碱性磷酸酶的研究发展论文

改良碱性磷酸酶染色法[日期：2008-08-11] 来源： 作者：乔海兵，邢开宇 【关键词】 碱性磷酸酶染色法 1939年Gomori首次提出碱性磷酸酶组织化学染色法用于哺乳动物神经系统血管内皮，1951年Gomori修改了自已的 方法 ，并称为“钙钴法”。1984年Bell在Gomori碱性磷酸酶染色法的基础上进行了改良，用于人脑海马和距状裂区的毛细血管取得成功〔1〕。本文以Bell法为基础，对其法的某些步骤进行了简化和改良， 应用 于脑微血管的 研究 ，同时可以显示出脑微动脉、微静脉。现将此法介绍如下。 1 原理 此方法为金属阳离子沉淀法。以β甘油磷酸钠为底物，在酶的作用下，产生磷酸离子与钙离子形成磷酸钙为第一反应产物。经硝酸铅处理变为磷酸铅沉淀，为第二反应产物。两种反应产物均易解离，进一步用稀硫化铵处理，形成稳定的硫化铅颗粒，沉淀于微血管内皮中，光镜下呈黑色〔2〕。 2 方法 2.1 取材 标本在24 h内取出,切成2 cm×2 cm×2 cm的组织块，放入4 ℃冰箱中保存。尽快放入固定液中固定24 h以上。 新鲜固定液的配制：无水氯化钙 5 g；巴比妥纳 2.5 g；纯甲醛液 5 ml；蒸馏水 488 ml。 2.2 脱水 组织固定好之后，移入70％的酒精24 h，依次移入85％酒精4 h，无水酒精，丙酮(1∶1)溶液4 h，无水酒精,乙醚(1∶1)溶液中4 h。 2.3 包埋 将脱水之后的组织块修整，移入5％的火棉胶溶液中浸泡包埋，放入4 ℃冰箱中，1周后可成块。 2.4 切片 切片厚度在60 μm左右，置入75％酒精中。 2.5 孵化 将切片放入孵化液中，在37 ℃恒温箱内孵化2 h～4 h。孵化液的配制：β甘油磷酸钠1.2 g;无水氯化钙1.96 g;巴比妥钠1 g;蒸馏水200 ml。 2.6 染色 将孵化好的切片快速更换3次蒸馏水，马上置入1.5％硝酸铅溶液中5 min，快速更换3次蒸馏水，然后放入2％硫化铵溶液中3 min，再快速更换3次蒸馏水。 2.7 裱片、脱水、封片 裱片后脱水，二甲苯透明封片。 3 改良措施 取材要新鲜，以免降低血管内皮碱性磷酸酶的活性。固定液和孵化液配好之后，可不调其pH值，只需用pH试纸测试固定液呈弱酸性，孵化液呈弱酸性即可。包埋过程中 应用 梯度包埋法，火棉胶浓度最高不能超过10％。先将组织块放入5％的火棉胶溶液中，留一小开口，置入4 ℃冰箱中，以利于酒精挥发，每天给容器加满火棉胶。2 d～3 d后改换10％的火棉胶，直至包埋好为止。包埋好的组织块应硬度适宜，用手指轻按可留有指纹，但不易碎。孵化过程适当延长，以利于内皮细胞碱性磷酸酶与孵化液充分反应。在裱片过程中由于切片较厚，切片很容易脱落。可采用先透明后封片的办法，既不 影响 切片的透明度，片子也不容易脱落。 4 讨论 碱性磷酸酶染色属于组化呈色法，由于此法对微血管显色均匀、充分，并可较好的反映正常微血管的 自然 扩张状态，有效地避免了血管灌注法的种种缺憾，而且此法经多次改良，使操作 方法 更为简单，呈色时间缩短，因而成为 目前 较为流行的一种微血管形态学的 研究 方法〔3〕。但Hunzlker等认为，由于小静脉内皮细胞碱性磷酸酶分布不集中，活性较低，因而微静脉难以显示。我们在研究过程中对碱性磷酸酶法进一步改良之后，可显示大量的带有三角形膨大的血管(见图1)，而这一特点正是微静脉所特有的，所以我们认为，并非微静脉用此法不能显示，而是在实验过程中pH值、温度掌握不准所致。 参考 文献 ： 〔1〕王有伟，陈以慈.碱性磷酸酶染色法(钙铅法)在研究人脑和心脏微血管方面的应用〔J〕.解剖学杂志，9(3)：227. 〔2〕杜卓民．实用组织学技术〔M〕.北京：人民卫生版社，1982：309. 〔3〕张为龙.脑血管研究近况〔J〕.临床解剖学杂志，1986，4：118.

在各级医学刊物以第一作者发表论文30篇（国家级20篇，省级10篇），基础研究5篇；全国及国际学术会议交流7篇，会议宣读2篇。1. 人TSHR氨基端原核表达载体的构建与鉴定，2005，11（2）168 《天津医科大学学报》2. 人TSHR羧原核表达载体的构建与鉴定，2005，33(增)：1 《天津医药》3. 人TSHR抗原决定簇的研究进展，2004，24(2)：116 《国外医学》内分泌学分册4. 丙基硫氧嘧啶致严重肝损害2例报道并文献回顾，2004，24 (12)：764 《中国实用内科杂志》5. 2型糖尿病患者治疗前后部分骨矿物质代谢指标变化，2004，24 (11)：998，《中国老年医学》6. 2型糖尿病患者血清骨钙素与碱性磷酸酶的相关性研究,《兰州大学学报》（医学版）,2006，32（6）：237. 2型糖尿病肾病与非肾病患者钙磷代谢特点的比较,兰州医学院学报,1999,25(2):36-37 2/18. 老年重症糖尿病合并甲状腺功能减退性心脏病51例回顾性分析,《中国老年医学》,2007,27（15）：15099. C反应蛋白在胰岛素抵抗中哦的作用及意义,国际内分泌代谢杂志,2008，28：1410. 2型糖尿病对骨和矿物质代谢的影响 国家核心，《临床荟萃》,2001，16（6）:27511. 人TSHR氨基端基因克隆及其在大肠杆菌的表达，大会发言 2005年，第七次全国核医学会议会议12. 人TSHR抗原决定簇的研究，大会发言 2005年8,第七次全国内分泌会议13. 促甲状腺素受体基因突变一个家系研究，《天津医药》，2005，33(4)14. 骨质疏松症治疗药依普黄酮，《国外医学》合成药生化药 制剂分,2000，Vol. 21 No.4 独著15. 植物雌激素与雌激素相关疾病，《国外医学》内分泌学分册,2000, Vol. 20 No.416. 金雀黄素抗癌作用的研究进展 ,《国外医学》肿瘤学分册,2000，Vol. 27 No.217. 异黄酮对骨质疏松的预防作用 ,《国外医学》老年医学分册2000，Vol. 21 No.118. Visfatin与糖尿病,国际内分泌代谢杂志,2008，28：1417. 白细胞介素-6受体基因多态性与内分泌疾病的关系,国际内分泌代谢杂志, 2007，27（1）：718. 促甲状腺素受体基因突变一个家系研究,天津医药,2005，33(4)：19. 先天性甲状腺功能减退症钠碘转运体基因突变研究,中华核医学杂志,2005 , 25（3）:16420. TSH受体基因突变致先天性甲状腺功能减退症一例及其家系分析中华内分泌代谢杂志,2006, 22（1）：4l21. 甲基强的松琥珀酸钠诱发过敏反应一例,《中华误诊学杂志》,2000，Vol.4 No.222. 特殊表现的嗜铬细胞瘤5例,《中华误诊学杂志》,2000年10月Vol.4 No.1923. 全反式维甲酸治疗急性粒细胞性白血病一例 省级 1990年 兰州医学院学报24。 急性浆细胞性白血病一例 省级 1991年 甘肃医药