【关键词】 大电导钙激活钾通道；子宫平滑肌
【abstract】 how to control the excess excitability of myometrium is the key problem in premature labor treatment.bkca channel(large conductance ca2+-activated k+ channel),a component in cell membrane,which can make smooth muscle quiescent,is richly distributed in uterine myocytes.its modulatory function and corresponding mechanism on uterus contractility are hot spots investigated in recent years.in this review,we summarized the current advances in the function of bkca channel in myometrium and its intracellular mechanism.
【key words】 bkca channel;myometrium
妊娠是一个复杂的生理过程，在妊娠期间，子宫平滑肌兴奋性的控制有着重要的意义，因为子宫平滑肌功能不全可能是导致早产及难产的一个原因。WwW.133229.COm随着对人类分娩病因及病理的分子及生理机制的深入了解，发现通过离子通道的开放和失活可调控子宫平滑肌的收缩性，考虑对早产等的治疗有着巨大的潜力［1］。而基础研究发现，在未妊娠及妊娠子宫平滑肌细胞中，bkca通道是最主要的钾通道［2，3］，该通道在平滑肌膜电位的维持和肌紧张的调节中起着重要的作用。本文综述了蛋白激酶在调节bkca通道中的作用以及bkca通道作用于子宫平滑肌的可能机制。
1 bkca通道
在人类组织细胞中，有三种对钙离子敏感的钾通道，包括大电导（large conductance ca2+-activated k+-channel,bk）、中电导（intermediate conductance ca2+-activated k+-channel,ik)及小电导（small conductance ca2+-activated k+-channel,sk)的钙激活钾通道。其中，bkca通道广泛分布于除心肌以外的所有组织。尤其在子宫平滑肌中，bkca通道表达密度最高，而ikca和skca通道则未见表达［4］。
1.1 bkca通道的结构 bkca通道由四个α亚单位构成的主体及附属的β调节亚单位（β1～β4)组成［5，6］。这些孔样的α亚单位有一个单基因编码――kcnma1，且其在哺乳动物中有着很高的同源性（如人类和牛约为100%的氨基酸同源）；而不同的β亚单位则有不同的基因编码，其在哺乳动物中同源性为82%～85%。分子学研究显示：该通道蛋白的基础结构同常规电压门控钾通道的s1～s6穿膜区域有着高度的同源性。事实上，该通道可被看作添加了一个新奇的羧基末端（含四个疏水区域s7～s10，未知拓扑）的复合的电压门控通道，而电压依赖性、通道开放时间及电导被认为是s1～s6区域的一个功能。一些学者从另一个角度描述了该通道：α亚单位包括一个执行钾通道功能的依赖电压激活的核心区域（s0～s8）及一个高度保守的同钙调节相关的近羧基端的尾区域（s9～s10），α亚单位近氨基末端的跨膜片段s0是bkca通道最特殊的部位，对β亚单位的钙调节起着重要作用［7］；β亚单位由两个穿膜片段（t1、t2）组成，但在不同的组织中，β亚单位的组成不同（脑细胞β1～β4、肾足细胞β3～β4、子宫平滑肌细胞仅含β1)。从平滑肌中复制出的bkca通道的α亚单位上有pkg和pkc的磷酸化位点，β亚单位上有pkg的磷酸化位点，在两种亚单位上可能同时存在pka的磷酸化位点。
1.2 bkca通道的生理特性 在不同种类的细胞中，bkca通道的功能各不相同。在神经元及骨骼肌细胞上bkca主要参与动作电位快后超极化的形成和神经递质的释放从而引起神经元冲动的发放；在平滑肌细胞包括血管平滑肌及子宫平滑肌等，则参与维持膜电位及调节肌紧张等生理过程。随着膜片钳技术的发展应用，bkca通道的电生理学特性渐渐得以明确。该通道显示出一个约200ps的单通道大电导，表现为钙离子激活及电压依赖并存的特性：当细胞内钙离子浓度达到微摩尔时，其β亚单位才发挥钙敏感活性，使通道能在给予较小的去极化电压时开放；反之，如果细胞内钙离子浓度很低，β亚单位失去功能（对钙失敏），则通道只能呈现单纯电压门控通道活性，需要很大的去极化电压使其开放［8］。通道可被ibtx（iberiotoxin)、四乙铵（tetroethylammanium,tea)、钡（ba）、蝎毒素（charybodotoxin)和桩蛋白（paxilline)等bk特异性阻断剂所阻断［9，10］。
2 几种影响bkca通道的蛋白激酶及其调控机制
蛋白激酶是bkca通道活性潜在且重要的直接调控者，其可调节通道对生理膜电位及细胞内ca2+的浓度的敏感性。
2.1 影响bkca通道的蛋白激酶
2.1.1 pka pka是第一个被提出对平滑肌bkca通道活性有影响的蛋白激酶。pka可影响bkca通道的动力学而不影响其电导力。通过减少通道关闭的时间常数，同时增加通道开放的时间常数，从而起到增强bkca通道的活性。不论pka浓度在10～500nm还是pka活性在0.01～50.00u/ml（活性在5～20u/ml常被采用），均可以观察到bkca通道活性的变化。liu等［11］的研究也提示在绝大部分哺乳动物的平滑肌中，pka的激活可增强细胞膜bkca通道的活性。
2.1.2 pkg 第二个对平滑肌bkca通道的活性有影响的蛋白激酶是pkg［12］。当pkg浓度在80～900nm或活性在300～5000u/ml时，可以观察到bkca通道活性的增强。有趣的是，在非妊娠妇女的子宫平滑肌中，pkg和pka可使bkca通道活性下降约85%，而剩下的约15%的bkca通道活性提高了，然而在妊娠妇女的子宫平滑肌中观察到了相反的结果［13］。这些结果提示我们，在同一组织的不同时期，pkg等蛋白激酶对于通道的作用是不一样的，因此，我们考虑可能同本文前面所提及的bkca通道的α、β亚单位的构象变化相关。
2.1.3 pkc 尽管在平滑肌中，当pkc活性为0.1～1.0u/ml时可抑制bkca通道，但目前pkc对于bkca通道的作用还没有更进一步的研究。
2.2 蛋白激酶调节bkca通道的可能机制
2.2.1 atp酶的作用 提供一个磷酸基团的atp酶，可用于pkg/pka对bkca通道的激活。尽管有报道atp对bkca通道有直接抑制作用，但后来发现是由于atp对钙离子的螯合作用所致。因此，目前认为atp不会抑制bkca通道的活性。此外，一些研究观察到，激活bkca通道的是atp酶而非在无酶溶液中的atp。且atp酶的这一效应不能被非水解的atp类似物amt-pnp仿效，而可以被pka抑制剂清除及被磷酸酶抑制剂增强，提示通道的激活不是由于atp酶自身而是通过该通道相关的一种激酶作用的。相对照的，在许多研究中，在浓度低于1mm时，atp及atp酶均不能影响bkca通道活性。因此考虑，atp酶及atp对于平滑肌的bkca通道活性没有直接的作用，激活作用仅发生于当一种通道相关的激酶存在于该离体的膜片中时。
2.2.2 camp及cgmp的作用 尽管camp及cgmp可分别激活pka及pkg，但这些环核苷酸也可能直接作用于bkca通道。在人子宫平滑肌中，bkca通道的活性可被500μm的8-氯苯硫代cgmp增强，但其作用可被环核苷酸依赖的激酶所消除，提示一种通道相关的激酶可引起该效应［14］。在大多数研究中，应用高达500μm的camp或100μm的cgmp不能改变bkca通道的活性。因此，在大多数研究中，生理浓度的camp及cgmp对bkca通道没有直接作用，这些环核苷酸的效应可能反映在通道相关激酶的激活上。
2.2.3 蛋白激酶的作用 应用蛋白激酶作用于缺乏atp酶的bkca通道，camp及cgmp均不能改变通道的活性。这些辅因子的添加通过pka及pkg介导的磷酸化支持了通道的激活。此外，在atp酶及camp/cgmp的存在下，添加热灭活的蛋白激酶对bkca通道无激活作用，蛋白激酶抑制剂可阻断激酶介导的磷酸化过程中的重要步骤，阻断或逆转atp酶及蛋白激酶激活的效应。因此，我们认为有激活活性的蛋白激酶必须具备以下两点：（1）拥有天然构象；（2）对于激酶介导的磷酸化很重要的激酶位点必须具有调节平滑肌中bkca通道的功能。
2.2.4 磷酸酯酶的作用 如果pka及pkg通过磷酸化起作用，那磷酸酯酶可以逆转其效应。磷酸酯酶抑制剂提高了人肺动脉中bkca通道的活性。不过，由于这些通道也能被1mm的8-溴-cgmp激活，且环核苷酸依赖的激酶抑制剂可消除该效应，故磷酸酯酶抑制剂的刺激效应可归因于组织中通道相关的激酶的存在。在大部分的研究中，磷酸酯酶抑制剂如冈田酸及花萼海绵抑癌素a在平滑肌中对bkca通道活性没有直接的影响作用。但在应用蛋白激酶后加用磷酸酯酶抑制剂则能增强蛋白激酶诱导的bkca通道活性的改变。因为磷酸酯酶抑制剂不会直接影响bkca通道的活性，这些数据提示：这一效应需要蛋白激酶的预作用。另有研究显示，在应用蛋白激酶后再用磷酸酯酶可逆转其已诱导的bkca通道活性的变化。把这一结果和磷酸酯酶抑制剂的效应相结合，这些数据证明在调节平滑肌bkca通道活性方面，蛋白激酶和磷酸酯酶具有相互拮抗的作用，也进一步说明了蛋白激酶通过通道蛋白磷酸化而改变平滑肌bkca通道的活性。
3 bkca通道在子宫平滑肌收缩中的作用
3.1 子宫平滑肌的收缩性 细胞静息膜电位是由于细胞内外环境离子分布不平衡而产生的，事实上在所有哺乳细胞中，其在很大程度上由膜两边的k+、ca2+、na+、cl-的浓度所决定。人子宫平滑肌的静息膜电位分布在-45～-80mv间［15，16］，子宫的妊娠状态部分地影响了该数值的大小。子宫平滑肌组织是自然肌性的、能产生慢波活性，同样也产生简单及合成的动作电位。单个的子宫平滑肌细胞可显示出起搏活性，但异于心肌细胞的是，其活性并不局限于特殊的起搏细胞而是移动的，即任何一个细胞都可能发动一次宫缩。当分娩邻近时，静息膜电位逐渐转正（即绝对值变小）并达到产生动作电位的阈值，因而激活子宫收缩性（在大部分妊娠期是维持在静止状态的）。另外，子宫的自然结构导致了协调的同步收缩，并在分娩过程中更强有力。这种同步化促使收缩通过加强的缝隙连接网络迅速传播至整个子宫。观察到的子宫肌电活动波形的改变，特别是在足月时由静止到兴奋的转变，提示离子通道广泛的流动性及重构有助于分娩时子宫兴奋性的显著改变［17］。
3.2 bkca通道在子宫平滑肌中的分布 matharoo［18］等应用western blot方法对不同状态下人子宫平滑肌细胞bkca通道的α、β亚单位蛋白表达进行了研究，结果发现：α亚单位蛋白表达未妊娠组和足月临产组无明显差异，均明显低于足月未临产组及早产（临产及未临产）组；β亚单位临产（足月及早产）组明显低于未临产（足月及早产）组，而该四组水平又明显低于未妊娠组（p<0.01)。这同周晓波等报道的结果类似［13］。
3.3 bkca通道在子宫平滑肌收缩中的作用 在正常妊娠未临产的子宫平滑肌细胞中，提高细胞内ca2+水平导致bkca通道的激活，故能有效抵消ca2+的去极化效应，从而维持子宫肌的静息状态。伴随着动作电位过程，细胞质内游离钙离子增加。作为电压及细胞内钙离子的感受器，bkca通道被激活，从而使钾离子外流，使细胞膜在去极化后即刻复极化甚至超极化［19，20］，从而间接地降低平滑肌的收缩力。平滑肌的收缩同其电学特性密切相关，包括在不规则间歇后出现特征性的自发的峰电流，而bkca通道是平滑肌收缩的重要调控者。有证据表明，在妊娠的不同阶段，bkca通道通过改变他们的分布密度、电压激活及钙的敏感性，调节子宫平滑肌的张力［21］。bkca通道是camp及cgmp依赖性蛋白激酶所调控的重要靶体［22］。有报道表示，在妊娠及非妊娠子宫平滑肌细胞中，camp及cgmp激酶调控bkca通道的活性是不同的［23］。目前，应用膜片钳技术，用camp激酶对非妊娠及妊娠大鼠及人子宫平滑肌细胞钾通道活性的抑制及激活的研究证实了这些观察结果。
此外，有研究通过测定人子宫平滑肌的等长张力，观察到特异性bkca通道阻断剂北非蝎毒素、四乙胺（tea）及iberiotoxin可增加子宫肌收缩的频率及强度，提示部分bkca通道的平滑肌细胞静息状态下是激活的，且对组织有重要的功能性效果［24，25］。还有少量的研究探讨与分娩相关的离子通道功能的机制。在人妊娠子宫中，当分娩发生时，由于β亚单位水平的明显下降（较未临产组下降50%～75%），使bkca通道失去了对ca2+的依赖性；而如将细胞内ca2+浓度增强10倍（从50nm至0.5μm)可提高分娩前bkca通道的活性，但对分娩过程中的通道开放无效。包括tea、钡及球肽等bkca通道阻滞剂在子宫平滑肌细胞膜的内表面发挥作用也被提及。的确，tea作用于膜外向外膜片降低了bkca通道的整体导电性，其解离常数为423μm；tea对膜内向外膜片的效应导致整体电流的下降，其解离常数为46mm，表示产后的bkca通道对tea的精确敏感性。随着分娩的发生，bkca通道活性的ca2+间联系的失活可允许细胞内ca2+水平在不激活相对的k+电导的情况下上升，因此提高了ca2+作用于子宫平滑肌收缩的可能性。由于对外源性的北非蝎毒素和tea的反应并未改变，bkca通道的细胞内区域的改变是建立在分娩时通道特性短时间内提升的基础上的。在更多近期的研究中，研究者应用rt-pcr来验证bkca通道的α及β亚单位mrna是否同时存在于未临产及临产的人子宫平滑肌中［26］。在子宫平滑肌中，bkca通道α亚单位的mrna及其蛋白的变化提示了一个可能的机制，即作为通道主体的α亚单位的表达量和通道的活性成正比，借此可以解释在妊娠足月时子宫兴奋性为何增强。但由于α及β亚单位蛋白表达时达最高峰时间的不一致性，给予了我们新的研究空间：我们能否寻找到提高妊娠子宫平滑肌β亚单位表达水平的靶点，使对早产的干预成为可能？
【参考文献】
1 hamill op,marty a,neher e,et al.improved patch-clamp techniques for high-resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches.pflugers arch,1981,391(2):85-100.
2 zhou xb,schlossmann j,hofmann f,et al.regulation of stably expressed and native bk channels from human myometrium by cgmp-and camp-dependent protein kinase.pflugers arch,1998,436(5):725-734.
3 kihira m,matsuzawa k,toruno h,et al.effects of calmodulin antagonists on calcium-activated potassium channels in pregnant rat myometrium.british journal of pharmacology,1990,100(2):353-359.
4 khan rn,smith sk,morrison jj,et al.ca2+ dependence and pharmacology of largeconductance k+ channels in nonlabour and labour uterine myocytes.american journal of physiology,1997,273(5pt1):c1721-1731.
5 tanaka y,koike k,alioua a,et al.betal-subunit of maxik channel in smooth muscle:a key molecule which tunes muscle mechanical activity.j pharmacol sci,2004,94(4):339-347.
6 chanrachakul b,matharoo-ball b,turner a,et al.immunolocalization and protein expression of the α subunit of the large-conductance calcium-activated potassium channel in human myometrium.reproduction,2003,126:43-48.
7 meera p,wallner m,song m,et al.large conductance voltage and calciumdependent k+ channel,a distinct member of voltage-dependent ion channels with seven n-terminal transmembrane segments(s0～s6),an extracellular n terminus,an intracellular(s9～s10) c terminus.proceedings of the national academy of sciences of the usa,1997,94:14066-14071.
8 toro ml,wallner pm,tanaka y.maxi-kca,a unique member of the voltage-gated k channel superfamily.news physiol sci,1998,13:112-117.
9 raheela nk,stephen ks,michael lja.contribution of calcium-sensitive potassium channels to ns1619-induced relaxation in human pregnant myometrium.human reproduction,1998,13(1):208-213.
10 gregory ak,rachel mt,abdul ah,et al.modulation of potassium current characteristics in human myometrial smooth muscle by 17β-estradiol and progesterone.biology of reproduction,2001,64:1526-1534.
11 liu gx,shi jy,yang l,et al.assembly of a ca2t-dependent bk channel signaling complex by binding to b2 adrenergic receptor.the embo journal,2004,23:2196-2205.
12 alioua a,tanaka y,wallner m,et al.the large conductance,voltage-dependent,and calcium-sensitive k+ channel,hslo,is a target of cgmp-dependent protein kinase phosphorylation in vivo.j biol chem,1998,273(49):32950-32956.
13 zhou xb,wang gx,ruth p,et al.bk(ca) channel activation by membrane-associated cgmp kinase may contribute to uterine quiescence in pregnancy.am j physiol:cell physiol,2000,279(6):c1751-1759.
14 steffens f,zhou xb,sausbier u,et al.melatonin receptor signaling in pregnant and nonpregnant rat uterine myocytes as probed by large conductance ca2+-activated k+ channel activity.mol endocrinol,2003,17(10):2103-2115.
15 nakao k,inoue y,okabe k,et al.oxytocin enhances action potentials in pregnant human myometrium-a study with microelectrodes.am j obstet gynecol,1997,177(1):222-228.
16 inoue yy,nakao k,okabe k,et al.some electrical properties of human pregnant myometrium.american journal of obstetrics and gynecology,1990,162(4):1090-1098.
17 raheela nk,balwir mb,sabaratnam a,et al.uterine contractility symposium:potassium channels in the human myometrium.experimental physiology,2001,86(2):255-264.
18 matharoo bb,ashford mlj,arulkumaran ans,et al.down-regulation of the α-and β-subunits of the calcium-activated potassium channel in human myometrium with parturition.biology of reproduction,2003,68:2135-2141.
19 kaczorowski gj,knaus hg,leonard rj,et al.high-conductance calcium-activated potassium channels:stucture,pharmacology and function.journal of bioenergetics and biomembranes,1996,28:255-267.
20 林琳，郑永芳，屈金河，等.肿瘤坏死因子-α激活ecv304钙激活钾通道及g蛋白的增强效应.中国医学科学院学报,2000,22(3):232-236b.
21 song m,barila b,toro l,et al.changes of expression levels of the maxi k channel duing pregnancy.biophysical journal,1999,76:a412.
22 schubert r,nelson mt.protein kinases:tuners of the bkca channels in smooth muscle.trends in pharmacological sciences,2001,22:505-512.
23 zhou xb,wang gx,schlossmann j,et al.regulation of bkcachannels by endogenous cgmp-dependent protein kinase in excised patches from pregnant and nonpregnant human myometrium.naunyn-schmiedebergs archives of pharmacology,1999,359:r75.
24 khan rn,morrison jj,smith sk,et al.activation of large conductance potassium channels in the pregnant human myometrium by pinacidil.american journal of obsterics and gynaecology,1998,178:1027-1034.
