白菜全基因组研究论文

（一）杂交与远缘杂交

1.离体胚、胚珠和子房培养

离体胚、胚珠和子房培养是克服芸薹属植物远缘杂交障碍的常用方法。Inomata（1978）首次成功地将子房培养应用于白菜与甘蓝的种间杂种胚挽救。巩振辉（1995）通过子房培养成功地获得白菜与白芥的属间杂种。

2.原生质体融合

细胞融合避开了有性交配过程，因此不存在受精不亲和的问题。近年来，在高等植物上，体细胞杂交已有相当进展。在有性杂交不能进行时，可采用体细胞杂交获得种、属间杂种。Takeshita et al.（1980）通过甘蓝与白菜的原生质体融合，人工合成了甘蓝型油菜。体细胞融合为从亲缘关系较远或受精亲和性极低的杂交组合中获得新材料、新品种开辟了一条新途径。

3.多代连续回交

多代连续回交法对种间或属间远缘杂交克服杂种不育具有一定的效果。在回交中，至于利用哪一原亲本回交，这取决于要回交出的后代保留哪一亲本的优异遗传性状，如果回交一次不够，可连续进行第二次或第三次回交。据大白菜的有关研究，值得说明的是，回交的结实力与杂种一代和双亲类型有关。

4.诱导二倍体

由于某些远缘杂交杂种中没有同源染色体组或完整的染色体组存在，杂种完全不育。通过人工处理诱导双二倍体可以成功地克服不育性。如用秋水仙碱处理杂种幼苗可以产生双二倍体而成功地克服不育性。应该指出的是，并非所有远缘杂交Ｆ的不育性都可以通过染色体加倍而克服，只有在Ｆ的减数分裂由于来自父母本的染色体不存在同源性而不能配对，仅有极少数能配对的情况下，加倍杂种染色体数才会使杂种的育性提高。

白菜种曾进行了广泛的种间和属间杂交，Warwick，SI和（1994）在Guide to the Wild Germplasm of Brassica and Allied Crops中列出了大量的远缘杂交实例。

（二）细胞工程技术

从本世纪初以来，单倍体一直是植物育种工作者们所努力追索的目标，游离小孢子培养与花药培养均可以得到单倍体，进而形成DH植株，但与花药培养相比，用于游离小孢子培养的是分离纯净的小孢子群体，产生的胚和再生植株都来自于小孢子细胞，排除了花药壁和绒毡层组织的干扰；另一方面，利用游离小孢子培养技术能够在较宽的基因型范围内以较高的胚状体发生率获得小孢子胚和再生植株，而小孢子植株又具有自然加倍成为二倍体的特点，因此，游离小孢子培养在遗传和育种研究方面具有十分诱人的应用前景。

20世纪70年代初，Nitsch等（1973）在进行曼陀罗（Datura stramonium L.）花药培养研究的同时，建立了游离小孢子培养技术，Lichter（1982）率先在芸薹属的甘蓝型油菜（Brassica napus L.）游离小孢子培养过程中获得胚状体以及再生植株，并发现小孢子胚胎及其再生植株发生率远高于花药培养。近20年来，这项技术在大白菜育种中的应用已日趋成熟。20世纪80年代末，Sato等（1989）首先进行了大白菜游离小孢子培养。90年代初，曹鸣庆等（1992）率先在国内开展了大白菜小孢子培养。目前国内已有数家单位开展了这方面的研究工作，并且已成功应用于育种实践。栗根义等（1999；2000）应用游离小孢子培养技术育成了优良新品种豫白菜11号、豫白菜7号等。曹鸣庆等（1993）应用游离小孢子培养技术获得了抗除草剂大白菜植株等。目前，大白菜小孢子培养技术已经成为创新种质资源的常规技术，并发挥着越来越大的作用。

游离小孢子培养技术还可以用于各种抗性突变体的筛选。Akmad等（1991）通过紫外辐射诱变处理早熟油菜小孢子，得到了少量对Alternaria brassicicola抗性增强和对除草剂“CleanR”具有抗性的后代。曹鸣庆研究组曾将大白菜黑斑病（Alternaria brassicae）毒素加入培养基，结果从诱导得到的小孢子胚中筛选出了对黑斑病表现一定程度抗性的大白菜小孢子植株。

（三）基因工程技术

随着组织培养和DNA重组技术的建立和不断完善，现代生物技术在许多作物的种质创新和新品种选育中日益得到广泛应用。但是，由于大白菜组织培养难度较大，再生体系较难建立，一定程度上制约了转基因技术在大白菜育种中的应用。进入20世纪80年代之后，大白菜组织培养与高频植株再生体系逐步建立，在此基础上进行的转基因研究也取得了一定突破。

杨广东等（2002）以大白菜3d苗龄带柄子叶为外植体，经根癌农杆菌介导，将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制基因（sck）导入大白菜自交系GP-11和杂交种中白4号，并获得了卡那霉素抗性植株。PCR检测和Southern blot杂交证实，sck基因已整合进入大白菜基因组中。豇豆胰蛋白酶抑制剂活性检测表明，大部分转基因植株都对牛胰蛋白酶有一定的抑制活性，对照未转化植株抑制活性很低。室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明：转基因植株对菜青虫（Pieris rapae L.）具有一定的抗性。

朱常像等（2001）以大白菜品种福山大包头的子叶柄为供试材料，对影响大白菜植株再生和基因转化频率的因素进行了研究。在此基础上，建立了大白菜高效再生体系和有效的基因转化体系，并将芜菁花叶病毒的CP基因导入大白菜中，获得转化植株。PCR检测和Southern杂交分析证明TuMV-CP基因已整合于大白菜的基因组中；Nothern杂交分析及ELISA检测表明TuMV-CP在转录和翻译水平上进行了有效表达。转基因植株T代的遗传分析表明，外源基因在转基因植株后代遵循3：1的分离规律。抗病性测定显示，转基因植株具有明显的抗病毒侵染能力。

刘公社等（1998）利用大白菜小孢子胚状体获得抗除草剂转基因植株。用大白菜小孢子培养获得的子叶期胚状体，经粉碎的玻璃碴摩擦后，与农杆菌共培养，在加筛选剂Basta的培养基上，再生出数株绿苗，自交留种后，对其后代进行的Basta抗性鉴定显示，抗性植株的基因组中各有一个bar基因插入点，对转化株的小孢子进行再培养，后代小孢子植株对Basta抗性的分离比显示此转基因为杂合体。

1.白菜基因组大小

目前，基因组大小只能通过有关的方法进行估算，常用的方法是孚尔根显微密度测试法和流动细胞仪测定法。一般认为，白菜的单倍体基因组大小为550Mbp。

2.特异性状分子标记

Williams（1995）利用大白菜的一个快繁群体构建了一些形态学性状的分子标记，如控制开花早晚、叶色、花色等基因的分子标记。不过这些性状均属质量性状。随着分子标记图谱的构建，人们陆续获得了一些数量性状的分子标记，如叶和茎的植物学性状的QTL、与开花有关的QTL、根肿病抗性的RAPD标记、黑胫病抗性的QTL等。

郑晓鹰等（2002）采用单粒传的方法从大白菜耐热品种177和热敏感品种276杂交后代获得遗传性稳定的重组自交系群体，并以此为材料用同工酶以及RAPD和AFLP分子标记技术鉴定了与大白菜耐热性数量性状相关的遗传标记，共9个与耐热性QTL紧密连锁的分子标记，包括5个AFLP标记，3个RAPD标记和1个PGM同工酶标记，这些标记对耐热性遗传的贡献率为。9个标记中有5个分布在同一连锁群上，其他4个标记与任何一个标记无连锁关系，表明上述9个标记分布在大白菜的5个连锁群上。

张凤兰等（2003）运用RAPD标记，在大白菜的小孢子培养DH系群体中采用BSA法进行了分子标记研究，找到了一个与橘红心球色基因连锁的分子标记OPB01-845，其遗传距离为。

孙日飞等（2004）以抗病自交系Brp0058和感病自交系Brp0181杂交后代的F2分离群体为试材，采用分离群体分组分析法（BSA），筛选2个与TuMV感病基因紧密连锁的AFLP分子标记，利用MAPMAKER/EXP作图软件统计，其遗传距离分别为和。

3.分子标记连锁图谱

分子标记连锁图谱为进行植物基因组的结构分析和比较提供了有力工具。较高密度的分子图谱已有效地应用于数量性状的基因定位、比较基因组学研究和分子标记辅助育种等研究中。Song等（1991）以结球白菜Michili和Spring broccoli杂交的F群体为材料构建了第一张RFLP图谱。Ajisaka等（1995）用白菜品种间的组合，开展了白菜RAPD分子图谱的研究，该图谱包括115个RAPD标记和2个同工酶标记，覆盖基因组长度860cM。Matsumoto等（1998）构建了结球白菜的遗传图谱，该图谱包括63个RFLP标记，覆盖基因组长度735cM。张鲁刚等（2000）等报告，以芜菁和结球白菜杂交获得的F群体，构建中国第一张白菜RAPD分子图谱。于拴仓等（2003）利用不同生态型的大白菜栽培种高代自交系177和276杂交获得的102份F重组自交系，其中177来自早熟、耐热、圆球形品种白阳，276为晚熟、热敏中高桩叠包类型。通过对AFLP和RAPD两种分子标记进行遗传分析，构建了包含17个连锁群，由352个遗传标记组成的大白菜连锁图谱，其中包括265个AFLP标记和87个RAPD标记。该图谱覆盖基因长度，平均图距。

张凤兰等（2005）以大白菜高抗TuMV白心株系912112和高感TuMV橘红心株系T12219为亲本建立的小孢子培养DH系作为图谱构建群体，构建了包含10个连锁群、406个标记位点的分子连锁图谱，图谱总长度82613cM，标记间的平均图距为210cM，连锁群数目和染色体数相等。每个连锁群上的标记数在7～111个之间，连锁群的长度在2614～15611cM的范围内，平均图距在110～318cM之间。该连锁图谱包括246个AFLP标记、135个RAPD标记、11个SSR标记和12个同工酶标记、1个SCAR标记和1个形态标记。

王晓武（2005）等以大白菜汴早-26和光90E16的F代进行游离小孢子培养所获得的含有59个株系的DH群体为试材，利用AFLP技术通过63对引物筛选共获得346个AFLP多态性标记，运用JoinMap 310软件构建大白菜遗传连锁图谱。该图谱主要包括10个连锁群，总图距为708cM，平均图距为210cM。

4.遗传多样性和物种亲缘关系

遗传多样性的研究有利于种质资源的鉴定和保存、蔬菜起源与进化的深入研究以及杂交亲本的选择。漆小泉等（1995）进行了大白菜和紫菜薹自交系染色体组DNA的RAPD研究，探讨了该技术应用于蔬菜遗传多样性研究的可行性。陈云鹏等（1999）对芸薹属蔬菜基因组进行了RAPD初步分析，并就RAPD-PCR反应条件进行了探讨，结果表明，各个亚种或变种的品种之间存在丰富的遗传多样性，利用37个随机引物将芸薹类（2n=20）蔬菜作物的33个品种分成8个类群，印证了形态分类的正确性，并对形态分类作了进一步完善。宋顺华等（2000）采用RAPD技术分析了21个大白菜主栽品种，用13个引物共扩增出87个可重复的DNA片段，其中39条带具多态性。引物OPE01可区分15个大白菜品种，再与引物POH03、OPH12配合可将21个大白菜品种区分开。

大白菜基因组怎么设计引物：1. 提取大白菜基因组dna;2. 用大白菜黄子叶基因bryc连锁的分子标记引物ssr280 ‑3‑ 1、ssr06 ‑ 29、ssr280 ‑ 21、ssr280 ‑ 23、ssr280 ‑3. 再将pcr扩增产物电泳检测。

大白菜虽然起源于我国，但它既不象韭、姜、蒜等蔬菜，在古典文献上可以找到悠久确实的记录，也不象有些原产于中国的蔬菜，在山川野间仍有原始的野生种类可寻。遍览古籍，元代以前并无关于大白菜记载的典籍。根据考证，我国大白菜的历史较短，自元代以后历经明清两朝，迄今约七、八百年，农学家对大白菜深入研究的结论是：它是由南方的小白菜和北方的芜菁天然杂交演化而来的。因此，要探究大白菜的来历，必须从小白菜和芜菁的源头说起 大白菜个大体壮、物美价廉、营养丰富，令人久吃不厌。它一经问世，备受人们喜爱。元代忽思慧在《饮膳正要》中写到：“白菜，味甘，温，无毒。主通肠利胃，除胸中烦，解酒毒。”明朝王世懋对大白菜很赏识，认为是蔬菜中的神品。清朝吴其睿说北方大白菜运到南方之后：“竞相争购、味胜于肉，不胫而走。”王士雄在《随息居饮食谱》中记载品评吃大白菜的好处说：“甘平养胃，荤素皆宜，味胜珍馐。”清史学家柯劭