生物酶论文参考文献

郑承纲 李宗田 张汝生

（中国石化石油勘探开发研究院，北京 100081）

摘 要 针对中低温油藏压裂破胶施工的需求，筛选出生物破胶酶生产菌株——地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BG1，通过两水平试验设计确定了该菌株产酶培养基中的显著因素（碳源、有机氮源和无机氮源），在此基础上，又通过中心法则试验设计对该菌株的产酶培养基组成做进一步优化，最终确定了发酵培养基组成为4.08g/L碳源，11.74g/L有机氮源，5.22g/L无机氮源，2g/L磷源，1.0g/L硫源，0.05g/L微量元素。采用该优化培养基，BG1菌株的生物破胶酶产量达239 U/L。该菌株所产生物破胶酶拥有良好的稳定性，在低于50℃中温浴6h，酶活力保持率可达85％以上，同时该酶对非极端pH条件、常规地层离子和化学助剂亦表现出良好的稳定性。通过对该酶破胶性能进行研究，发现该酶在中、低温环境下破胶效果好，30 ～60℃温度下破胶后的压裂液黏度分别为11.1cp、2.23cP、1.97cP和4.65cP，破胶返排后地层伤害小，模拟实验伤害率仅为11.37％，体现了该生物破胶酶在中、低温油藏压裂施工中的良好应用前景。

关键词 地衣芽孢杆菌 生物破胶酶 中低温油藏 稳定性 破胶效能

Production of Enzymatic Gel Breaker and Its

Gel Breaking Potential Evaluation

ZHENG Chenggang，LI Zongtian，ZHANG Rusheng

（Exploration and Production Research Institute，SINOPEC，Beijing 100081，China）

Abstract In order to fill the fracturing gel breaking demand in those moderate－/low－temperature reservoirs， Bacillus licheniformis BG1 was selected for the production of enzymatic gel breaker（EGB）.The significant variables in the EGB fermentation medium were identified as carbon source，organic nitrogen and inorganic nitrogen source by two－level factorial design and were further optimized through full－factorial central composite design.The optimal composition of EGB fermentation medium was 4.08 g/L carbon source，11.74 g/L organic nitrogen，5.22 g/L inorganic nitrogen，2 g/L phosphorus source，1.0 g/L sulfur source，0.05 g/L trace elements and the maximum EGB production yield was 239U/L.The EGB produced by B.licheniformis BG1 exhibited good thermostability that after incubation at a temperature below 50 ℃for 6 h，the residual activity was still above 85％ retention rate.The enzymatic breaker also showed a good stability withthe non－extreme pH conditions，conventional ion formation and chemical additives.The viscosities of broken fracturing fluids were 11.1 cP，2.23 cP，1.97 cP and 4.65 cP at a temperature ranging from 30℃ to 60℃，respectively.EGB operation caused little damage to the formation that the damage rate was merely 11.37％ in the physical simulation experiment.Based on the results from this work，the enzymatic gel breaker presents a good prospect in the hydraulic fracturing.

Key words Bacillus licheniformis；enzymatic gel breaker；moderate－/low－temperature reservoirs； stability；gel breaking efficiency

水力压裂是油气井增产、注水井增注的一项重要技术措施，全国压裂措施工艺每年达上万井次，年增油近千万吨。其过程是用压裂泵组将压裂液以高压力压开地层，形成裂缝；并用支撑剂支撑裂缝，增加导流能力、减小流动阻力，是一种增产、增注措施。压裂液的性能是影响压裂施工成败的关键因素，压裂液的破胶效果直接影响压裂液的反排和增产效果，破胶失败或者不理想会造成严重的地层伤害。根据低渗透储层的特点，利用核磁共振技术及岩心流动试验进行了压裂液伤害机理研究，结果表明：压裂液黏滞力和大分子基团滞留是造成伤害的主要因素。因而提高破胶效果，降低压裂液的黏滞阻力，是解决压裂液伤害的一个重要办法［1，2］。

大多数水基压裂液所使用的稠化剂为（变性）胍豆胶，压裂作业中常用化学（氧化型）破胶剂为过硫酸钾、过硫酸铵等，其优点是价格低、使用方便、破胶迅速、破胶液黏度在10mPa·s以下。但在实际应用中，氧化破胶剂存在着一些缺陷，包括：(1)反应时间及其活性主要依赖于温度，温度低于50℃时，反应很慢，必须添加低温催化剂，而高于93℃时降解反应发生很快，反应不易控制，反应迅速，使压裂液提前降解而失去输送支撑剂的能力，甚至导致压裂施工失败；(2)它属于非特殊性反应物，能和遇到的任何反应物如管材、地层基质和烃类等发生反应，易生成与地层不配伍的污染物，造成地层伤害；(3)作用时间短，氧化型破胶剂往往在到达目的裂缝前消耗殆尽，达不到有效破胶的目的；(4)反应不彻底，造成胍豆胶不能完全降解，约20％的分子量大于2.0×106的聚合物基本上未降解，并产生大量残渣。而生物破胶酶是具有高催化能力和很好活性的生物蛋白，它在催化反应时自身的形态和结构不发生改变，其反应特异性决定了其专一性分解多糖聚合物结构中特定的糖苷键，并将其降解为单糖和二糖，这些特异性的生物破胶酶主要有Beta－1，4甘露聚糖酶、Beta－甘露糖苷酶和Alpha－半乳糖苷酶等。研究表明，化学破胶剂破胶后的聚合物分子量为（1.0～3.0）×105Da，而生物酶破胶方法后的胶液分子量仅为2000～4000Da，其破胶性能大大高于氧化型破胶剂，压裂后无残渣，返排效果好［3］。同时，生物破胶酶主要应用于30～60℃的油藏，有效弥补化学破胶剂在中、低温油藏应用中的瓶颈问题（如反应缓慢、需要添加催化剂、破胶难以控制）［4～6］。本文对新型压裂液生物破胶酶进行了研究，优化了其发酵生产条件，并对其破胶性能进行了相关分析。

1 生物破胶酶的发酵生产和纯化

1.1 菌种、培养基和发酵条件

本研究中所用生物破胶酶生产菌株为本实验所保存菌种BG1，分离自某油田原油污染土样，经16SrDNA序列分析和生理生化反应鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），菌株保存于－80℃冰箱甘油管（20％，v/v）中，使用前经固体培养基进行活化后作为接种物。

种子液培养采用LB培养基，其组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，pH＝7.0～7.2；经响应面法优化后的发酵培养基组成为：4.08g/L碳源，11.74g/L有机氮源，5.22g/L无机氮源，2g/L磷源，1.0g/L硫源，0.05g/L微量元素。接种浓度为2.0％，接种后的培养物置于37℃摇床中在转速180rpm条件下培养48h。

1.2 酶活力的测定

本研究中破胶酶的酶活力检测采用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法），分别以0mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL和10mg/mL浓度的还原糖溶液作为反应物制作标准曲线。将发酵结束后的菌液于4℃下转速为8000rpm离心10min，去除菌体，取上清液作为粗酶液，以0.6％浓度胍豆胶溶液作为底物进行水解反应，反应条件为50℃温浴中反应10min，检测反应物中还原糖的浓度。1个酶活力单位（U）定义为：在50℃温浴条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量［7］。

1.3 破胶酶发酵生产的优化

为了获得高产量的生物破胶酶，在菌株最佳培养的基础上，对发酵培养基组成进行优化。首先将破胶酶发酵生产中的碳源、有机氮源、无机氮源、磷源、硫源和微量元素，作为培养基优化实验中的6个试验因素（X1—X6），通过两水平试验设计（Two－level factorial design）筛选其中的显著因素，进而对显著因素的浓度进行进一步优化。本实验中，因素的两水平包括正效应（＋）和负效应（－），正效应的因素均取高值，负效应的因素均取低值，通过使因素同时朝响应值增大的方向变化，找出峰值，从而确定逼近最大响应区域的水平值，并把对响应值影响较大的因素（F＜0.05，置信度95％）作为显著因素［8］。

两水平试验设计及其响应值如表1所示，通过对实验结果进行分析发现，对破胶酶的生产有显著影响的因素为碳源（99.90％）、有机氮源（99.51％）和无机氮源（95.11％），而磷源（10.52％）、硫源（32.27％）和微量元素（33.11％）对发酵液酶产量影响较小。6个试验因素中，碳源、有机氮源、无机氮源和磷源对破胶酶的发酵生产均呈现负效应，而硫源和微量元素对破胶酶的合成呈现正效应。将碳源、有机氮源和无机氮源3个显著因素分别作为自变量（A、B和C），采用中心法则试验设计（central composite design）对影响破胶酶发酵生产的底物浓度水平进行优化。中心法则试验设计共包括20组实验，其中交互试验23组、中心点6组和边际点6组，每一自变量的5个试验水平分别以－1.68、－1 、0、＋1和＋1.68进行编码［9］，如表2所示。

表1 两水平试验设计及其响应值（n＝6）

续表

表2 中心法则试验设计及其响应值

通过拟合得到一个描述响应值与自变量关系的多元回归模型，如公式（1）所示。模型的P－value值为0.0041，该值远远小于0.05，表明回归方程的F检验显著，所获得的模型能够准确地反映破胶酶的发酵生产情况。

油气成藏理论与勘探开发技术（五）

由响应面回归分析和回归方程拟合绘制酶产量与碳源、有机氮源和无机氮源的响应面，如图1所示。

图1 碳源、有机氮源和无机氮源对破胶酶产量影响的响应面

通过该模型计算出响应值（酶产量）对因素A、B、C存在极值点，对Y进行极值分析，确定3个因子最优试验点（A、B、C）的代码值（0.57、0.25、0.41），即碳源浓度为4.08g/L，有机氮源和无机氮源浓度分别为11.74g/L和5.22g/L时，该模型预测的破胶酶产量存在极大值，通过实验验证实际酶产量为239U/mL。

1.4 破胶酶的分离、纯化和保存

破胶酶发酵结束后，将发酵液在转速5000～10000rpm情况下离心30min去除菌体，并用0.22μm滤除去残余菌体和不溶物质，将获得的粗酶液经琼脂糖层析柱（20mm×250mm）洗脱：层析柱以pH＝7.3的Tris－HCl缓冲液平衡后以0.5～1.5mol的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速率为5～15mL/h，收集酶液并用饱和硫酸铵溶液沉淀，将获得的破胶酶由缓冲液稀释至200～400U/mL后低温保存［10］。用于压裂液破胶酶保存的缓冲液组成为：0.1M的pH＝7.2的磷酸缓冲液，杀菌剂50×10－6，甘油50％。

2 生物破胶酶稳定性研究

由于生物破胶酶使用过程中要面临油藏复杂的物理化学条件，同时其破胶活性还会受到压裂液体系中其他助剂的影响，因此，本研究中考察了各种物理化学因素（温度、pH、地层离子和化学助剂等）对生物破胶酶活力的影响。

2.1 温度和pH因素对酶活力保持率的影响

首先，研究温度和pH因素对生物酶活力保持情况的影响，酶活力保持率如图2所示，实验结果表明：生物破胶酶在中低温条件下有良好的热稳定性，在低于50℃的环境中温浴6h后，其酶活力保持率能达到85％以上，而超过50℃后，酶活力保持率随温度升高开始下降，70℃时，温浴后的酶活力仅为初始值的35％；生物破胶酶在非极端pH环境中（pH ＝5.0～9.0）能较好地维持其活性，而超出这一pH值范围后，酶活力保持率会迅速下降。

图2 温度和pH因素对酶活力保持率的影响

2.2 地层离子和化学助剂对酶活力保持率的影响

本文还对地层离子和化学助剂对生物酶活力保持情况的影响进行了研究，如表3所示。实验结果表明：地层水中的主要无机离子对破胶酶活力无明显影响；而压裂体系中的常规助剂对酶活力的保持有一定影响，本实验中，生物破胶酶在含有EDTA、杀菌剂和交联剂的溶液中温浴6h后，酶活力的保持率分别为81％、76％和94％。现场的压裂液体系非常复杂，因此，在实际应用中，有必要对各种助剂组分对生物酶活性的影响进行预实验。

表3 地层离子和化学助剂对酶活力保持率的影响

3 生物破胶酶的破胶性能研究

3.1 生物酶破胶降黏性能研究

针对中、低温储层的特点，本实验中所使用的压裂液配方为0.35％羟丙基胍胶、6％交联剂（1.0％硼砂溶液）、1.0％黏土稳定剂、0.5％杀菌剂，pH ＝8.5，生物破胶酶的添加浓度为20U/L。本文研究了不同温度下（20～80℃）的破胶效果，压裂液的降黏效果如图3所示，在40℃和50℃下反应10h后，破胶后的胶液黏度仅为2.23cP和1.97cP，而在30℃和60℃时，破胶后的胶液黏度分别为11.1cP和4.65cP。在破胶反应30min时，压裂液尚保持较高的黏度，维持了较好的携砂能力。可见，本研究中的生物破胶酶，完全可以满足中、低温油藏压裂施工的作业要求。

3.2 物理模拟破胶岩心伤害实验

当压裂液返排时，由于破胶不彻底往往留下很多残渣（固体不溶物），降低裂缝的导流能力。在室内应用物理模拟实验，制作人工胶结岩心模型（10cm×2.5cm）模拟水力压裂伤害过程，50℃恒温箱中，驱替人工配制的模拟地层水并计算模型的原始渗透率；将模型饱和含有20U/L破胶酶的压裂液液，关闭驱替系统，并在恒温箱中进行破胶反应12h；反应结束后，以模拟地层水进行反向驱替，计算返排后的模型渗透率（驱替至压力恒定），并以未添加破胶酶（APS破胶）的实验组作为对照模拟地层伤害实验，并计算伤害率［11］。

图3 不同温度下破胶酶的破胶效果

表4 地层伤害实验

从表4的结果不难看出，相比空白对照，生物破胶酶的加入可以有效实现压裂液破胶降黏，由于生物酶的破胶作用彻底，实验岩心并未观察到显著的地层伤害（伤害率仅为11.37％），远低于对照组30.67％的伤害率，体现了生物酶破胶剂在中、低温油藏压裂施工作业中的良好应用前景。

4 结论

本研究采用响应面优化法获得了影响地衣芽孢杆菌BG1菌株发酵生产生物破胶酶的培养基组成中的显著因素，并通过建立多项数学模型，采用统计分析对模型进行显著性检验来优化发酵培养基。优化得到的最佳培养基组成为：4.08g/L碳源，11.74g/L有机氮源，5.22g/L无机氮源，2g/L磷源，1.0g/L硫源，0.05g/L微量元素。在优化的条件下，地衣芽孢杆菌BG1菌株的生物破胶酶活力达239U/L，表明采用响应面法优化发酵培养基组成是提高菌株产酶活性的有效途径之一，从而为该技术的推广奠定了较好的基础。该菌株产生的生物酶具有良好的稳定性，能够较好地耐受中低温和非极端pH环境，并较好耐受各种无机离子和化学助剂。通过对其破胶性能进行研究，发现该破胶酶能够有效降低压裂液黏度，破胶彻底，对地层伤害小，因此，本研究的研究成果在中、低温油藏压裂施工作业中有着良好的应用前景。

致谢 本研究工作是在中国石化前瞻性项目 “微生物降解压裂残渣和重烃研究” 资助下完成的。在研究中，李宗田教授，中国石化石油勘探开发研究院采油工程研究所苏建政所长和苏长明高级专家都给予了宝贵的指导和建议，对他们表示衷心的感谢。

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浅谈蛋白质折叠的有关问题 [关键字]生物 大分子 分子伴侣 蛋白质的折叠 识别 结合 生物大分子的结构与功能的研究是了解分子水平的先象的基础。没有对生物大分子的结构与功能的认识，就没有分子生物学。正如没有DNA双螺旋结构的发现，就没有遗传传达传递的中心法则，也就没有今天的分子生物学。结构分子以由第一分子进入对复和物乃至多亚基，多分子复和体结构研究。同时，过去难以研究的分子水平上的生命运动情况也随着研究的深入和技术手段的发展而逐渐由难点变为热点。蛋白质晶体学研究已从生物大分子静态（时间统计）的结构分析开始进入动态（时间分辨）的结构分析及动力学分析。第十三届国际生物物理大会的25个专题讨论会中有一半以上涉及蛋白质的结构与功能，而“结构与功能”又强调“动力学（Dynamics）”，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系，以及对大分子相互作用的贡献。 蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其功能，是极富挑战性的工作。研究蛋白质折叠，尤其是折叠早期过程，即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐明中心法则的一个根本问题，在这一领域中，近年来的新发现对新生肽段能够自发进行折叠的传统概念做了根本的修正。这其中，X射线晶体衍射和各种波谱技术以及电子显微镜技术等发挥了极其重要的作用。第十三届国际生物物理大会上，Nobel奖获得者Ernst在报告中强调指出，NMR用于研究蛋白质的一个主要优点在于它能极为详细的研究蛋白质分子的动力学，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系。目前的NMR技术已经能够在秒到皮秒的时间域上观察蛋白质结构的运动过程，其中包括主链和侧链的运动，以及在各种不同的温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程。蛋白质大分子的结构分析也不仅仅只是解出某个具体的结构，而是更加关注结构的涨落和运动。例如，运输小分子的酶和蛋白质通常存在着两种构象，结合配体的和未结合配体的。一种构象内的结构涨落是构象转变所必需的前奏，因此需要把光谱学，波谱学和X射线结构分析结合起来研究结构涨落的平衡，构象改变和改变过程中形成的多种中间态，又如，为了了解蛋白质是如何折叠的，就必须知道折叠时几个基本过程的时间尺度和机制，包括二级结构（螺旋和折叠）的形成，卷曲，长程相互作用以及未折叠肽段的全面崩溃。多种技术用于研究次过程，如快速核磁共振，快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色）。 一、新生肽段折叠研究中的新观点 长期以来关于蛋白质折叠，形成了自组装（self-assembly）的主导学说，因此，在研究新生肽段的折叠时，就很自然的把在体外蛋白质折叠研究中得到的规律推广到体内，用变性蛋白的复性作为新生肽段折叠的模型，并认为细胞中新合成的多肽链，不需要别的分子的帮助，不需要额外能量的补充，就应该能够自发的折叠而形成它的功能状态。 1988年，邹承鲁明确指出，新生肽段的折叠在合成早期业已开始，而不是合成完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行构象的调整，先形成的结构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合成的结构又会影响前面已形成的结构的调整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。九十年代一类具有新的生物功能的蛋白，分子伴侣（Molecularchaperone）的发现，以及在更广泛意义上说的帮助蛋白质折叠的辅助蛋白(Accessoryprotein)的提出，说明细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。 二、蛋白质分子的折叠和分子伴侣的作用 蛋白质分子的三维结构，除了共价的肽键和二硫键，还靠大量极其复杂的弱次级键共同作用。因此新生肽段在一边合成一边折叠过程中有可能暂时形成在最终成熟蛋白中不存在不该有的结构，他们常常是一些疏水表面，它们之间很可能发生本不应该有的错误的相互作用而形成的非功能的分子，甚至造成分子的聚集和沉淀。按照自组装学说，每一步折叠都是正确的，充分的，必要的。实际上折叠过程是一个正确途径和错误途径相互竞争的过程，为了提高蛋白质生物合成的效率的，应该有帮助正确途径的竞争机制，分子伴侣就是这样通过进化应运而生的。它们的功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构的，与之结合，生成复和物，从而防止这些表面之间过早的相互作用，阻止不正确的非功能的折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，这样必然促进折叠向正确方向进行。（从哲学的观点说，似乎很容易驳斥自组装学说，它违背了矛盾的普遍性原理，试想，如果蛋白质的每一步折叠均是正确的，充分的，必要的，岂不是在无任何矛盾的前提下，完成了复杂的最稳定构象的形成，即完成了由量变到质变的伟大飞跃，从无活性的肽链变成有活性的功能蛋白，这显然是违背哲学基本原理的。换一个角度想，生物进化的过程本来就充满着不定向的变异，这些变异中有适应环境的，也有不适应环境的，“物竞天择”，自然的选择淘汰了那些不适应的，保留了那些适应的。蛋白质分子的折叠不也与此类似吗？我想，蛋白质的一级结构只是肽链折叠并形成功能蛋白的特定三维结构的内因，实际上，多肽链在形成活性蛋白的每一步，都有潜在的可能形成“不正确”的折叠，如果没有象分子伴侣或其它帮助蛋白等外部因素的作用，多肽链也永远不能折叠成为活性蛋百。） 三，分子伴侣的作用机制 分子伴侣的作用机制实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。有的分子伴侣具高度专一性，如一些分子内分子伴侣，还有细菌Pseudomonascepacia的酯酶，有它自己的“私有分子伴侣”。它是由基因limA编码的，与酯酶的基因LipA只隔3个碱基，可能是进化过程中发生的基因分裂造成的。而一般的分子伴侣识别特异性不高，它是怎样识别需要它帮助的对象的呢？现在只能说分子伴侣识别非天然构象，而不去理会天然的构象。由于在天然分子中，疏水残基多半位于分子的内部而形成疏水核，去折叠后就可能暴露出来，或者在新生肽段的折叠过程中，会暂时形成在天然构象中本应该存在于分子内部的疏水表面，因此认为分子伴侣最有可能是与疏水表面相结合，如硫氰酸酶（Rhodanese）分子α-helix的疏水侧面。但是只有β-sheet结构的蛋白质才可为分子伴侣识别。 最近关于识别机制有较大的进展。Bip是内质网管腔内的分子伴侣，用一种affinitypanning的方法检查Bip与有随机序列的十二肽结合的特异性，结果发现，Hy-(W/X)-Hy-X-Hy-X-Hymotif与Bipj结合最强，Hy最多的是Trp、Leu、Phe，即较大的疏水残基。一般来说，2-4个疏水残基就足够进行结合。还有一种较普遍的说法是分子伴侣识别所谓熔球体结构（moltenglobule）。另一方面，分子伴侣本身与肽结合部位的结构分析最近也有些进展。譬如，PapD的晶体结构表明，多肽结合在它的β-sheet区。GroEL中，约40kD的153-531结构域是核苷酸的结合区。 分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形成复合物。非常盛行的一种模型认为分子伴侣常常以多聚`体形式而形成中心空洞的结构，用电子显微镜已经观察到由二圈层圆面包圈形组成的十四体GroEL分子和一个一层圆面包圈的七体GroES分子协同作用形成中空的非对称笼状结构（cagemodel），推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。但是不久前一个日本实验室发现GroEL的一个亚基，甚至其N端去除78个氨基酸残基的50kD片段，已经不能再组装成十四体结构，都有确定的分子伴侣功能。由此，我想:也许环状分子伴侣并非每个部位都是有效的结合部位，也就是说，该二层圆面包圈组成的十四体GroEL分子只有一个或若干个部位能够与疏水残基或所谓的熔球体结构结合，而其余部位起识别作用，就像一个探测器一样，整个十四体GroEL分子以圈层或笼状结构”包裹”在多肽链的主链上，以旋进方式再多肽链的链体上运动，一旦环状多聚体的某一识别部位发现疏水结构或所谓的熔球体结构等新生肽链折叠过程中暂时暴露的错误结构，经信号转导，多聚体的结合部位便与之结合，生成复合物，抑制不正确的折叠。以上完全是我个人的猜想，是基于上述两个试验现象的矛盾而试图作一番解释。至于为什么假设以旋进方式在多肽链上运动，我并没有相应的根据，只是觉得这应该是一个动态过程，因此作了一番狂妄的假想,另外，我觉得也许可以用X射线衍射来探测一下分子伴侣GroEL和GroES组成的笼状结构，看看它的a×b×c是否足以容纳多肽链的某一段，或者它的内部和外部的疏水性质和其他一些物化性质如何，也许可以找到支持或驳斥上述假设的证据。 以上谈的都是蛋白质的分子伴侣。不久前又出现了一个新名词“DNAchaperones”，DNA分子伴侣，这种分子伴侣是与DNA相结合并帮助DNA折叠的。在这种复合物中，DNA分子包围在蛋白质分子的表面，既是高度有序的，又是在一定程度上结构已有所改变的。DNA与蛋白的这种相互作用对DNA的转录，复制以及重组都十分重要;或如在核小体中，对DNA的包装是必须的。DNA在溶液中的结构有相当的刚性，必须克服一个能障才能转变成它的蛋白复合物中的结构，分子伴侣的作用就是帮助DNA分子进行折叠和扭曲，从而把DNA稳定在一个适合于和蛋白结构的特定构型中。这种结合是协同的，可逆的在形成复合物之后便解离下来。因此，不论是DNA分子伴侣还是蛋白分子伴侣，都与DNA和蛋白的相互作用有关，与基因调控有关，看来，分子伴侣确实与最终阐明中心法则当前主要问题有密切关系。 四、分子伴侣和酶的区别 与分子伴侣不同，以确定为帮助蛋白质折叠的酶目前只有两个，一个是蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase，PDI);另一个是肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase，PPI)。以PDI为例，众所周知，蛋白质分子中的二硫键与新生肽段的折叠密切相关，对维系蛋白质分子的结构稳定性和功能发挥也有重要作用。PDI定位在内质网管腔内，含量丰富，催化蛋白质分子内巯基与二硫键之间的交换反应。同时，它是目前发现的最为突出的多功能蛋白，除了二硫键的异构酶的基本功能外，它还是脯氨酸-4-羟化酶的α亚基;又是微粒体内甘油三酯转移蛋白复合物的小亚基，还是一种糖基化位点结合蛋白(gkycisylationsitebindingprotein)等。其中，最引人注目的还是它有与多肽结合的能力，可以结合具有不同序列，长度和电荷分布的肽，特异性较低，主要是与肽的主链相作用，但对巯基尚有一些偏爱。按照分子伴侣的定义，一般认为PDI和分子伴侣是两类不同的帮助蛋白，但是我国上海生物物理研究所最近提出不同的看法，认为蛋白质二硫键异构酶也具有分子伴侣的功能。 蛋白质分子中天然二硫键的形成要求这些在肽链上往往处于不相邻位置的巯基，首先通过肽链一定程度的折叠，才能相互接近到可以正确形成二硫键的位置。肽链的自身折叠是一个慢过程，而蛋白质二硫键异构酶催化蛋白质天然二硫键的形成却是一个快过程。另一方面，蛋白质二硫键异构酶具有低特异性的与各种不同肽链相结合的能力，在内质网中以极高的浓度存在，又是是一个钙结合蛋白，是一个能被磷酸化的蛋白，这些都已经符合了分子伴侣的条件。因此他们推测蛋白质二硫键异构酶很可能首先通过它与伸展的，或部分折叠的肽段的结合，阻止错误的折叠途径，促进正确的中间物生成，帮助肽链折叠是相应的巯基配对，从而是正确的二硫键得以形成;然后催化巯基的氧化或二硫键的异构而形成天然二硫键。他们认为蛋白质二硫键异构酶的酶活性与它的分子伴侣功能不是相互排斥，而是密切相关，协调统一的。分子伴侣与帮助新生肽链折叠的酶之间，大概不应该，也不能够划一条绝对的分界线。我想:酶的最主要特性就是催化生化反应，分子伴侣的主要作用是与新生肽段的错误构象结合，从而阻止肽链不正确的非功能的折叠途径，促使其向正确的折叠方向反应，这难道不可以理解成间接的催化肽链的折叠吗?从表观上看，抑制不正确的折叠途径等于加快了正确反应的速度。所以，我本人也很赞成他们的观点。最近的试验已经为这一假说提供了很好的证据。PDI明显抑制变性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶在复性股过程中的严重聚合，有效的提高它的复性效率，与典型的分子伴侣GroE系统对甘油醛3-磷酸脱氢酶复性的效应极其相似。 五、分子伴侣的结构 目前唯一解出晶体结构的分子伴侣是E.coli的PapD，帮助鞭毛蛋白折叠的分子伴侣。还有HSP70的N端结构域，即ATP结合域也以有晶体结构。用电子显微镜已经清楚的看到了GroEL的十四聚体和GroEL的七聚体的四级结构，象两个圆形中空的面包圈叠在一起，用NMR以及各种溶液构象变化是研究分子伴侣作用机制的有效手段。 六、分子伴侣研究的实际应用 分子伴侣的研究成果必然会大大加深我们对生命现象的认识，同时也一定会增加我们与自然斗争的能力和自身生存的能力。由于分子伴侣在生命活动的各个层次都具有重要作用，它的突变和损伤也必定会引起疾病，因此可以期望运用分子伴侣的知识来治疗所谓的”分子伴侣病”。另一方面，利用对分子伴侣的研究成果从根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率，也必将对大幅度提高人类生活水平起重要作用。 [参考书目] 1.李宝健主编，面向21世纪生命科学发展前沿，广东科技出版社，1996年11月第一版：93-104页 2．郝柏林刘寄星主编，理论物理与生命科学，上海科学技术出版社，1997年12月第一版：29-58页 3．中国生物物理代表团，从第十三届国际生物物理大会看生物物理学研究的现状和趋势，生物物理学报，1999年第十五卷第四期：826-827页