文章发表图凋亡

前期文章：

在上一篇文章中我们解读了，CRISPR-Cas9基因编辑诱导DSB（DNA双链断裂）并最终导致人多功能干细胞死亡的内容。其中最关键的是 Cas9造成的DSB，激发野生型P53反应，P53激活后将细胞引入凋亡之路 。话不多说，直接看下图：

想象一下这个过程：

（1）一个 sgRNA-Cas9复合体 在细胞核内游走， Cas9蛋白在DNA序列上快速的扫描PAM序列 ，合适的停顿一会儿，DNA解链， sgRNA尝试互补配对 。配对失败，此处不留爷自有留爷处！匹配成功，请看下一点。

（2）Cas9识别到NGG的PAM序列后， sgRNA配对成功，Cas9蛋白切割PAM序列下游第三个碱基处 （说是这么说，总也有切偏的时候）， 产生DNA双链断裂（DSB） 。

（3） DSB发生在WT-P53（野生型P53）的细胞中 ，P53激活诱导该细胞走向：周期阻滞、衰老甚至凋亡。由于人多功能干细胞对DSB十分敏感，其P53反应也十分激烈，容易走向凋亡。这就是上一篇文章的主要发现。

（4）而当 DSB发生在mutant-P53（突变型P53）的细胞中 时，也有几种情况：（A）该细胞有 双链P53突变 ，则毋庸置疑， P53功能缺失，不再诱导凋亡，细胞得以存活 ；（B）该细胞有一条链为WT-P53，另一条链为mutant-P53，当这个细胞足够倒霉的时候，它的 mutant-P53链产生的mutant-P53蛋白，不仅自己不起功能，还反而抑制另外一条WT-P53起作用 ！简直坏透了！此时无论如何，细胞仍然不会有正常的P53反应，细胞得以存活，且这些 mutant-P53可能会继续传递给后代 ，mutant细胞群不断壮大！

综上所述，显而易见， CRISPR-Cas9技术俨然成为一个筛选mutant-P53细胞的筛选因子 。长此以往，mutant-P53群落越来越大。P53自己突变就算了，关键是当其他的DNA损伤或者基因突变发生时， P53不再执行其“基因卫士”的功能，使得这些DNA损伤或者突变得以传递给后代，当DNA突变积累足够多/巧的时候，肿瘤可能会发生 。这就是CRISPR-Cas9技术应用的风险。想想有了前面那样一篇文章，那么后面这篇文章的出现是不是可以理解。

文章发表在2020年的 Nature Genetics 杂志

经过2018年 Nature Medicine 的文章，该文就是 明确指出DSB激活P53信号 ，同时他们做的 P53 mutant pool在CRISPR-Cas9编辑中能存活 ，也指示CRISPR-Cas9的mutant-P53富集作用。 是不是别人无法再做类似甚至相同的内容了呢？但这篇文章又缘何可以发这么高分？

背景： Cas9通常被投入到细胞系中，以实现CRISPR-Cas9介导的基因组编辑。 问题： Cas9表达本身所造成的后果未知。（个人思考：角度非常好，Cas9其实作为一种外源蛋白是否会引起免疫反应？Cas9是否会不依赖sgRNA直接切割，就如同一些核酸内切酶的星号活性一样？）

目的： 研究Cas9表达本身是否会引起基因组或者转录组的变化，其后果如何

补充背景： 中性基因编辑/操作（人为而非自然选择）可导致细胞系的遗传和转录多样化。例如人为的过表达或者敲除某些基因都会改变细胞系的遗传和转录多样化。然而，目前还不清楚引入特定的“中性”基因是否会对特地基因进行富集或筛选。尤其是Cas9这样常常使用的工具蛋白。

L1000测序+GSEA分析（如下图）： 首先作者找到了165对Cas9过表达细胞及其亲本细胞，分别进行L1000测序。L1000测序即对987个landmark基因进行测序，以推测余下11350个基因的表达（就是测重要基因表达）。这里的技术重复不是我们在RNA-seq中常见到的3个，而是高达16个。经由L1000测序后发现有87个差异基因且差异在2倍以上，经由GSEA分析对比。证明Cas9过表达本身对遗传背景有扰动。

数据分析（如下图） ：（1）左图c表示， P53 WT细胞上，可见Cas9过表达细胞群有P53相关基因上调 。而在P53 mutant组，Cas9组和对照组的P53相关基因无差别（自然了，都突变了还能有下游基因变化么）。（2）右图g表示，在40个P53 WT的细胞中，有相当一部分细胞在Cas9过表达后表现出P53相关激活基因富集的现象。因此， Cas9激活P53得到了直接证据，同时Cas9激活P53这个现象大部分发生在P53 WT组上 。原文中有相应的统计表格可查。

注意：这里仅仅是列举了部分代表性结果，作者还做了P53、P21的WB、PCR验证，同时还测试通过免疫荧光提供了Cas9诱导DNA损伤的证据。

基于上述结果：P53WT组，Cas9导致--细胞DNA损伤--P53激活--细胞生长被抑制、死亡。那Cas9相当于变相的筛选富集P53 mutant细胞。

Deep (283×) targeted exon sequencing for 447 cancer genes ：于是作者找到4 2对P53WT状态 的细胞及其Cas9过表达株，对这些细胞进行447个癌症相关基因的深度测序。经分析后发现 Cas9过表达细胞相对于WT细胞有更多的非同义突变 （下图a）。同时突变累积TOP3为：SETBP1（与DNA复制相关）、SLC25A13（线粒体载体家族基因）以及TP53基因。 这里有一个疑问，TP53不是Top1呀，为啥不研究Top1呢？注意后文有回答 。

补充背景： 深度测序是指对一个基因组区域进行多次测序，深度可达数百次甚至数千次。这种测序可检测到只占原始样本1%的罕见克隆类型、细胞或微生物。深度测序对癌症、微生物学和其他涉及 罕见细胞群分析 的研究很有帮助。例如，深度测序可识别肿瘤中的突变，因为在癌症样本中通常包含有许多正常细胞，且肿瘤本身可能包含多种亚克隆。因此 本文选用深度测序，可识别到微量的基因突变，从而区分不同基因突变的亚群 。

从深度测序结果来看，不止TP53突变在Cas9过表达株中富集。那么Cas9富集基因突变细胞是没有bias还是特定富集TP53突变。为了解决这个问题，作者设计了以下实验：

细胞竞争实验 ：作者将TP53 -null细胞用GFP标记，将P 53-null细胞和WT-P53细胞按照1:6混匀 ，并分组处理：（1）无处理组NIC；（2）空载组EV；（3）Cas9过表达组Cas9。经分组处理后使用流式细胞仪检测GFP细胞占比变化，如下图b所示， Cas9组的TP53-null细胞在14,21天培养后群体壮大，而ARID1A-null、FBXW7-null细胞则没有变化 （下图c）。因此 Cas9只特异性富集TP53突变细胞 ，于是回答了中我们提到的问题。

以上是本文的主要内容，当然后续作者还对CRISPR-Cas9导致TP53突变富集的机制进行了研究和分析，说是在TP53-WT细胞中，cas9诱导的DNA损伤增加了对功能性DNA修复机制的依赖，也做了一系列实验验证，感兴趣的小伙伴需要回原文查看。最后该文提供了一个使用Cas9进行研究的工作流程图，我想这是该文的另一精髓：

（1）首先思考使用的Cas9过表达细胞是否有是WT-P53。如果不是，则无需太但又P53对功能实验的影响；如果是，则需要检查P53通路的激活状态，可选用WB, RT-qPCR试验等。

（2）若Cas9细胞有一定的P53通路激活，则：在后续实验中考虑p53活性的基础水平；尽量避免过多传代Cas9细胞，以免TP53 mutant细胞富集。

（3）即使Cas9细胞有P53活性基础水平，但仍需是否混有TP53 失落亚型细胞：可通过DNA测序鉴定。

（4）鉴定Cas9过表达细胞株的DNA损伤水平，在后续实验中监控DNA损伤水平的变化，定期检测TP53突变状态。

这篇文章使用了多种测序技术，实验设计巧妙，虽不多但都在刀刃上，是一篇很好的干湿结合文章，值得一读，且文末讨论简洁而精彩。 上文讲的是CRISPR-Cas9诱导DSB导致细胞死亡，这篇讲的是CRISPR-Cas9无法使得TP53 mutant细胞死亡，简直是天生一对 。那么 CRISPR-Cas9是依赖DNA修复的技术 ，TP53是DNA修复的上游信号，是否CRISPR-Cas9对DNA修复功能也有影响呢？下一次， 我们将解读一篇关于CRISPR-Cas9技术应用中，TP53状态和DNA修复之间的纠缠 。

TP53是一个热门IP，过了这么多年仍然有大量的好文章发表，关于TP53和CRISPR-Cas9之间关系的好文章不仅仅这两篇，我们希望能在这段时间把这类型的经典文章读一遍，加深我们对CRISPR-Cas9技术的理解。感谢大家阅读，再次期盼反馈交流！

Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19

影响因子： ： 32788748 期刊年卷：Nat Immunol 2020 09;219(9) 医学一区 免疫学 Q1 3/155

DOI：

这篇文章和上一篇文章思路、设计、方法基本一致，甚至结论也有相似之处，通讯作者都是院士，但是为什么发的分值相差距大呢？除了文章发表先后顺序外，在样本量和数据分析方面做得更细致一些，亚群分析更细致一些，另外图表也比上一篇美观，这些问题都值得我们反思！

作者实施了单细胞RNA测序（scRNA-seq），观察了中度至重度症状的COVID-19患者外周血单核细胞（PBMC）的免疫反应。作者的研究描绘了COVID-19疾病发展过程中血液免疫细胞的高分辨率转录组图谱，这将有助于更好地了解该疾病的保护性和致病性免疫反应。

在由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染引起的冠状病毒疾病2019（COVID-19）中，疾病严重程度与宿主免疫反应之间的关系尚未完全了解。在这里，作者对5位健康供体和13位COVID-19患者（包括中度，重度和恢复期患者）的外周血样本进行了单细胞RNA测序。通过确定免疫细胞的转录谱，并结合组装的T细胞受体和B细胞受体序列，作者分析了免疫细胞的功能特性。COVID-19患者中的大多数细胞类型均表现出强烈的干扰素-α反应和整体急性炎症反应。此外，高度细胞毒性效应T细胞亚群如CD4+ effector-GNLY (granulysin), CD8+ effector-GNLY and NKT CD160与中度患者的康复有关。在重症患者中，免疫系统的特征是干扰素反应紊乱，免疫力衰竭，T细胞受体组成偏向，T细胞广泛扩散。这些发现说明了疾病进展过程中免疫反应的动态性质。

scRNA-seq（10X基因组学）研究了13例患者和5例健康供体（HD）的PBMC的转录组谱（图 1a ）。将13例COVID-19患者分为三种临床情况：中度（ n  = 7），重度（ n  = 4）和恢复期（conv； n  = 6，其中4例与中度病例配对）（图 1a， b ，还对每个受试者进行了单细胞T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）测序。经过统一的单细胞分析流程（请参阅 方法 ），从所有样本的PBMC中的122,542个细胞中获得了约6亿个独特的转录本。在这些细胞中，22,711个细胞（占％）来自HD，37,901个细胞（占％）来自中度状态，24,640个细胞（占％）来自严重状态，而37,290个细胞（占％来自恢复状态）状况。将所有高质量细胞整合到完整且可比较的数据集中，并在校正读取深度和线粒体读取计数后进行主成分分析（补充图 2a，b ）。

图1：HD和COVID-19患者的PBMC的研究设计和单细胞转录谱。

使用基于图的统一流形近似和投影聚类（UMAP），作者根据规范基因标记的表达捕获了14种主要细胞类型或亚型的转录组（图 1c-e 和补充图 2a，b ）。外周血中细胞亚群的组成

(naive-state T (naive T) cells (CD3+CCR7+), activated-state T (activated T) cells (CD3+PRF1+), mucosal-associated invariant T (MAIT) cells (SLC4A10+TRAV1-2+), γδ T cells (TRGV9+TRDV2+), proliferative T (pro T) cells (CD3+MKI67+), natural killer (NK) cells (KLRF1+), B cells (MS4A1+), plasma B cells (MZB1+), CD14+ monocytes (CD14+ mono; LYZ+CD14+), CD16+ monocytes (CD16+ mono; LYZ+FCGR3A+), monocyte-derived dendritic cells (mono DCs; CD1C+), plasmacytoid dendritic cells (pDCs; LILRA4+), platelets (PPBP+)

为了揭示三种情况（中度，重度和转化）中细胞组成的差异并与HDs进行比较，作者根据scRNA-seq数据计算了每个人的PBMC中14种主要细胞类型的相对百分比（图 2a–d ）。活化的T细胞簇的相对百分比在中度患者中达到峰值，甚至在恢复期也没有恢复到正常水平。值得注意的是，幼稚T细胞，MAIT细胞和单DC的相对丰度随着疾病的严重程度而降低，后来在conv患者中这些种群得以恢复（图 2d ）。相比之下，在conv患者中，pro T细胞，血浆B细胞，CD14 +mono和血小板的相对百分比随着疾病的严重程度而增加，后来又下降了。 2d ）。重症患者中CD14 + mono的大量增加是根据最近的一项研究表明，病原性T细胞诱导的炎性单核细胞在COVID-19中引发了炎性风暴（参考文献 22 ）。

图2：疾病状况的细胞组成差异。

接下来，为了研究SARS-CoV-2感染期间的抗病毒和病原体免疫反应，作者评估了两种重要途径的表达水平（基因本体论（GO）生物学过程术语：对干扰素（IFN）-α的反应和急性炎症反应）。跨四个条件的主要细胞类型。作者发现，在COVID-19患者的PBMC中，所有主要细胞类型中对IFN-α的反应均一且显著上调，并且在严重患者中，除血浆B细胞外，几乎所有主要细胞类型中对IFN-α的响应值均最高，其中中度患者的IFN-α反应最大（图 2e ）。另外，除pro T细胞外，急性炎症反应在所选细胞类型的各种条件下均表现出一致且显著的差异。几种细胞类型显示出与疾病严重程度大致对应的急性炎症反应趋势，包括活化的T细胞，γδT细胞，NK细胞和CD16 + mono（图 2e ）。此外，在严重患者中，血浆I型IFN，IFN-γ和其他炎性细胞因子水平最高（补充图 2c ）。这些结果表明，在COVID-19患者中有很强的总体促炎反应（图 2e ）。

为了进一步研究SARS-CoV-2感染后先天免疫细胞的转录组变化（图 3a，b ），作者比较了CD14 +和CD16 +单核细胞中度或重度条件与HD条件的表达模式。作者发现COVID-19患者的IFN反应，髓样白细胞活化，细胞因子产生和核因子（NF）-κB信号通路均涉及显著差异表达的基因（DEG）（图3c，d）。作者发现COVID-19患者的IFN反应，髓样白细胞活化，细胞因子产生和核因子（NF）-κB信号通路均涉及显著差异表达的基因（DEG）（图 3c，d ）。 此外，严重条件下单核细胞中更多的DEG富含分子代谢和分解代谢过程以及细胞因子分泌（补充图 3a ）。对于NK细胞，与单核细胞相似，与IFN反应，细胞因子产生，NF-κB信号通路和白细胞细胞毒性相关的DEGs在COVID-19患者中显著丰富（图 3e，f ），表明先天免疫细胞具有一致的反应感染SARS-CoV-2。此外，与中度患者相比，重症NK细胞的DEGs，例如 ITGB2， CCL5 和 CXCR2 ，与迁移相关的过程更为紧密相关（补充图 3b，c ）。

**图3：在四个条件下个体的先天免疫细胞的特征。 全尺寸图片

与DEG富集结果一致，作者发现SARS-CoV-2感染后单核细胞和NK细胞均显示出明显的IFN和急性炎症反应，特别是在严重患者中（图 2e ）。与HD条件相比，单核细胞和NK细胞中细胞凋亡和迁移的水平也被上调（图 3g ）。与单核细胞和NK细胞中相当的凋亡水平不同，重度患者的先天免疫细胞比中度患者更容易迁移（图 3g 和补充图 3c ）。这些结果表明，在患有COVID-19的患者中，大多数先天免疫细胞类型均表现出强烈的IFN反应。

为了表征个体在四种情况下个体T细胞亚群的变化，作者从PBMC中亚群化T细胞，并根据典型T细胞标志物的表达和分布获得12个亚群（图 4a，b ）：

CD4 + T细胞的6种亚型（CD3E + CD4+）， CD8 + T细胞的3种亚型（CD3E + CD8A +） NKT细胞的3种亚型（CD3E + CD4 – CD8A –TYROBP +）

图4：T细胞亚群的免疫学特征

源数据

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CD4 + T细胞簇的六个亚型 naive CD4+ (CD4+ naive) T cell (CCR7+SELL+), memory CD4+ (CD4+ memory) T cell (S100A4+GPR183+), effector memory CD4+ T cell (S100A4+GPR183+GZMA+) regulatory T (Treg) cell (FOXP3+IL2RA+) 亚型，

两种effector CD4 + T亚型： CD4+ effector-GZMK and CD4+ effector-GNLY。CD4+ effector-GNLY簇的特点是与细胞毒性，包括相关联的基因的高表达NKG7，GZMA，GZMB，GZMH和GNLY，而CD4+ effector-GZMK 簇显示出的高表达GZMK基因（图4b和补充图4a，b）。此外，CD4+ effector-GNLY细胞表现出高表达的TBX21，表明它们是1型辅助性T（T H1）样细胞（补充图4c）。相反，CD4+ effector-GZMK和effector memory CD4+ T cell具有高表达GATA3的2型辅助T（T H 2）细胞样特征（补充图4c）。

CD8 + T细胞簇的三个亚型

CD8+ (CD8+ naive) T cell subset (CCR7+SELL+) and two effector CD8+ T cell subsets (CD8+ effector-GZMK and CD8+ effector-GNLY)，它们都具有高表达的GZMA和NKG7。 CD8+ effector-GZMK独特表达GZMK，而CD8+ effector-GNLY显示出相对高的表达水平GZMB / H和GNLY（图4B和补充图4A，B）。

NKT细胞簇的三个亚型被定义为 NKT (NKT naive) cells (CCR7+SELL+), CD56+ NKT (NKT CD56)，CD160+ NKT (NKT CD160) （图 4a，b ）**。

为了深入了解T细胞亚群中的特征，作者评估了每个簇在四个条件下的分布（图 4c 和补充图 4d，e ）。值得注意的是，与HD相比，COVID-19患者的effector T cells （CD4+ naive, CD4+ memory, CD4+ effector memory, Treg, CD8+naive and NKT naive subsets）的比例下降（图 图4c 和补充图 4D ）。即使在转化条件下，CD4+ naive, CD8+ naive and Treg 的比例簇没有恢复到HD的水平（图 4c 和补充图 4d ）。相反，COVID-19患者的CD4+ effector-GNLY, CD8+ effector-GNLY, NKT CD56 and NKT CD160子集的活跃状态T细胞子集的比例增加，这些细胞毒性子集甚至以高比例存在在conv患者中（图 4c ）。特别要注意的是，HDs中几乎不存在CD4+ effector-GNLY 亚群，但在中度，重度和转化性患者中高度丰富。此外，与中度患者相比，重度患者的NKT CD160亚群的丰度显著降低。

然后，作者评估了在四种情况下不同效应子状态T细胞亚群的细胞毒性和衰竭评分（图 4d 和补充图 4f ）。CD4+ effector-GNLY, CD8+ effector-GNLY, NKT CD56 and NKT CD160子集显示出比其他子集更高的细胞毒性评分。在这些高度细胞毒性的簇中，HDs的细胞毒性评分最低，而中度状态则显示最高的细胞毒性状态，但CD4+ effector-GNLY亚群除外（图 4d，e 和补充图 4f ）。同时，CD4+ effector-GZMK, CD8+ effector-GZMK and NKT CD160 亚群显示出比其他亚组更高的疲劳评分。在这些精疲力竭的亚组中，HDs的精疲力竭评分最低，而重症患者表现为最精疲力竭状态（图 4d，e 和补充图 4f ），这与先前检查重症患者CD8 + T细胞的功能研究一致并发现疲惫不堪的状态和功能受损 23 。

为了进一步研究SARS-CoV-2感染后T细胞中差异转录组的变化，作者比较了中度或重度之间的效应T细胞（排除CD4+ naive, CD4+ memory, CD8+ naive and NKT naive）的表达谱。HD条件。作者观察到，在COVID-19患者中上调的DEG参与了以下过程，包括IFN反应，细胞因子产生，细胞杀伤，白细胞-细胞粘附和细胞骨架组织（图 4f，g 和补充图 4i ）。此外，使用凋亡和迁移评分系统，作者观察到严重患者的T细胞可能经历了迁移和凋亡（图 4h，i 和补充图 4g，h ）。在重症患者的PBMC中的细胞死亡和迁移途径的活化显著表明，细胞死亡和淋巴细胞迁移可以与淋巴细胞减少，在患者中观察到严重COVID-19的常见现象（参考文献相关联 18 ， 19 ， 24 ）。

接下来，为了深入了解各个T细胞之间的克隆关系以及在四个条件下V（D）J基因的使用，作者从TCR测序中重建了TCR序列（补充表 2 ）。简而言之，除了三个NKT子集外，所有子集中具有匹配的TCR信息的细胞超过70％（图 5a，b ）。首先，与HDs相比，COVID-19患者和恢复期患者的克隆扩增明显（图[5c–e]( ）。在中度和慢性条件下的克隆扩增程度高于严重条件下的克隆扩增程度。同时，在严重的情况下，没有大的克隆扩增（克隆大小> 100）（图 5e ），表明严重的患者可能缺乏效应T细胞的有效克隆扩增。作者观察到T细胞亚群之间不同程度的克隆扩增（图 5c，d ）。效应T细胞亚群CD4 +效应子GNLY，CD8 +效应子GZMK和CD8 +效应子GNLY表明克隆细胞（图的高比例 5a中，d 和补充图 5A ）和包含簇间克隆细胞的高比例（图 5f ），提示效应子T细胞经历了动态状态转变（图 5a，f ）。

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为了研究COVID-19和HD患者中TCR的动力学和基因偏好，作者比较了四种情况下V（D）J基因的使用情况（图 5g–i 和补充图 5b ）。在四个条件下，前10个互补决定区3（CDR3）序列不同（图 5h ）。中度和转化条件共享一些CDR3序列，因为来自这些条件的四个样本已配对。与其他三个条件相比，HD条件下前10个CDR3序列的使用百分比更低且更均衡。值得注意的是，作者发现在COVID-19患者中V（D）J基因的不同用法具有降低的多样性，这在 TRA 基因中更为明显（图 5i ）。作者还确定了 重度患者与中度和 慢性患者相比 TRAJ39 和 TRAJ43的 过度表达 （图 5g ）。 重症患者首选的TRBJ基因是TRBJ1-1，而中度和转化性患者首选TRBJ2-1（图 5i ）。 **V（D）J基因的选择性使用表明不同的免疫优势表位可能驱动T细胞反应的分子组成，并且可能与SARS-CoV-2特异性感染相关。

为了追踪不同B细胞亚型的动态变化，作者根据规范B细胞标志物的表达和分布将B细胞分为六个子集（图 6a，b 和补充图 6a ）。 naive B subset (MS4A1+IGHD+), memory B subset (MS4A1+CD27+), intermediate transition memory B subset (intermediate memory B; IGHD+CD27+), germinal center B subset (MS4A1+NEIL1+) and two plasma subsets, plasma B (MZB1+CD38+) and dividing plasma B (MZB1+CD38+MKI67+) .

图6：B细胞亚群的免疫学特征。 全尺寸图片

值得注意的是，与HD相比，COVID-19患者的活动状态B子集（germinal center B, plasma B and dividing plasma B subsets）的比例增加。相反，与HD患者相比，COVID-19患者的memory B cells比例下降（图 6c-e ）。

为了进一步研究SARS-CoV-2感染后B细胞的差异转录组变化，作者比较了中度或重度条件下HD的B/plasma cells的表达谱。在COVID-19患者中最丰富的DEG参与了与IFN反应相关的基因（图 6f，g 和补充图 6c ）。此外，重症患者中的DEG与蛋白质合成，成熟和运输相关的生物学过程有关（补充图 6b ）。这些结果揭示了COVID-19患者B细胞亚群的转录组特征。

作者还从BCR测序中重建了BCR序列（补充表 3 ），并分析了BCR克隆扩增的状态。简而言之，每个簇中BCR的检出率均超过75％（图 7a，b ）。作者发现来自重症患者的B细胞显示出比其他三种情况明显的克隆扩增（图 7c 和补充图 6d ），这表明重症患者的B细胞活性和体液免疫反应被强烈激活，这让人想起先前的观察较高的抗体滴度与更差的临床结果相关联 25 ， 26 ， 27 。这引起了这样一种担忧，即病原体导向的抗体可以促进疾病病理，导致抗体依赖性增强，类似于SARS 28 中观察到的增强。

图7：扩展的BCR克隆和V（D）J基因的选择性使用 全尺寸图片

接下来，作者分别评估了中度，重度和转化条件下每位患者中IgA，IgD，IgG和IgM的分布（未检测到IgE）。在大多数患者中，IgM是主要的免疫球蛋白（图 7d，e ）。**与HD相比，COVID-19患者的IgG含量增加，而IgM降低。在恢复期患者中，IgG和IgM的水平恢复到与HDs相似的水平。

为了研究BCR的偏向V（D）J重排，作者比较了四种条件下V（D）J基因的使用情况（图 7f，g 和补充图 6e ）。与其他三种情况相比，作者发现在重症患者中使用了更多的特定V（D）J，这表明重症患者的B细胞可能经历了独特而特定的V（D）J重排（图 7g ）。 作者还发现IHDJ4在所有HD和患者中得到了综合利用（图 7f ），但与其他三种情况下的患者相比，重症患者中IGHJ4的IGHV配对IGHV基因却有所不同（图 7g ） 。 作者观察到IGHV3-7的过度表达在严重患者中（图 7f ）。此外，重症患者中前两个配对的VJ频率为IGHV3-7 / IGHJ4和IGKV3-15 / IGKJ3（图 7g ）。 总体而言 ，严重患者的B细胞克隆性增加以及 IGHV 和 IGKJ 基因的偏斜使用表明SARS-CoV-2感染与宿主B细胞中的V（D）J重排有关。值得注意的是， 在重症患者中选择性使用显性IGV基因，尤其是IGHV3-7和IGKV3-15，可能有助于疫苗的设计。