cgg）29重复序列双链dna和25 μl三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μl，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后cggbp1（500 μg/ml）15 μl 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/l hepes，100 mmol/l nacl，0.5 mmol/l dtt，100 g/l甘油）20 μl，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μl，沸水煮10 min，进行sdspage分析.
2结果
2.1原核表达载体的构建及鉴定
扩增产物在15 g/l的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒prset a/cggbp1及质粒prset a分别用bamhi和kpni酶切，prset a/cggbp1分为两个片段，分别为2.9 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同.
2.2cggbp1的表达
用bamhi和kpni双酶切prset a/cggbp1表达质粒，筛选阳性重组质粒. 携带有prset a/cggbp1质粒的e.coli bl21(de3)菌株，经iptg诱导后，在mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经iptg诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分. 经sdspage分析表明，cggbp1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）.
2.3cggbp1蛋白纯化
在表达质粒prset a多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(his )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(his )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(his )6 tag 和金属ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. sdspage显示，cggbp1得到较高程度的纯化（图4）.
2.4cggbp1与5′d（cgg）293′重复序列
双链dna结合实验生物素化的5′d（cgg）29 3′重复序列双链dna被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（cgg）293′重复序列双链dna因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入cggbp1后，未和5′d (cgg）293′重复序列双链dna结合的蛋白也被洗脱（图5）.
3讨论
关于微卫星的产生机制，普遍认为是dna复制过程中dna聚合酶的滑动［4］，或dna复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体rna基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程. 脆性x综合征是igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（cgg）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义.
本实验成功地构建了含cggbp1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过ni2+nta柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人fmr1基因5′d (cgg)293′重复序列双链dna特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白cggbp1功能的研究和阐释cgg三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.
【参考文献】
［1］wells rd, warren st. genetic instabilities and hereditary neurological disorders ［m］. academic press, san diego,1998:46-96.
［2］cleary jd, nichol k, wang yh, et al. evidence of cisacting factors in replicationmediated trinucleotide repeat instability in primate cells［j］. nat genet, 2002, 31(1)：37-46.
［3］deissler h, wilm m, genc b, et al. rapid protein sequencing by tandem mass spectrometry and cdna cloning of cggbp1［j］.biol chem, 1997,272(27):16761-16768.
［4］sinden rr, potaman vn, oussatcheva ea, et al. triplet repeat dna structures and human genetic disease: dynamic mutations from dynamic dna ［j］. bioscience, 2002,27(1 suppl 1):53-65.
［5］wahls wp. meiotic recombination hot spots: shapping the genome and insight into hypervariable minisatellite dna change［j］.curr top dev bio1, 1998,37:37-75.
［6］wahls wp, moore pd. recombination hotspot activity of hypervariable minisatellite dna requires minisatellite dna binding proteins［j］.somat cell mol genet, 1998,24(1):41-51.
［7］igarashi s, tsuji s. the molecular mechanisms of the instability of the cag repeat［j］. nippon rinsho,1998,56(4):1064-1073.
［8］deissler h, behnkrappa a, doerfler w. purification of nuclear proteins from human hela cells that bind specifically to the unstable tandem repeat (cgg)n in the human fmr1 gene［j］. biol chem, 1996,271(8):4327-4334.
