【关键词】 子宫内膜肿瘤;受体，雌激素;受体，孕激素;中期因子;血管生成诱导剂
【摘要】 目的 探讨子宫内膜癌中雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)、中期因子(mk)、血管内皮生长因子(vegf)的表达及其与临床病理特征的关系。方法 采用实时荧光定量pcr检测50例子宫内膜腺癌(研究组)和30例正常子宫内膜组织(对照组)中er、pr、mk、vegf mrna的表达水平，结合患者的临床病理资料进行分析。结果 (1)子宫内膜癌组织中er和pr mrna表达量，较对照组低(p<0.05)。mk和vegf mrna表达量明显高于对照组(p<0.05)。(2)在子宫内膜癌组织中检测指标的表达水平与临床病理分期、组织学分级和肌层浸润深度有关系，随临床病理分期、组织学分级的升高和肌层浸润的加深，er、pr的表达水平下降，而mk和vegf表达水平明显升高，均有统计学意义(p<0.05)。结论 er、pr、mk和vegf的检测有助于评估子宫内膜癌的生物学行为和预后，并指导该疾病的内分泌治疗。
【关键词】 子宫内膜肿瘤;受体，雌激素;受体，孕激素;中期因子;血管生成诱导剂
study on the relationship between the expressions of er, pr, mk, vegf and their clinicopathological characteristics in endometrial carcinoma liu chun*,yang yun,liu shuangjing,et al. * department of obstetrics and gynecology,the second hospital of hebei medical university, shijiazhuang 050000, china
【abstract】 objective to explore the relationship between the expressions of biomarkers estrogen receptor (er), progesterone receptor (pr), midkine (mk), vascular endothelial growth factor(vegf) and the clinicopathologic features in patients with endometrial carcinoma.methods realtime fluorescence quantitative pcr (rtpcr) was used to detect the expression of er, pr, mk and vegf in 50 cases of endometrial adenocarcinoma and 30 cases of normal endometrium. results (1)the expression of er and pr mrna was significantly decreased in endometrial carcinoma tissues,as compared with that in normal endometrium tissues (0.67±0.39 vs 2.68±0.24,p<0.05; 1.01±0.54 vs 2.57±0.49,p<0.05). the expression of mk and vegf mrna in endometrial carcinoma was 9.77±2.08 and 29.85±6.72 respectively,which in normal endometrium tissue was 1.24±0.36 and 11.49±1.72 respectively, the former was significantly higher than the latter(p<0.05). (2)the expression levels of these parameters were related to clinical stages, histological grades and the depth of myometrial invasion. with the increasing of clinical stages, histological grades and the depth of myometrial invasion, the expression of er and pr mrna decreased,however,the expression of mk and vegf increased, there were significant differences between them(p<0.05). conclusion the detection for er, pr, mk and vegf may be helpful for evaluating biological behaviors and prognosis of patients with endometrial adenocarcinoma and for clinical endocrine therapy.
【key words】 endometrial carcinoma;receptor,estrogen;receptor,progestin;midkine;vascularization inducer
分子生物学技术的深入研究表明肿瘤的形成和发展是一个多因素参与、多基因改变的复杂过程，新生血管的形成在肿瘤的发生发展中起到重要作用。WwW.133229.coM血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)和中期因子(midkine，mk)均可以调控肿瘤血管形成，从而促进肿瘤细胞的发生、发展及转移。子宫内膜癌是女性生殖器官常见的三大恶性肿瘤之一，其发生多认为与子宫内膜的过度增生及体内雌、孕激素的刺激和雌激素受体(estrogen receptor，er);孕激素受体(progesterone receptor，pr)的表达水平有密切关系。目前，临床上尚未找到理想的评估其生物学行为和预后的相关指标。本课题拟通过实时荧光定量pcr(realtime fluorescence quantitative pcr，fqpcr)方法检测正常子宫内膜和子宫内膜癌患者组织中er、pr、mk、vegf的表达水平，结合临床病理学特征进行分析，为该病的治疗及判断预后提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 研究组：选取河北医科大学第二医院2008年5月至2010年2月因子宫内膜癌手术治疗切除的子宫内膜组织50例，患者年龄37～65岁，中位年龄55.6岁。术前均未进行放、化疗或内分泌治疗。术后经病理证实为子宫内膜腺癌，其中ⅰ期18例，ⅱ期22例，ⅲ期10例。组织学分级为g1(ⅰ级、高分化)19例(38%),g2(ⅱ级、中分化)23例(46%),g3(ⅲ级、低分化)8例(16%)。肌层浸润程度:无肌层浸润者8例(16%)，浸润深度≤1/2 27例(54%)及>1/2肌壁者15例(30%)。对照组：选用同期因子宫纵隔或肌瘤手术后切除的内膜组织，经病理证实为正常的内膜组织，排除功能性子宫出血、不孕等具有内分泌因素影响的子宫内膜，共30例，年龄21～49岁，中位年龄37岁。
1.2 仪器与试剂 trizol reagant(美国gibco)，taqman反转录试剂盒(上海promega公司)，引物荧光探针合成和pcr反应试剂盒(上海生物化工公司)，ab i pr ism 7500荧光实时定量pcr仪(美国pe)。
1.3 er、pr、mk和vegf表达的检测 采用fqpcr检测标本的er、pr、mk和vegf mrna表达水平，以gapdh基因为内参，通过计算得出基因的相对表达量。
1.3.1 总rna的提取和cdna的合成:trizol法提取细胞总rna，紫外分光光度仪检测rna的质量和浓度。20 μl反转录反应体系中经特异性下游引物反转录成cdna后(步骤按操作说明书进行)，用easy dilution将cdna液按100、101、102、103梯度稀释后，各取2 μl cdna进行realtime pcr反应。
1.3.2 fqpcr分析:基因序列源自genbank，以primer 5软件设计引物，见表1。荧光定量pcr反应体系为20 μl，其中含样品cdna 2 μl，premix ex taqtm (2×)10 μl，上游、下游引物(10 μmol/l)各0.7 μl，荧光探针(4 μmol/l)0.8 μl，dh2o 5.8 μl。pcr循环参数：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 45 s，40个循环。按照下列公式计算样本中mk和vegf的相对表达量[1]：△ct(目的基因)=目的基因ct-内对照基因ct;△△ct=△ct(目的基因)-△ct(标准值);目的基因的相对拷贝量为2△△ct。
1.4 统计学分析 应用spss 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，多个均数间比较采用方差分析,p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 2组er、pr、mk、vegf mrna表达比较 研究组er、pr表1 实时定量pcr引物与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)。研究组mk、vegf在内膜癌组织中的表达明显高于对照组(p<0.01)，见表2。表2 2组er、pr、mk、vegf mrna表达比较注：与对照组比较，*p<0.01
2.2 er、pr、mk、vegf的表达与临床病理特征和分级的关系 er、pr、mk和vegf mrna的表达与临床病理分期、组织学分级和肌层浸润程度有统计学意义(p<0.01)。随临床病理分期、组织学分级的升高和肌层浸润程度的加深，er、pr mrna的表达水平降低(p<0.05,p<0.05)，而mk、vegf mrna则随之明显升高(p<0.05,p<0.05)。见表3。 表3 不同病理分期和分级内膜癌中er、pr、mk、vegf的表达
3 讨论
3.1 子宫内膜癌中er、pr表达特征 er和pr广泛存在于女性生殖器官的组织细胞中,是女性生殖器官接受雌、孕激素统一调节的物质基础。子宫内膜癌是激素依赖性肿瘤，国内外研究证实，er、pr阳性表达与临床病理分期、组织分化程度、肌层浸润相关[2-4]。目前大部分研究多采用定性或半定量来衡量子宫内膜癌er、pr的表达水平，缺乏客观性。本研究采用fqpcr方法检测er和pr的mrna水平，结果显示，子宫内膜腺癌中er、pr的表达水平明显低于正常内膜组织，而且临床分期和组织学分级越高、肌层浸润越深，er、pr表达水平越低。说明er和pr的缺失与细胞恶性程度上升和侵袭性增加有关。er和pr水平的高低与临床选择内分泌治疗有关[5]。er和pr在子宫内膜样腺癌组织中不同程度的缺失，说明在癌变过程中二者有不同程度的破坏，丧失了对性激素的识别功能。若er和(或)pr阳性说明肿瘤细胞的激素调节功能尚未完全丧失，对激素刺激会有一定反应，这是内分泌治疗奏效的基础。因此本研究结果有助于判断肿瘤生物学行为和指导内分泌治疗。
3.2 子宫内膜癌中mk、vegf的表达特征 mk是一种新发现的肝素结合生长因子/分化因子家族中的一员，最初被描述为胎儿与新生儿发育过程中的调节因子,表达高峰出现在胚胎发生的中期，成年后仅在肾脏中表达，其他正常组织几乎测不出mrna表达。mk具有多种生物学活性，可以促进细胞分化、促有丝分裂、增强纤维溶酶活性等。近年研究发现，mk在多种肿瘤组织中异常表达，参与肿瘤的血管生成、抗细胞凋亡，并可影响肿瘤细胞的存活、增殖与分化,它表达的上调提示肿瘤患者的生存期缩短和预后不良[6-9]。vegf是一种具有肝素结合活性的同源活性的二聚体糖蛋白，它是最主要的调控实体瘤血管发生和新生血管形成的因子之一，对肿瘤的血管生成起关键作用。vegf通过酪氨酸蛋白激酶受体特异性的作用于内皮细胞，诱导其分裂增生，增加血管通透性，从而促进内皮细胞的增殖、迁移，诱导血管生成。
本研究中mk、vegf在正常内膜组织中微弱表达，而在子宫内膜癌组织中高表达，且随病理分期和组织学分级的升高、肌层浸润加深，二者表达也随之增加，提示当子宫内膜癌变发生时，异常增生腺上皮细胞可能重新获得合成和分泌mk的能力,从而促进有丝分裂，使细胞发生恶性转化。同时mk还与vegf共同参与肿瘤新生血管的形成，从而促进子宫内膜癌的发生、发展及转移。这与目前研究一致[10，11]。mk和vegf在子宫内膜腺癌组织中的过度表达常预后较差,术后生存率低。
综上所述，er、pr在子宫内膜癌组织中表达的缺失和mk和vegf的高表达，与子宫内膜癌的发生发展密切相关，联合检测这四项指标为评估肿瘤的生物学行为、分化程度和判断预后提供依据，并可指导术后内分泌辅助治疗。
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