chip发表研究论文

染色质免疫沉淀后测序( ChIP seq )是一种针对DNA结合蛋白、组蛋白修饰或核小体的全基因组分析技术。由于二代测序技术的巨大进步，ChIP-seq比其最初版本ChIP-chip具有更高的分辨率、更低的噪声和更大的覆盖范围。随着测序成本的降低，ChIP- seq已成为研究基因调控和表观遗传机制不可或缺的工具。 原理：甲醛处理细胞使目标蛋白与DNA交联，通过超声波将交联后的染色质打断成小片段，一般在200-600bp范围内。再利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。最后，去交联并对纯化后DNA进行PCR扩增，高通量测序，最后与已有基因组序列进行比对，以确定    DNA与蛋白质结合的序列。 问题分析： 1.甲醛交联对后续结果分析的影响？ 自从Orlando V等人首次发明了ChIP技术，十几年后核心步骤仍无大变化。然而，ChIP-seq技术实际存在一定 的缺陷，例如甲醛交联 。甲醛虽然是一种高度渗透的交联剂，但由于其反应活性仅限于胺，因此其交联效率较低；对哺乳动物细胞而言，其最大交联效率仅为1%。因此甲醛交联细胞所需的起始量很大，也因此该技术也很难适用于微量细胞及单细胞样本。牛津大学出版社发表的文章In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis指出，某些蛋白质如：阻遏蛋白，NF-κB等无法通过甲醛交联到DNA上，研究表明；在DNA上的停留时间短于5秒的蛋白质无法用甲醛交联。其次，甲醛会导致许多其它无关蛋白质交联到DNA上，影响后续分析数据。有报道称，甲醛交联会触发DNA损伤应答机制，从而改变染色体组分，进而使ChIP结果产生偏向性。除此之外，由于交联反应在加热和低PH的情况下会发生逆转，因此DNA蛋与白质的交联复合物的稳定性也是一个值得关注的问题。因此，甲醛究竟在多大程度上能反应细胞内蛋白质的分布仍不能确定。 根据有无甲醛交联步骤可以把CHIP技术划分为两种类型，一类是存在甲醛交联的ChIP，即X-ChIP（cross-linking and mechanical shearing ChIP）；另一类是无交联存在的ChIP，即N-ChIP（native-ChIP）；相较于X-ChIP，N-ChIP技术有一系列的优点，包括：高分辨率（MNase的使用使得染色体的片段化可以小至核小体）、避免了甲醛交联带来的非特异性蛋白在DNA上的富集、避免了甲醛交联对抗原表位的遮盖、步骤的减少降低了样品的损失等。然而，由于使用了MNase，N-ChIP只适用于研究组蛋白修饰，大部分情况下不能用于转录因子的研究。 2. 超声波打断和酶断裂方法的比较？ 酶类：  最常用的酶类如 MNase ，即：微球菌核酸酶，是一种能降解核小体连接区的DNA序列的核酸酶，最初从金黄色葡萄球菌中分离出来。MNase消化染色质可以释放出一个个独立的核小体。 MNase酶解法具有一定的局限性，首先，MNase对于偏向于切割A/T碱基位点，导致核小体在A/T富集区域的表达量低于真实情况；其次，MNase不能在核小体边界精确切割，这导致在确定染色质的开放位置与真实情况存在差异；而且，MNase偏向于消化脆性核小体。在不同物种的实验证据表明，脆性核小体占据了基因启动子和转录终止位点，而脆性核小体只在MNase浓度较低且消化时间较短的情况下才能被检测出来，因此很难将脆弱核小体量化到稳定核小体的相对丰度。 超声打断则不如酶裂解法温和，而且由于打断的不均匀性，导致测序结果背景噪音高，影响后续数据分析。由于文章篇幅限制，在此不多赘述。 那么究竟选择酶解还是超声打断，需要视 情况 而定。可参考以下建议： 如果所研究的蛋白质高丰度表达且与DNA结合紧密如组蛋白，那么样本无需需交联，这时可使用酶解法。 如果所研究的蛋白质表达丰度较低或与DNA结合不紧密如转录因子等，往往需要用交联试剂将样本进行固定，稳定蛋白质和DNA的形态，这时最好选用超声法进行断裂。 拓展： 适用于微量细胞水平的ChIP技术及其原理 1）CUT-Tag技术： CUT-Tag可同时用于研究转录因子结合位点以及DNA的开放性。可在一天之内完成从细胞到建库完成的所有步骤，且具有高分辨率，低噪音等特点。起始细胞用量可低至50个。[1] 原理：利用抗原抗体特异性反应，加入特异性抗体与染色体上目标蛋白结合，加入二抗与该抗体结合以募集更多的pA-Tn5转座酶复合物至目标蛋白与DNA序列的结合位点上，转座酶复合物切割该染色质开放位点，并在切割后的DNA片段两端加入接头，文库构建完成，可直接进行后续测序，与已有基因组序列比对，即可知道目标蛋白与DNA的结合位点。 2）ChIL-seq： ChIL（chromatin integration labelling），即染色质集成标签技术，可同时用于研究转录因子结合位点以及DNA的开放性，起始细胞用量为100-1000个细胞。ChIL-seq 避免了传统ChIP-seq技术中由于抗体沉淀所带来的回收率低的缺陷，尤其适用于贴壁细胞。对于活跃的组蛋白标记如H3K4me3 ，H3K27ac，起始细胞用量甚至可降低至单细胞水平。[2] 原理：在96孔板中加入细胞，经固定，染色后加入一抗与目标蛋白结合，随后加入ChIL探针（由二抗和ChIL DNA组成），探针中的ChIL DNA经Tn5转座酶整合到目标蛋白所在基因组DNA附近，随后T7 RNA 聚合酶经ChIL DNA中的启动子启动转录，以此处基因组DNA为模板合成RNA，经DNase I消化和裂解释放RNA，以纯化的RNA建库测序。 3．Drop-ChIP: Drop-ChIP:使用了特定的微流控装置，分辨率可达到单细胞水平。该技术不仅可以在单细胞水平研究转录因子结合位点及组蛋白修饰，还可以从细胞特异性角度研究不同细胞间染色质的变异程度。我们认为，整合单细胞染色质和单细胞表达数据，可以使调控元件与靶基因更精确地耦合，并更深入地了解它们的功能动力学和关系。[3] 原理：首先，将待研究的细胞与裂解液，MNase混合进行染色质消化，另外设计一个包含很多种不同接头的液滴，在微流控装置上反应，使得每一个细胞液滴与一种接头液滴混合，同时与含有DNA连接酶的buffer液滴混合。这个过程中，接头序列自动连接到裂解的染色质片段两端，进而进行细胞裂解，使用特异性抗体对目标蛋白进行沉淀，对富集后的DNA进行测序。与已有基因组序列比对即可知道目标蛋白作用位点。 [1]. 1: Kaya-OkurHS, Wu SJ, Codomo CA, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, Ahmad K,Henikoff for efficient epigenomic profiling of small samples and singlecells. Nat Commun. 2019 Apr 29;10(1):1930. [2]. Harada A,Maehara K, Handa T, Arimura Y, Nogami J, Hayashi-Takanaka Y, Shirahige K,Kurumizaka H, Kimura H, Ohkawa Y. A chromatin integration labelling method enablesepigenomic profiling with lower input. Nat Cell Biol. 2019 Feb;21(2):287-296. [3]. Rotem A, RamO, Shoresh N, Sperling RA, Goren A, Weitz DA, Bernstein BE. Single-cellChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotechnol. 2015Nov;33(11):1165-72

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcriptionfactor,TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％（培养基共有9ml）。2、37摄氏度孵育10min。3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为。450 ul 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。7、超声破碎：VCX750，25％功率，冲击，9S间隙。共14次。（二）、除杂及抗体哺育。8、超声破碎结束后，10，000g 4oC离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于-80oC。300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为），65oC处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。10、1h后，在4oC静置10min沉淀，700rpm离心1min。11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。（三）、检验超声破碎的效果。取100ul超声破碎后产物，加入4ul5MNaCl，65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。第二天：（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。12、孵育过夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。13、4oC静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4oC颠转10min，4oC静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。洗涤溶液： salt wash buffer-one wash buffer-one wash buffer-one buffer-two wash15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10％SDS，100ul1MNaHCO3，800ulddH2O，共1ml。每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为）。混匀，65oC解交联过夜。第三天：（一）、DNA样品的回收17、解交联结束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37oC孵育1h。18、每管加入，（），2ul10mg/ml蛋白酶K。45oC处理2h。19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。（二）、PCR分析

染色质免疫共沉淀技术是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来的技术。

这项技术主要用来分析目标基因有没有活性、或者分析一种已知蛋白（转录因子）的靶基因有哪些。该技术主要应用于以下几方面：

1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

2.转录调控分析

3.药物开发研究

4.有丝分裂研究

损失与凋亡分析

扩展资料：

实验步骤：

1、细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。

值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2、染色质断裂

交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。

所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

技术应用：

1、Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。

因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。

2、染色质免疫沉淀的DNA适用于多种分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要验证的，可采用狭缝杂交（Slot blot）的方法，把靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交，来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。

还可以根据靶序列设计引物，用半定量PCR的方法进行测定，或采用Real-time PCR方法进行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可采用Southern杂交。但因为免疫沉淀的DNA量较少，所以在研究时通常要用PCR方法扩增DNA探针，再进行整个基因组扫描。

还可以把沉淀的DNA克隆到载体中，进行测序，寻找该序列附近的开放阅读框，发现新的基因调节序列。

3、目前，随着人类基因组测序工作的基本完成，研究目的蛋白和整个基因组的相互作用逐渐成为研究的热点。由于基因组中的信息量非常大，上述常规方法通常无法满足科研的需要。近年来发展起来的ChIP-chip技术将基因组DNA芯片（chip）技术与染色质免疫沉淀技术（ChIP）相结合，为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。

ChIP-chip 技术通过标记染色质免疫沉淀富集的DNA片段，和另一个被标记不同探针的对照组样品一起，与DNA芯片杂交，再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析，具体的实验步骤请参考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。

ChIP-chip技术已经被广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络，染色质修饰机制在基因组中的调控，DNA的复制，修复以及修饰，基因的转录与核运输等诸多方面。

4、染色质免疫沉淀技术还可用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀，从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。

值得注意的是，因为通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少，所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。

5、随着染色质免疫沉淀技术受到广泛的关注，运用该技术发表的文章也逐渐增多，大家越来越多的开始关注如何改进ChIP的方法。Millipore最新推出的Magna ChIP试剂盒，利用磁珠分离DNA-蛋白-抗体复合物，提高了ChIP的效率，简化了操作的过程，缩短了实验的时间，还为同时进行多个目的蛋白的研究提供了可能，是经常使用ChIP技术的研究人员的理想选择。

6、近年来ChIP技术也被用于研究RNA-蛋白的相互作用，其原理与DNA类似，也包括甲醛固定，超声波破细胞，免疫沉淀，交联逆转，RNA纯化和RNA鉴定等步骤。所不同的是，交联逆转只用Proteinase K，要进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理，分析时用RT-PCR，芯片杂交要用cDNA芯片等。

参考资料：百度百科-染色质免疫共沉淀

与传统的EMSA技术相比，基于体内分析而发展的染色质免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay kit,ChIP）技术能更加真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。该技术主要应用于：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 损伤与凋亡分析。 Upstate公司最先开发出步骤优化简捷的商业化ChIP分析试剂盒，保证实验的准确性和可重复性，同时Upstate提供广泛可行的ChIP级别应用抗体。ChIP基本试剂盒和特定蛋白质ChIP级别应用抗体结合完成一个完整的染色质免疫沉淀分析。 ChIP技术的作用原理： 甲醛处理使蛋白质与DNA交联； ChIP基本试剂盒组分：ssDNA/Protein A agarose ssDNA/Protein G AgaroseChIP Dilution BufferLow salt wash bufferHigh salt wash bufferLiCl Wash BufferTE EDTA5M NaCL1M Tris-HCl, pH Lysis Buffer（以上各组份也可分别购买） 超声波将染色质打断成一定大小； 通过抗体沉淀蛋白质-DNA交联复合体； 解除交联，纯化DNA； PCR确定和DNA结合的蛋白量；