显微技术论文参考文献

过去，科学界不断努力向「微观」世界探索，研发更新、测量尺度更精细的仪器。而今年六月，史丹佛大学的研究团队在分子显微影像技术上有了新的突破，让 DNA 内的小分子结构与动态都能在奈米级的尺度里「一览无遗」。

十七世纪光学显微镜问世，带领科学界进入微生物的殿堂，但由于阿贝绕射极限 (Abbe diffraction limit)，使光学显微镜的解析度仅能达到光波长的一半，约 微米 (µm)，即 200 奈米 (nm)。而且也只能针对整体细胞做观察，难以缩小到个别分子。到了二十世纪电子显微镜的发明，让解析度可达到 奈米，但却必须在真空的状态下进行。后来，威廉・莫纳 (William E. Moerner)、艾瑞克･贝齐格 (Eric Betzig)、史蒂芬･海尔 (Stefan W. Hell) 三人共同发明超解析度萤光显微技术 (super-resolved fluorescence microscopy)，运用单一萤光分子的特性克服光学显微镜的物理限制，也摆脱电子显微镜无法观察活体样本的缺点，获得 2014 年诺贝尔化学奖。

虽然单分子显微影像技术能透过染色的萤光分子来观察 DNA 链，但直到现在，还是很难知道这些分子的移动模式以及染剂附着在 DNA 上的牢固程度，而这些都会影响观测 DNA 分子结构的品质。因此，史丹佛大学的研究人员从单分子显微影像技术 (single-molecule microscopy) 作延伸，使科学家得以观察到奈米等级的 DNA 分子结构。

由威廉・莫纳 (William E. Moerner) 带领的史丹佛大学研究团队，将单分子显微影像技术作改善，结合超高解析度显微影像技术 (super-resolution microscopy) 和单分子顺向性 (single-molecule orientation) 的即时侦测，深度观察 DNA 分子间的细微互动，研究成果发表于今年六月的《光学》(Opitca) 杂志。由于 DNA 碱基可控制小分子的移动，所以从小分子的位移资讯就可推测 DNA 碱基的局部构造。莫纳博士表示这项新技术可以帮助我们观察到这些小分子是要向左旋转，还是向右旋转，「如果没有这些旋转、位移的讯息，我们看到的成像就会只是一个点。」莫纳博士表示。

研究团队在单分子显微影像技术里，让萤光染剂附着于 DNA 的分子上，以观察这些小分子的方位和移动模式 。其中一位研究人员 Adam S. Backer 博士找到取得这些小分子的移动方向与旋转动力的简易方法，让研究人员得以观察这些萤光小分子是如何排列组合成 DNA 结构，并透过测量这些萤光分子的移动与旋转程度，来深入了解它们「卡位」的过程。

这项新技术比起过去「取整体分子方位的平均值」的方法，更能提供精确的讯息，也比一次只能分析单一分子的共轭焦显微镜 (confocal microscopy) 来得有效率，甚至连亮度较低的分子也能掌握其中。对于观测 DNA 整体的构型变化，或针对特定区域(即染色分子)的方位变化，甚至是现今当红的体学 (oimcs) 研究，有了这项新技术的辅助，将能更深入探索 DNA 与蛋白质的小分子之间的微小变化，并有望解开疾病的致病机制。

参考文献： 1. Adam S. Backer, Maurice Y. Lee, and W. E. Moerner . Enhanced DNA imaging using super-resolution microscopy and simultaneous single-molecule orientation measurements (2016) Optica , doi: 2. 萤光显微镜在生物学上的应用： 4. 光学显微镜如何变成奈米显微镜： 5. genomeweb/geic-research/new-dna-imaging-technique-boasts-nanoscale-resolution 6. genengnews/gen-news-highlights/new-imaging-technique-can-espy-dna-s-secret-handshakes/81252852/

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三扫描探针显微技术(SPM)的基本原理及应用 SPM实际上是一个很大的家族,是在扫描隧道显微镜(STM)发明取得巨大成就的基础上发展起来的各种新型显微镜.它们的原理都是通过检测一个非常微小的探针(磁探针、静电力探针、电流探针、力探针),与样品表面的各种相互作用(电的相互作用、磁的相互作用、力的相互作用等),在纳米级的尺度上研究各种物质表面的结构以及各种相关的性质.1. STM的发明是利用了电子隧道效应,即当两个电极之间距离很近为S时,如外加一个很小的偏压Vb,电子就会穿过电极之间的能量势垒,从一个电极流向另一个电极,电子穿过势垒的效应称为隧道效应.S应该很小,才能起到这种粒子波动性质的量子效应.例如,实验中把一个金属的尖端作为一个电极,用样品的表面作为另外一个电极.当把两个电极之间的距离调到小于1nm时,外加一个很小的偏压,电子就会通过针尖穿过势垒流向另一个电极表面(样品),即产生了隧道电流. 若控制电极与样品表面隧道电流做到恒定时,针尖与样品之间距离就该不会变,在扫描过程中,针尖会随着样品表面的起伏而起伏.如针尖足够尖,就可能分辨出单个的原子;如针尖沿X、Y平面方向扫描,就会得到样品表面数据和表面原子的分布,这就是扫描隧道显微镜(STM),也是扫描探针显微技术(SPM)的基本原理.通常扫描隧道显微镜的针尖与样品表面的距离非常接近(大约为至),所以它们之间的电子云互相重叠.在它们之 间施加一偏置电压Vb= 2mV~2V时,就会形成隧道电流.此隧道电流I可以表示为 I ∝Vbexp(-kφ1/2s), 式中 k=常数,在真空条件下为≈1; φ为针尖与样品的平均功函数;s为针尖与样品表面之间的距离,一般为∽. 由于隧道电流I与针尖和样品表面之间的距离s成指数关系,所以电流I对针尖和样品表面之间的距离变化非常敏感.例如,若此距离减小仅仅,隧道电流I将会增加10倍;反之,如果此距离增大,隧道电流I就会减少10倍. 若想达到类似STM的功能,主要须配置:(1) 通过一个压电陶瓷管,很精细地控制空间三维的扫描;(2) 配合一套简便的系统,通过一个电子反馈系统把数据用计算机采集起来,然后转化成图像直接显示出来.2. 原子力显微镜(AFM),是在STM基础上发展起来的,这是因为STM只能在导电材料的样品表面上,分辨出单个的原子及结构的三维图像.对于非导电材料,STM将无能为力.为了弥补STM的不足,1986年宾尼、夸特、格勃发明了原子力显微镜(AFM),它的许多原件与STM是共同的.AFM与STM的主要不同点是: AFM采用了极其敏感的,易弯曲的微悬臂针尖代替了STM的 隧道针尖,并以探测悬臂的微小偏转代替了STM中的探测微小隧 2--2道电流.正是由于AFM工作时不需要探测隧道电流,所以它可以用于分辨包括绝缘体在内的各种材料表面上的单各原子,,应用范围比STM更为广泛3. 扫描探针显微技术(SPM)的特点(1) 具有原子级的高分辨率STM的横向分辨率可达到,垂直表面方向分辨率可达,这是目前所有显微技术当中分辨率最高的.(2) 可以观察单个原子层的局部表面结构STM观察的是表面的一个或两个原子层,即几个纳米的局域信息,而不是像光学显微镜和电子束显微镜只能获得平均信息.(3) STM配合扫描隧道谱(STS),可以得到表面电子结构的有关信息,可以通过调节隧道结偏压来观察不同位置电子态密度分布,观察电荷转移的情况,还可以得到电子结构的信息. (4)STM可以实时、实空间地观察表面的三维图像 STM可以用零点几秒钟时间采集一幅实空间图,在一个位置上连续记录,可以观测到原子表面扩散、迁移的过程.而不像其他,例如各种衍射方法所得到的只是倒易空间的图像,不是实空间的,而且只有进行”傅里叶变换”才能得到实空间图像.(5)STM可以在不同条件下工作,例如真空、大气、常温、低温、高温、熔温,不需要特别的制样技术,而且探测过程对样品无 2--3 损伤.能在缓冲溶液中接近自然状态下观测,为直接观察生物样品的表面结构提供了可能,并且可以在高温下观测样品否发生相变或 晶畴的移动等,因而扩展了研究对象的范围.(6)STM不仅可用于成像,还可以对表面的原子、吸附的原子或 分子进行操纵,从而进行纳米级加工,这是其他技术所不具 备的一种功能.4. 影响扫描探针显微技术质量的几个关键(1) 关于震动的影响:一般地面震动是在微米量级,可是要产生稳定的隧道电流,针尖和样品间必须小于1nm.微小的震动就会使针尖闯上样品,甚至难以严格控制它在精细的位置上扫描,所以要尽量减少震动.(2) 噪音的影响:因为产生的电流是纳安级的,要取得原子分辨率(约),必须控制针尖,以实现扫描,要求仪器本身稳定,隔绝电子噪音.(3) 针尖的要求:如果针尖很钝,就不可能探测到单个的原子,达不到原子分辨率,所以针尖必须很尖.一般要求具有纳米尺度,要求高水平的微加工技术.(4) 样品的要求:STM工作时需要产生隧道电流,所以要求样品必须是导体或半导体,否则就不能用STM直接观察.原子力显微镜(AFM)可检测非导体,但要求样品粘度不能过大,否则针尖扫描时就会拖着样品一起动,达不到高的分辨率. 编 后 记 人类已迎来了肉眼可直观原子图像,甚至可移动、提取、放置、操纵单原子等技术,为纳米世纪的来临和洞察纳米世界物质本质做出了伟大贡献.这是先辈有特殊贡献的科学家,例如德国的埃贝、海仑、霍尔茨、蒲许、克诺尔、鲁斯卡、克劳塞、穆勒以及西门子公司的蔡司光学工厂和美国IBM公司的宾尼、罗雷尔,还有一些未予记载国籍和名称的科学工作者的辛勤劳动成果.经过从十七世纪到十九世纪漫长时间的探究、追求、观察、推理、研制、实验、失败、成功等等经历,而获得的各阶段的伟绩.目前,如STM、AFM等显微镜已在各国科研部门逐步使用,正为各行各业的科技进步、创新活动做贡献.我国的一些科技工作者也已在不多的公、私研究单位、学校、工厂、企业的新产品中注入了纳米级的材料和技术,也会逐步接触和应用STM、AFM,以获得更高层次的产品.