【关键词】 人乳头瘤病毒16型e6蛋白;免疫组织化学;宫颈肿瘤;hpv疫苗
【摘要】 目的 研究人乳头瘤病毒16型e6蛋白(human papillomavirus16 e6 protein，hpv16e6)在宫颈病变组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系。方法 采用免疫组化sp法检测hpv16e6蛋白在宫颈正常组织、慢性炎症、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，cin)、浸润癌上皮中的阳性表达情况。结果 hpv16e6在正常宫颈、宫颈炎、cin,宫颈癌各组中，阳性表达率分别为0.5%、38.35%、46.15%、71.11%，4组比较差异有统计学意义(χ2=27.50，p<0.01)。经χ2分割后比较(α′=0.007143)，宫颈癌组、cin组、宫颈炎组的阳性率显著高于正常宫颈组(p<0.05)，宫颈癌组的阳性率显著高于宫颈炎组(p<0.01)。hpv16e6与年龄、病理类型、宫旁或脉管浸润相关(p<0.05)。结论 hpv16e6与宫颈癌的启动、发生、发展及侵袭转移均密切相关。hpv疫苗对于宫颈癌的防治有广泛的应用前景。
【关键词】 人乳头瘤病毒16型e6蛋白;免疫组织化学;宫颈肿瘤;hpv疫苗
the expression and clinical significance of hpv16e6 in the pathological tissues of cervix zhang lihua,xin huadong,wu shiqian.department of gynecology, handan central hospital,hebei,handan 056001,china
【abstract】 objective to investigate the relationship between the expression of human papillomavirus16 e6 protein (hpv16e6) and clinical pathological characteristics.methods the expression of hpv16e6 protein in patients with cervical cancer, cervical intraepithelial neoplasia (cin),chronic cervicitis and normal cervical epithelium were examined by immunohistochemitry.results the positive rate of hpv16e6 protein was 71.11%,46.15%,38.35%,0.5% in cervical cancer,cin,chronic cervicitis and normal cervical epithelium respectively. there were significant differences in the positive rates among the 4 groups (p<0.01).the positive rate in cervical cancer group was significantly higher than that in chronic cervicitis group and normal cervical epithelium group(p<0.01).the positive rate in cin and cervicitis group was significantly higher than that normal cervical epithelium group(p<0.01).the positive expression of hpv16-e6 was correlated with the age of the patients ,pathological types and the infiltration of latero-uterus or haemal tube(p<0.05).conclusion hpv16e6 plays an important role in the genesis,development,invasion and metastasis of cervical carcinoma. the vaccine of hpv has wide application prospect in the prevention and treatment of cervical carcinoma.
【key words】 hpv16e6;immunohistochemitry;cervical cancer;vaccine of hpv
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤[1]，在我国发病率居女性恶性肿瘤的首位，是导致女性死亡的主要原因[2]。WwW.133229.Com高危型hpv的持续感染是宫颈癌及其癌前病变的直接病因，没有持续高危hpv感染，便没有可能发生宫颈鳞癌[3，4]。本研究采用免疫组化法检测人不同宫颈病变组织中的hpv16e6蛋白的阳性率，探讨hpv16e6蛋白不同宫颈病变组织中的表达情况及其与宫颈癌临床病理参数之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本研究标本取自2007年3月至2009年3月在河北省邯郸市中心医院妇科初诊的宫颈癌患者45例。年龄26～61岁，平均年龄46岁。其中鳞癌36例，腺癌6例，腺鳞癌及透明细胞癌3例。根据国际妇产科联盟(figo，2000年)标准分期：ⅰ期25例，ⅱ期17例，ⅲ期3例。组织分化程度g1、g2、g3分别为12例、20例、13例。患者术前均未接受放、化疗。选择同期因妇科良性疾病手术治疗或门诊治疗患者的正常宫颈组织21例，宫颈慢性炎症73例，cin 26例。所有标本于离体0.5 h内取材，以10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片备用。所有取材标本均常规he染片确定病理学诊断、组织学类型和分级，病历资料完整。
1.2 检测方法 采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶联结免疫组化(sp)法进行实验检测。基本原理是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。鼠抗人hpv16e6单克隆抗体、即用型鼠sp kate检测试剂、dab显色试剂盒、sp试剂盒均为北京中山生物技术有限公司产品。本实验染色程序严格按sp染色试剂盒说明书操作。
1.3 免疫组化结果判断标准 根据文献，按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱评分(immunohistochemical scores，ihs)[5]： ihs=a×b。a代表阳性细胞百分比：a=0，无阳性细胞;a=1，阳性细胞为1%～10%;a=2，阳性细胞为11%～50%;a=3，阳性细胞为51%～80%;a=4，阳性细胞为81%以上。b 代表阳性细胞染色强弱：b=0，阴性;b=1，弱阳性;b=2，中度阳性;b=3，强阳性。ihs 0分为(-);ihs 1～4分为(+);ihs 5～8分为(++);ihs 9～12分为(+++)。hpv16e6蛋白阳性细胞以胞核内出现棕黄色颗粒为主，部分出现在胞浆中。每张切片均以ihs评价得分情况。每批染色均同步设立对照，以pbs液代替一抗为阴性空白对照。
1.4 统计学分析 应用sas 8.1统计软件，计数资料采用χ2检验、确切概率法、多个样本率比较的χ2分割法，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 hpv16e6蛋白在不同宫颈病变组织中的表达 hpv16e6染色阳性以胞核内出现棕黄色颗粒为主，部分出现在胞浆中，其在正常宫颈、宫颈炎、cin、宫颈癌各组中的阳性表达率分别为0.5%、38.35%、46.15%、71.11%，4组比较差异有统计学意义(χ2=27.50，p<0.01)。经χ2分割后比较(α′=0.007143)，宫颈癌组的阳性率明显高于宫颈炎组及正常宫颈组(χ2=11.95，p=0.0005;χ2=25.21，p<0.01)。cin组明显高与正常宫颈组(χ2=9.95，p=0.0016)。宫颈炎组明显高于正常宫颈组(χ2=8.63， p=0.0033)。而宫颈癌组与cin组，cin组与宫颈炎组阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=4.35， p=0.0369;χ2=0.4841，p=0.4866)。cin组及宫颈炎组内重度病变阳性率明显高于轻度病变(χ2=11.17，p=0.0008)。见表1、2。表1 hpv16e6在 cc、cin、cc正常宫颈组织中表达比较 表2 χ2分割后hpv16e6阳性表达率比较
2.2 hpv16e6蛋白的表达与宫颈癌临床病理参数之间的关系 hpv16e6的阳性率在宫颈癌组织中的表达与组织学分级、临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤直径、肌层浸润深度差异无统计学意义(p>0.05)。在<45岁和≥45岁患者中分别为57.65%、89.47%，二者比较差异有统计学意义(χ2=5.39，p<0.05); 在鳞癌与非鳞癌中分别为88.24%、18.18%，二者比较差异有统计学意义(χ2=16.59，p<0.05);有宫旁或脉管浸润与无宫旁或脉管浸润的组织中分别为89.47%、57.69%，二者比较差异有统计学意义(χ2=5.40，p<0.05)。见表3。表3 hpv16e6蛋白表达与宫颈癌的关系和临床病理特征
3 讨论
hpv为乳多空病毒科a属成员，由无被膜的正20面体构成病毒壳体，是7 900 bp环状、双链、右手螺旋、嗜上皮性的dna病毒[6]。钱元淑等[7]用pcr法检测hpv16/18在宫颈癌及其癌前病变中的表达情况。结果显示：hpv16/18阳性率在正常宫颈到宫颈炎、cin、再到宫颈癌有逐渐升高趋势。宫颈癌组与cin组、cin ⅲ与cinⅰ～ⅱ级、中重度宫颈炎组与轻度宫颈炎组差异有统计学意义。本研究中用χ2分割法处理后，宫颈癌组阳性率显著高于宫颈炎组及正常宫颈组，cin组和宫颈炎组阳性率显著高于正常宫颈组。提示：从正常宫颈向cin及宫颈癌的转化是一个渐进的过程，而高危型hpv16感染是宫颈细胞恶性转化的重要因素，是宫颈病变发生的早期事件。本实验中，经χ2分割后，宫颈癌组与cin组的阳性率无统计学意义，分析可能与cin组样本例数少有关，但cin ⅲ级显著高于cinⅰ～ⅱ级，中重度宫颈炎显著高于轻度宫颈炎，提示：hpv16感染在宫颈病变早期发挥作用，且阳性率有逐渐增高趋势。与文献报道[8，9]结果相似。目前大量研究发现：高危型hpv dna整合[10]到宿主基因组将导致宿主细胞产生抑癌基因功能缺陷、基因组不稳定性和细胞永生化等一系列不可逆的链式反应，是宫颈癌变的重要机制之一。高危型hpv从肿瘤的启动、发生、发展及恶性表型的全过程都密切相关。由此可见，hpv16感染在宫颈癌的发生、发展中发挥重要作用。本研究显示：在宫颈癌组织中hpv16e6蛋白的阳性表达率与宫旁或脉管浸润有关(p<0.05)。关于hpv感染对宫颈癌侵袭能力的报道较少。研究显示：与hpv感染相关的高级鳞状上皮内病变及恶性肿瘤中e6和e7蛋白的表达水平显著提高，表明e6和e7蛋白的表达水平与病变的进展程度及细胞的恶性转化密切相关。特定的hpv16e6变异可能具有较高的宫颈癌患病风险[11]。诸多研究证明端粒酶的激活与宫颈异型增生和宫颈癌的进展过程有关[12-14]。hpv16e6可提高端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase， htert)mrna的水平，激活端粒酶，是cin向宫颈癌转化过程中的关键步骤，其阳性表达率随宫颈癌前病变的进展逐渐升高，与宫颈癌的级别呈正相关[15]。同所有实体肿瘤一样，宫颈癌的发生、发展和转移呈明显的血管依赖性。血管内皮生长因子c(vascular endothelial growth factors c，vegfc)在多种肿瘤细胞中表达，具有诱导血管和淋巴管生成的潜能，促进肿瘤的侵袭和转移。多项研究显示[16-18]：vegfc与高危型hpv癌蛋白在宫颈癌中的表达呈正相关，推测高危型hpv可能在整合入宫颈上皮细胞dna后，通过促进宫颈上皮高表达vegfc导致肿瘤内及癌旁组织新生血管及淋巴管的形成，从而促进宫颈癌的侵袭转移。上述因素协同作用，促进病毒基因组的复制和繁殖，使含有整合状态的病毒癌基因的细胞不断的增殖。这与本研究hpv16e6蛋白与宫旁或脉管浸润有关一致。提示：高危型hpv e6蛋白在促进宫颈上皮癌变过程中扮演重要角色，hpv16在宫颈癌的侵袭转移中发挥一定作用。
sherman等[19]认为对ascus患者进行hpv检测可早期发现cin ⅲ及宫颈早期浸润癌。目前的主要观点是：对细胞学检查显示ascus且年龄在30以上的患者应进一步行hpv dna检测，并且只对高危hpv检测结果阳性者作进一步阴道镜检查。这不仅提高宫颈癌及癌前病变筛查的灵敏度，且可避免和减少不必要的阴道镜检查。cin病变在治疗后，hpv检测呈阳性可能意味着病变的残余，有助于评价疗效及预测复发。研究显示：高载量的hpv16型病毒感染不仅与宫颈上皮内瘤变的进展有关，还强烈预示着发生浸润性宫颈癌的风险增高，且病毒负荷量越高，宫颈病变加重的风险越大[20]。hpv的检测方法很多，其中仅第二代杂交捕获法(hybrid caprure ⅱ，hcⅱ)被美国食品药品管理局批准可广泛应用。hcⅱ敏感性高而特异度较低，虽然流行病学调查证明hpv负荷量与宫颈癌患病风险存在关联，但评价长期病毒负荷状态与hpv感染进展为cin和宫颈癌相关性的纵向研究数据较缺乏。hcⅱ并不能精确地辨别hpv类型，且hpv持续感染和一过性感染都可能表现出高hpv负荷，常不能准确评判hpv感染状态。hcⅱ作为宫颈癌的诊断手段及价值文献报道不一，存在争议。
随着hpv病毒与宫颈癌关系的确定，大大推动了相应疫苗的研究。目前已有2种hpv预防性疫苗上市，分别是四价疫苗“gardasil”和双价疫苗“cervarix”。“gardasil”于2006年6月获美国fda批准在人群中广泛使用，是包含hpv16、18、6、11型的混合型疫苗。临床ⅲ期实验表明， 不仅可以100%保护健康女性不发展到高级别宫颈上皮内病变阶段，对于已有宫颈上皮内瘤样变的患者可部分抑制其病情的进展[21]。“cervarix”是包含hpv16、18型别的混合性疫苗，临床ⅱ期实验的跟踪结果显示：疫苗的保护期可达6.4年[22]。目前我国正在进行涵盖我国优势流行病毒株hpv58的多价混合性疫苗的临床前研究，包含hpv16、18、58、6、11五种型别，预计2～3年进入临床实验研究阶段。临床实验表明两种上市疫苗对型别之外的其他高危型hpv感染及癌前病变没有预防作用，故接种宫颈癌疫苗不能完全代替宫颈癌筛查，目前宫颈癌筛查仍是预防宫颈癌的有效手段。hpv治疗性疫苗主要是诱发针对e6、e7蛋白的细胞免疫反应，在临床ⅰ、ⅱ期试验中显示出良好的抗hpv反应，但尚无有效的hpv治疗性疫苗问世。
综上所述，高危型hpv从宫颈癌的启动、发生、发展及侵袭转移的全过程都密切相关。作为宫颈癌前病变及浸润癌的病因已得到多项研究的证实，在与其他致癌因素的协同下促使细胞恶性转化并永生化，继而通过端粒酶、vegfc等复杂的机制促进宫颈癌恶性生物学行为的演进，因此，针对高危型hpv的检测、预防及治疗具有重要的临床意义及社会效益。
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